脂联素基因在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化中表达水平变化的研究

目的:观察脂联素基因mRNA在3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化过程中表达水平的变化。方法:体外培养3T3-L1脂肪前体细胞,应用MIX、地塞米松、胰岛素诱导其分化,采用RT-PCR技术检测诱导分化不同时间(0～10天)脂肪细胞中脂联素基因mRNA的表达水平。结果:脂联素基因低表达于3T3-L1脂肪前体细胞中,并随脂肪前体细胞分化成熟,该基因表达水平呈逐渐上调趋势,除在诱导剂作用后第0天与第2天、第1～2天、第3～4天、第6天与第8～10天、第7～10天各时段内差异无显著性(P>0.05)外,其余各时段之间表达水平差异均有显著性(P<0.05)。结论:在3T3-L1脂肪前体细胞分化过程中脂联素基因表达逐渐上调,可能有利于脂肪细胞的分化成熟。     

Obestatin抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖与分化

目的:观察obestatin对3T3-L1前脂肪细胞增殖分化的影响.方法:应用不同浓度的obestatin (10-8 、10-9 、10-10、10-11、10-12 mmol/L)和10-10 mmol/L ghrelin干预体外培养的3T3-L1前脂肪细胞,MTT法观察其对细胞增殖的影响,并与空白对照组比较;分别应用10-10 mmol/L obestatin和ghrelin全程干预3T3-L1前脂肪细胞分化成熟过程(分化第1～10日),采用油红O染色法鉴定脂肪细胞分化并测定分化成熟脂肪细胞的脂肪含量,RT-PCR法检测分化过程中及成熟脂肪细胞过氧化物酶体增殖物激活受体γ2(PPARγ2) mRNA的表达水平,并与对照组(加常规诱导剂)比较.结果:与空白对照组相比,不同浓度obestatin组细胞数量均明显降低(P＜0.05);10-10mmol/L obestatin连续作用10 d的3T3-L1前脂肪细胞与对照组相比,脂肪产量明显减少(P＜0.05);脂肪细胞分化过程中PPARγ2基因表达逐渐增多;在成熟脂肪细胞中,与对照组相比,obestatin组PPARγ2基因表达显著降低(P＜0.05).Ghrelin的作用与之完全相反.结论:Obestatin抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖和分化.     

熊果酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型CAP表达的影响

目的：观察熊果酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗、摄取及细胞分化的影响,并探讨其作用机制。方法：将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为成熟脂肪细胞,用高糖、高胰岛素联合诱导胰岛素抵抗模型。使用葡萄糖氧化酶法检测3T3-L1细胞葡萄糖消耗量,氚标葡萄糖法检测其葡萄糖摄取量,以评价模型建立情况。用四唑盐（methylthiazolyltetrazolium,MTT）比色法检测不同浓度熊果酸对3T3-L1脂肪细胞活力的影响以确定实验药物浓度。加入不同浓度熊果酸分组干预,用氚标葡萄糖法检测脂肪细胞葡萄糖摄取量;用油红O色法检测3T3-L1脂肪细胞分化情况;用实时荧光定量聚合酶链反应法、蛋白质印迹法分别观察熊果酸对3T3-L1细胞胰岛素抵抗模型细胞分化相关蛋白脂肪细胞脂类结合蛋白、基质金属蛋白酶1和原癌基因Cbl相关蛋白（c-Cbl-associatedprotein,CAP）表达的影响。结果：在成功建立胰岛素抵抗模型的基础上,使用MTT法检测细胞活力。确定熊果酸的作用浓度在4～20μmol／L。与模型组相比,低、高剂量熊果酸组（10、20μmol／L）及罗格列酮组（5μmol／L．）葡萄糖摄取均明显升高（P〈0．01）;低、高剂量熊果酸组3T3-L1脂肪细胞分化程度低于对照组和罗格列酮组。熊果酸可明显上调3T3-I,1细胞胰岛素抵抗模型CAPmRNA及蛋白的表达（P〈0．01）。结论：熊果酸改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型糖代谢的同时可抑制其分化,这一机制可能与熊果酸上调脂肪细胞CAP的表达有关。     

蛋白酪氨酸磷酸酶1B在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中表达的变化

目的:观察在3T3-L1前脂肪细胞分化过程中蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)mRNA表达及其蛋白水平的变化,探讨PTP1B与脂肪细胞分化的关系.方法:体外培养3T3-L1前脂肪细胞,在3T3-L1前脂肪细胞分化成熟过程中(第1～10日),采用油红O染色及RT-PCR法检测过氧化物酶体增殖物活化受体γ2(PPARγ2)基因表达评价脂肪细胞分化成熟情况,RT-PCR法及Western印迹法检测脂肪细胞分化过程中PTP1B mRNA表达及其蛋白水平的变化.结果:随着脂肪细胞诱导分化逐步深入,油红O染色显示其中脂滴形成逐渐增多,至占全视野90%以上;同时PPARγ2基因表达逐步增多,均提示脂肪细胞分化逐步成熟,至最终分化为成熟脂肪细胞.PTP1B mRNA和蛋白水平在前脂肪细胞中表达较高,随着脂肪细胞的逐步成熟,其表达逐渐降低,至分化成熟时表达水平降至最低.结论:在3T3-L1前脂肪细胞分化成熟过程中,PTP1B mRNA及其蛋白表达水平逐渐减低,PTP1B可能参与了脂肪细胞分化.     

3T3-L1前脂肪细胞分化过程中miRNAs表达谱的变化

目的探讨3T3-L1前脂肪细胞分化过程中微小RNA(miRNAs)表达谱的变化。方法3T3-Ll前脂肪细胞培养和诱导分化,通过形态学观察和RT-PCR方法,判断3T3-Ll前脂肪细胞是否分化成脂肪细胞。运用miRNAs芯片技术检测3T3-Ll前脂肪细胞和脂肪细胞中差异表达miRNAs。结果3T3-L1前脂肪细胞呈现成纤维状,诱导分化的第9天,细胞变成球形,内含许多脂滴;过氧化物酶体增殖物激活受体r2(PPARr2)和脂肪性脂肪酸结合蛋白(aP2)的表达显著增加。3T3-L1前脂肪细胞分化成脂肪细胞上调的miRNAs有26个,下调的miRNAs有2个。结论3T3-L1前脂肪细胞分化过程中存在miRNAs表达谱的变化。     

Resistin基因在3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化过程中表达水平的变化

目的：观察Resistin基因在3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中不同时段表达水平的变化。探讨Resistin基因与脂肪细胞分化、脂质积聚之间的关系。方法：体外培养3T3-L1前体脂肪细胞，在诱导其向成熟脂肪细胞分化的不同时段（第0～10天）．采用RT-PCR技术检测脂肪细胞中Resistin基因mRNA的表达水平。结果：①Resistin基因在3T3-L1前体脂肪细胞诱导分化初期（第0～2天）不表达，分化第3天开始表达，分化第4～6天Resistin基因的表达显著上调，分化第6～10天Resistin基因的表达保持在较高水平并趋于稳定；②Resistin基因的表达水平除在诱导分化第3～4天、第6～10天内差异无显著性（P〉0．05）外，其余各时段间表达水平差异均有显著性（P〈0.01）。结论：Resistin基因可能参与了脂肪细胞分化的中晚期过程，在3T3-LI脂肪细胞分化过程中表达逐渐上调，其表达变化与脂肪细胞分化、脂质积聚过程相一致。     

辛伐他汀对3T3-L1脂肪细胞Apelin mRNA表达的影响

目的:观察辛伐他汀对3T3-L1脂肪细胞中Apelin mRNA表达影响,为探讨Apelin在心力衰竭发病中的作用以及他汀类药物抗炎作用提供依据.方法:用辛伐他汀溶液刺激诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞,辛伐他汀浓度分别为0、1、10 μ mol/L,作用时间设为24h和48h.提取脂肪细胞总RNA,运用实时荧光定量聚合酶链反应技术测定Apelin mRNA表达量的变化.结果:经辛伐他汀干预后3T3-L1脂肪细胞Apelin mRNA表达降低,高浓度的辛伐他汀对Apelin mRNA的表达有显著的抑制作用(P<0.05).在相同药物浓度下,不同作用时间各组之间差异无显著性(P>0.05). 结论:辛伐他汀可使3T3-L1脂肪细胞中Apelin mRNA表达减少,并具有药物浓度依赖性.这可能部分解释了辛伐他汀的抗炎作用.     

IR-3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞的建立

目的探讨3T3-L1脂肪胰岛素抵抗细胞（insulin resistant 3T3-L1 adipocytes cell, IR-3T3-L1）最佳的建立条件。方法采用
地塞米松（Dexamethason,DEX）、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤（3-isobutyl-methylxanthine, IBMX）和不同浓度的胰岛素（10-8、10-7、
10-6 mol·L-1）诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞,Oil red O染色确定最佳胰岛素诱导浓度,继而用1 μmol·L-1 DEX
诱导建立IR-3T3-L1 脂肪胰岛素抵抗细胞。采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶（Glucose oxidase-peroxidase, GOD-POD）法对
IR-3T3-L1细胞的最佳诱导时间（24~120 h）及其稳定时间（24~48 h）进行了考察。结果Oil red O染色发现3T3-L1前脂肪细胞
用DEX、IBMX和10-6 mol·L-1胰岛素诱导9 d,>90% 的前脂肪细胞分化为成熟的脂肪细胞;用1 μmol·L-1 DEX培养96 h后,脂肪
细胞葡萄糖消耗率达到最大（P=0.0003）;稳定时间考察发现,在36 h内葡萄糖消耗与对照组比较有统计学意义（P<0.001）。结
论3T3-L1前脂肪细胞在1 μmol·L-1 DEX、0.5 mmol·L-1 IBMX 和10-6 mol·L-1最佳胰岛素浓度作用下诱导分化为成熟的脂肪细
胞后,用1 μmol·L-1 DEX培养96 h即可成功诱导成IR-3T3-L1-IR脂肪胰岛素抵抗细胞,且在36 h内稳定。
     

人绒毛膜促性腺激素对3T3-L1脂肪细胞过氧化物酶增殖体激活受体γ及脂联素mRNA表达的影响

目的:探讨人绒毛膜促性腺激素(HCG)对3T3-L1脂肪细胞过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)及脂联素mRNA表达的影响.方法:分别用50、500和5000 U/L HCG干预未分化脂肪细胞2、4和6 d,未用HCG干预为空白对照组,PT-PCR测定PPARγ mRNA的表达;用诱导分化液(1 μmol/L地塞米松+0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤+10 ng/L胰岛素)诱导3T3-L1脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞,油红O染色鉴定后用5000 U/L HCG干预成熟脂肪细胞6、12和24 h,未用HCG干预为空白对照组,用RT-PCR测定PPARγ及脂联素mRAN的表达情况.结果:不同剂量HCG干预未分化3T3-L1脂肪细胞,与空白对照组相比,不同剂量干预组未分化脂肪细胞PPARγ mRNA的表达量均增加,差异有统计学意义(F=19.823、21.352和23.519,P均<0.001);不同剂量HCG干预组组间比较,5000 U/L剂量干预组PPARγ的表达量较50和500 U/L剂量组增加,差异均有统计学意义(P均<0.05):50和500 U/L剂量组比较,PPARγ mRNA的表达量差异无统计学意义(P>0.05).5000 U/L HCG干预已分化3T3-L1脂肪细胞后,空白对照组、干预6、12和24 h组相比,脂肪细胞PPARγ mRNA的表达差异有统计学意义(F=26.907,P<0.001),脂联素mRNA的表达差异无统计学意义(F=0.066,P=0.976).结论:HCG可能促进313-L1脂肪细胞的分化,但对脂联素的分泌无影响.     

11β－羟化类固醇脱氢酶1促进3T3-L1前脂肪细胞分化

目的:应用3T3-L1细胞模型研究11β-羟化类固醇脱氢酶1(11β-HSD1)与前脂肪细胞分化的关系,探讨11β-HSD1在前脂肪细胞分化及肥胖中的作用.方法:构建11β-HSD1-SiRNA表达质粒pGCsi1encerTMH1/TetO1-11β-HSD1并稳定转染3T3-L1细胞,采用油红染色观察脂滴堆积情况,采用Western blot方法检测11β-HSD1在正常3T3-L1细胞分化过程中的表达;并用Real-time PCR检测脂肪细胞分化相关标志基因的变化,阐明11β-HSD1对前脂肪细胞成脂分化的影响.结果:正常3T3-L1前脂肪细胞在上述三联诱导分化后脂滴堆积随着分化过程逐渐增加;在pGCsilencerTMH1/TetO1-11β-HSD1转染的3T3-L1诱导分化过程中可见脂滴堆积的减少.在3T3-L1前脂肪细胞分化模型中(days 0,2,4,6,8),11β-HSD1蛋白水平是上调的.3T3-L1前脂肪细胞分化模型中GR在分化模型早期(D4及D6)是上调的,但是在分化后期(D8)很快又下降.在正常3T3-L1前脂肪细胞分化早期LPL上调,随着分化后期FAS、PPARγ等明显上升,Pref-1作为脂肪细胞分化抑制因子,在分化早期升高,在分化后期明显下调.在pGCsilencerTM H1/TetO1-11β-HSD1转染后的3T3-L1细胞分化模型中上述有关标志基因发生变化.结论:11β-HSD1作为受体前调节剂促进前脂肪细胞分化,与肥胖和胰岛素抵抗相关.     

insig-1基因siRNA干扰质粒的构建及对炎症状态下细胞胆固醇代谢的影响

目的 构建针对insig-1 基因的siRNA 表达载体,观察其对炎症状态下RAW264.7小鼠巨噬细胞胆固醇代谢的影响.方法 根据insig-1核苷酸序列,设计并构建针对insig-1 基因mRNA的3个特异性siRNA表达载体(si-1、si-2、si-3)和1个无同源性的阴性对照载体(si-nc),经酶切和测序鉴...     

胰岛素、地塞米松、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对3T3-L1脂肪细胞脂肪水孔蛋白表达的调节作用

目的通过细胞培养研究胰岛素样生长因子-1(IGF鄄1)、地塞米松对成熟脂肪细胞水孔蛋白(Aquaporinadipose,AQPap)基因表达的影响,并与胰岛素的作用相比较,以此了解AQPap基因表达的影响因素,探讨其在肥胖及糖尿病发病中所起作用。方法用不同浓度(10-6、10-7、10-8、10-9mol/L)的胰岛素、IGF鄄1(10-7、10-8、10-9、10-10mol/L)及地塞米松刺激液(10-6、10-7、10-8mol/L)刺激诱导分化第9天的3T3鄄L1细胞6h;提取细胞RNA,运用半定量RT鄄PCR技术,检测AQPapmRNA表达量的变化。结果与对照组相比,10-9mol/L胰岛素刺激细胞6h可使AQPap基因表达下降16%,10-6mol/L胰岛素使之下降超过50%。IGF鄄1也降低AQPap的基因表达,但相同浓度(10-7mol/L)刺激下,IGF鄄1的作用要弱于胰岛素(P<0.05)。地塞米松对AQPapmRNA的表达量无明显影响,不过,同时给予10-6mol/L的地塞米松和胰岛素与单用10-6mol/L胰岛素相比,AQPapmRNA的表达量有所上升(P<0.05)。结论胰岛素对3T3鄄L1脂肪细胞AQPap的表达起抑制作用,并呈剂量及时间依赖性。IGF鄄1也有抑制作用,但较胰岛素弱。地塞米松能够拮抗胰岛素对3T3鄄L1脂肪细胞AQPap基因表达的下调作用。     

硒对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响

目的:研究硒对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响。方法:培养3T3-L1前脂肪细胞,分为对照组、低硒组、中硒组和高硒组(亚硒酸钠浓度分别为0、0.01、0.1和1μmol/L),采用四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法检测硒对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响,利用油红O染色法测定硒对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。结果:在增殖实验中,与对照组相比,各处理组的OD值降低,并具有剂量依赖性(P<0.05);在分化实验中,各处理组的OD值与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。结论:硒能抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖,而对其分化无影响。     

蒙药“通拉嘎-5”对脂肪细胞葡萄糖摄取的影响及其机制研究

目的探讨"通拉嘎-5"对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖摄取的影响及其作用机制。方法将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化为脂肪细胞后,"通拉嘎-5"作用于3T3-L1脂肪细胞24 h,用3H标记的2-脱氧-葡萄糖([3H]2-DG)示踪检测胰岛素介导的3T3-L1脂肪细胞摄取葡萄糖的情况;"通拉嘎-5"作用3T3-L1脂肪细胞48 h后,用Real-time PCR检测PPARγ和LXRα的基因表达,用Western blot检测PPARγ和LXRα的蛋白表达。结果 "通拉嘎-5"能促进胰岛素介导的3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取(比阴性对照组高1.915倍,P<0.05);能明显上调3T3-L1脂肪细胞和LXRα基因(比阴性对照组高2.895倍,P<0.01)和蛋白(比阴性对照组高1.977倍,P<0.01)表达;而对PPARγ基因和蛋白表达无明显的影响。结论 "通拉嘎-5"可能通过提高3T3-L1脂肪细胞LXRα的基因和蛋白表达,促进胰岛素介导的葡萄糖摄取功能,改善胰岛素抵抗,可能为"通拉嘎-5"治疗非酒精性脂肪肝(NAFLD)的作用机制之一。     

3T3-L1脂肪细胞诱导分化与肿瘤抑制因子PTEN的表达研究

目的 优化3T3-L1脂肪细胞分化条件,研究信号因子PTEN在分化过程中的表达,以了解PTEN是否通过表达量来调节正常脂肪细胞形成,为探索PTEN的药物靶标作用奠定基础.方法 DMEM高糖培养基培养3T3-L1脂肪前体细胞,地塞米松、3-异丁基1-甲基黄磦呤(IBMX)和胰岛素按2种组合方案分别诱导3T3-L1细胞分化,油红O染色鉴定脂肪细胞,蛋白裂解液提取细胞总蛋白,SDS-PAGE和Western blotting鉴定分化过程中PTEN的表达量,用生物信息学进行小鼠和人类PTEN的同源性分析.结果 1 μmol/L地塞米松、0.5 μmol/L mMX和5 μg/ml胰岛素诱导48 h后,再用含5 μg/ml胰岛素的DMEM高糖营养液培养48 h的方案对3T3-L1细胞诱导分化效果较好,脂肪细胞分化率高且均一,在分化第10天可见90%以上细胞分化为脂肪细胞.PTEN在脂肪细胞分化过程中表达量在第0、4 th、6 th、9 th和第12天时不一致,在12天时明显下降,显著低于诱导前.同源性比对分析表明,小鼠和人类的PTENmRNA编码序列匹配率为96%,而氨基酸序列匹配率为100%.结论 内源性PTEN在小鼠3T3-L1脂肪前体细胞诱导分化为脂肪细胞的时相过程中表达量有所变化,提示PTEN可能在生理条件下即可发挥提高胰岛素敏感性和促进脂肪细胞形成的作用.     

硫化氢对脂肪细胞前体增殖的影响

目的：探讨硫化氢对小鼠3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响。方法：培养3T3-L1前脂肪细胞,分为对照组、低剂量组和高剂量组（硫化氢浓度分别为0、10、25、50和100μmol/L）,采用四甲基偶氮唑盐比色（MTT）法检测硫化氢对3T3-L1前脂肪细胞活性的影响;用BRDU法检测细胞的增殖;结果：与对照组相比,H2S在较高浓度时,对细胞有一定的毒性作用（P〈0.05）。结论：硫化氢抑制3T3-L1前脂肪细胞的增殖。     

维生素E抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化

目的:研究维生素E对3T3-L1前脂肪细胞增殖和分化的影响。方法:利用MTT研究维生素E对3T3-L1前脂肪细胞增殖的影响,利用油红O染色法测定维生素E对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。结果:维生素E对3T3-L1前脂肪细胞增殖无影响,10～100μmol/L维生素E能抑制3T3-L1前脂肪细胞的分化。结论:维生素E对前脂肪细胞分化具有抑制作用。     

吡格列酮对3T3-L1细胞葡萄糖转运蛋白4表达的影响

目的研究噻唑烷二酮类药物吡格列酮对3T3-L1细胞中葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)mRNA和蛋白表达的影响。方法将3T3-L1细胞随机分为3组对照组3T3-L1细胞进行正常的诱导分化,实验1组在3T3-L1细胞诱导时加入吡格列酮(0.1mmol/L),实验2组在诱导分化后成熟的3T3-L1脂肪细胞中加入吡格列酮(0.1mmol/L)。提取细胞总RNA和总蛋白做RT-PCR和Western-blot测定GLUT4mRNA和蛋白的表达情况。结果与对照组比较实验组GLUT4mRNA和蛋白的表达水平显著升高(P<0.05)。结论吡格列酮促进3T3-L1脂肪细胞GLUT4mRNA和蛋白表达。     

白藜芦醇对3T3-L1脂肪细胞线粒体生物合成的影响

目的通过研究白藜芦醇(resveratrol,Res)对3T3-L1脂肪细胞线粒体生物合成的影响,探讨其在细胞能量代谢中的作用。方法诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,分别设置对照组和10、20、40μmol/L的Res干预组,油红O染色观察细胞内脂质蓄积情况,透射电镜观察细胞内线粒体的数量和形态,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测线粒体合成过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptorγ,PPARγ)、过氧化物酶体增殖物激活受体共激活因子(peroxisome proliferato-activated receptorγcoactivator-1α,PGC-1α)、含PR结构域的锌指蛋白16(PR domain-containing 16,PRDM16)的表达水平。结果 Res干预导致10、20、40μmol/L组细胞内的脂质蓄积量与对照组相比分别减少了10.7%、38.9%、62.9%(P均0.01);细胞内的线粒体数量增加,体积增大;细胞内PPARγ、PGC-1α、PRDM16蛋白表达水平增加。其中10μmol/L组PPARγ、PGC-1α的表达量为对照组的(1.91±0.38)、(1.59±0.10)倍(P0.01),20μmol/L组PPARγ、PGC-1α和PRDM16的表达量为对照组的(3.76±0.28)、(1.61±0.15)和(1.30±0.10)倍(P0.01),40μmol/L组PPARγ、PRDM16的表达量为对照组的(3.88±0.31)、(1.22±0.13)倍(P0.05)。结论 Res可能通过促进3T3-L1细胞线粒体的生物合成,减少其脂质蓄积,从而提升细胞能量代谢水平。