荧光定量RT-PCR 检测神经母细胞瘤细胞MYCN基因mRNA的表达

目的：MYCN基因表达对神经母细胞瘤的治疗及预后评估有指导意义,目前国内对于MYCN基因mRNA的定量检测未见报道,该研究拟采用SYBR 绿色荧光染料Ⅰ(SYBR GREEN Ⅰ) 实时检测的逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法,检测神经母细胞瘤细胞系LA-N-5细胞 MYCN基因mRNA的表达,并对其可行性及实用性进行研究,力争探索出微量瘤标本的MYCN基因mRNA定量检测的可行方法。方法：提取神经母细胞瘤细胞系LA-N-5 细胞总RNA,采用SYBR GREEN I 实时检测的RT-PCR检测其MYCN基因mRNA的表达,并用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内参照,将MYCN基因的mRNA拷贝数与GAPDH的拷贝数相除,结果为单细胞MYCN基因mRNA的表达水平。结果：反应标准曲线有良好的相关性( R2>0.99), PCR 产物特异, 神经母细胞瘤细胞系LA-N-5 MYCN基因mRNA的表达水平为17.4±1.2。结论：只要严格控制PCR 反应条件,SYBR GREEN Ⅰ定量RT-PCR 法可以作为一种良好的定量PCR方法对神经母细胞瘤细胞系LA-N-5 MYCN基因mRNA的表达进行检测,此方法为临床微量神经母细胞瘤瘤组织的MYCN基因mRNA的定量检测提供了可能。［中国当代儿科杂志,2007,9（1）：47-50］     

miR-21抑制表达稳定转染SK-N-SH1381中差异表达mRNA筛选及验证

目的 筛查miR-21抑制表达的人神经母细胞瘤细胞株(SK-N-SH1381) mRNA表达谱,寻找miR-21潜在下游靶基因,以进一步深入探讨miR-21及其参与的通路在肿瘤发生发展中的作用.方法 采用Agilent Human Gene Expression Chip技术筛选了慢病毒转染稳定抑制miR-21表达的入神经母细胞瘤细胞株(SK-N-SH1381)和其配对的慢病毒转染无义序列的入神经母细胞瘤细胞株(SK-N-SH1v3-nc),运用生物信息技术,预测miR-21靶基因、基因功能富集,结合相关文献检索,筛选出候选基因,并在细胞水平通过荧光定量PCR验证芯片结果.结果 基因表达谱芯片共筛选出4 985个差异在2倍以上的mRNA(P＜0.05),其中上调表达的基因2 734个,下调表达的基因2 251个.基于microRNA的作用,我们仅选择其中上调的2 734个基因为miR-21可能靶基因,与生物信息学软件分析预测出的398个潜在靶基因进行Venn分析,共获取64个候选潜在靶基因.进一步通过生物信息学分析与文献检索,挑选出6个可能靶基因,分别为EVA1A、TOM1 L2、RGMA、LINC-PINT、NACC2及RPAP3.细胞水平荧光定量PCR结果均与芯片结果一致,EVA1A、TOM1 L2是其中差异表达倍数变化最大的2个候选基因.结论 结合芯片技术和生物信息学分析,在miR-21抑制表达的神经母细胞瘤细胞株中,筛选出6个miR-21可能的下游靶基因,分别为EVA1A、TOM1L2、RGMA、NACC2、RPAP3及LINC-PINT.其中EVA1A、TOM1L2是其中差异表达倍数变化最大的2个候选基因,进一步后续研究,探讨其在神经母细胞瘤发生发展中的作用.     

三氧化二砷对人神经母细胞瘤细胞凋亡作用的影响

目的：三氧化二砷(As2O3 )通过诱导细胞凋亡和诱导细胞分化效应治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)患者已取得很好疗效。与APL细胞相似,神经母细胞瘤(NB)细胞也是分化成熟受阻,该文对As2O3 在体外对人神经母细胞瘤细胞凋亡作用的影响及可能的机制进行探讨。方法：比色法观察As2O3 对神经母细胞瘤SK N SH细胞增殖的影响;Giemsa染色观察细胞形态学改变;Annexinⅴ/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡;免疫细胞化学染色方法检测bcl 2蛋白表达变化。结果：As2O3 明显抑制SK N SH细胞增殖,抑制作用呈剂量时间依赖效应,并出现细胞凋亡的形态学改变;流式细胞仪检测4. 0μmol/LAs2O3 作用SK N SH细胞72h后,早期凋亡细胞比例( 9. 9±0. 8 )%,与对照组( 3. 7±0. 2 )%相比明显增多,差异有显著性(P< 0. 05 );分别以1. 0, 2. 0,4. 0μmol/L的As2O3 处理SK N SH细胞72h后,bcl 2表达随As2O3 浓度增加呈降低趋势,bcl 2表达阳性率分别为(26. 3±8. 0)%, (15. 0±4. 5)%和(4. 8±3. 2)%,与对照组(73. 6±6. 1)%相比,差异有显著性(P<0. 01)。结论：As2O3 可在体外抑制神经母细胞瘤细胞增殖,诱导凋亡,bcl 2参与了其调节作用。     

RNA干扰抑制神经母细胞瘤细胞MYCN基因的初步研究

目的对RNA干扰抑制神经母细胞瘤细胞（LAN-5）MYCN基因表达进行初步研究。方法体外化学合成针对MYCN基因的小干扰RNA（siRNA），经脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染神经母细胞瘤细胞，以无关siRNA和未转染的细胞为对照，采用SYBR绿色荧光染料Ⅰ的实时荧光定量RT-PCR检测siRNA的抑制效果。结果脂质体转染siRNA效率可达84.83％，化学合成的siRNA可抑制神经母细胞瘤细胞MYCN基因mRNA表达，转染72h后抑制率达58．3％。结论化学合成的siRNA可以有效抑制神经母细胞瘤MYCN基因的表达，为神经母细胞瘤基因治疗开辟了新的途径。     

熊果酸对神经母细胞瘤细胞增殖凋亡及MYCN表达的影响

目的实验研究熊果酸作用于体外培养的神经母细胞瘤细胞株（SH—SY-5Y）,对肿瘤细胞增殖、凋亡及MYCN基因mRNA表达的影响,探讨熊果酸对儿童神经母细胞瘤的治疗的作用。方法以终浓度为4uM／L、8uM／L、12uM／L的熊果酸作用于神经母细胞瘤细胞SH—SY-5Y,WST-1法检测SH—SY-5Y细胞增殖情况,流式细胞术检测SH—SY-5Y细胞凋亡情况,采用RealtimePCR方法检测MYCNmRNA的表达情况。结果熊果酸对SH—SY-5Y细胞增殖的抑制呈明显的剂量、时间依赖性,随剂量的增加,作用时间的延长,抑制效果逐渐加强;熊果酸对SHSY-5Y细胞凋亡的促进呈明显的剂量依赖性,随剂量的增加,促进凋亡效果逐渐加强;熊果酸对SH—SY-5Y细胞MYCN表达有抑制作用并有明显的剂量依赖性,随剂量的增加,抑制效果逐渐加强。12uM／L作用72h后神经母细胞瘤细胞增殖抑制效率达98．3％,MYCN基因mRNA表达抑制率达52．37％。结论应用熊果酸在体外环境作用SH—SY-5Y细胞,可以有效抑制该细胞的增殖、促进细胞凋亡、抑制原癌基因MYCNmRNA的表达。     

儿童微小病变型肾病综合征致病相关基因筛查

目的比较微小病变型肾病综合征(MCNS)患儿与正常健康儿童外周血单个核细胞(PBMC)的基因表达谱变化,筛查MCNS相关致病基因,为揭示MCNS的发病分子机制和临床治疗提供线索。方法原发性MCNS患儿7例,正常同年龄对照组7例,Trizol法抽提PBMC总RNA;采用人类基因组表达谱芯片检测MCNS及正常健康儿童PBMC基因mRNA水平;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和荧光定量PCR检测部分基因转录水平,鉴定芯片相关检测结果。结果在33 000个基因转录本中,有969个转录本在MCNS患儿PBMC中存在表达差异,其中表达上调552个,表达下调417个。RT-PCR和荧光定量PCR检测结果与基因芯片较为一致。结论采用人类基因组表达谱芯片可快速有效地检测MCNS患儿PBMC中基因表达谱的变化,进而证实MCNS的发生、发展是涉及多基因改变的复杂过程。     

miRNA338调节人神经母细胞瘤细胞中CXCR4表达的研究

目的 微小RNA( microRNA,miRNA)是一类非编码小分子RNA组成的家族,能够通过降解靶mRNA或抑制其翻译过程参与调节基因表达.本研究旨在探索上调miR338水平后人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中CXCR4表达变化,进而了解miR338调节神经母细胞瘤侵袭与转移的分子机制.方法 将人工合成的成熟miR338前体(pre-mir-338)转染入SH-SY5Y细胞,而后利用实时荧光定量RT-PCR检测转染前后各组细胞miR338的表达水平.应用半定量RT-PCR及Western蛋白印迹法分别从mRNA水平、蛋白水平检测各实验组CXCR4的表达变化.结果 实时荧光定量PCR法检测对照组及各实验组细胞miR338基因含量,发现转染了pre-mir-338的10 nM,30 nM,50 nM,100 nM组miR338含量分别为空白对照组的1.32倍,1.62倍,1.90倍及1.86倍,差异具有统计学意义(P＜0.05),成功将pre-mir-338转染入细胞达到miR338过表达的目的;转染组(10 nM组、30 nM组、50nM组)CXCR4基因mRNA相对光密度值分别为0.75±0.06,0.58±0.08,0.24±0).05,依次降低,均明显低于空白对照组1.11±0.08,空载对照组1.04±0.08(P＜0.05).转染组CX-CR4蛋白0).24±0.06较未转染组0.56±0.08降低(P＜0.05).结论 miR338能够通过下调神经母细胞瘤细胞CXCR4 miRNA及蛋白的表达参与调节肿瘤的侵袭与转移,人工合成的pre-mir-338有望通过替代方式为神经母细胞瘤的治疗提供新的途径.     

急性单核细胞白血病细胞系THP-1侧群细胞的分选、鉴定与富集

目的 探讨人急性单核细胞白血病细胞系THP-1中是否存在侧群(SP)细胞,鉴定其是否具有白血病干细胞(LSCs)的生物学特性,并研究从THP-1细胞系中富集SP细胞的方法.方法 THP-1细胞用Hoechst33342荧光染料染色后,分别应用荧光显微镜和流式细胞术(FCM)检测是否存在SP细胞及SP细胞的形态和比例.分选SP和非侧群(NSP)细胞,FCM检测其表面抗原表达及细胞周期;实时荧光定量PCR检测耐药基因ABCG2、ABCB1和凋亡基因Bcl-2、Bax在两亚群细胞中的表达差异.将THP-1细胞用不同水平阿糖胞苷(Ara-C)处理24h,染色后检测SP细胞比例的变化.结果 1.荧光显微镜观察到在THP-1细胞中存在拒染的SP细胞,形态与NSP细胞无明显区别.FCM检测结果显示,试验管SP细胞比例为(1.81±0.99)％,对照管可被维拉帕米完全拮抗.2.FCM分选SP细胞的纯度达到(96.71±0.90)％;SP细胞大部分处于静止期,Go/G1期细胞比例达(84.04 ±4.98)％,而NSP细胞则处于增殖期,S/G2/M期细胞比例为(56.38±1.48)％;CD34+、CD34+ CD38-细胞在SP亚群中的比例要高于NSP亚群(P ＜0.05);SP细胞ABCG2及ABCB1表达水平显著高于NSP细胞(P均＜0.05).SP细胞Bcl-2表达水平(0.99±0.08)显著高于NSP细胞(0.29±0.13)(P＜0.05),而Bax表达值(0.68±0.05)与NSP细胞(0.85±0.09)表达水平差异无统计学意义(P＞0.05),但Bcl-2/Bax比值显著高于NSP细胞亚群(P＜0.05).3.经与Ara-C共培养24h后,SP细胞的比例显著提高,且随着Ara-C水平增大,SP细胞比例也越高.结论 人急性单核细胞白血病细胞系THP-1中存在少量SP细胞,较之NSP细胞更具有干细胞的生物学活性.与一定水平Ara-C共培养可有效富集THP-1细胞系中的SP细胞,可作为LSCs研究的切入点,对进一步研究白血病有重要意义.     

miR-144通过靶定ITGβ1调控神经母细胞瘤的侵袭转移

目的 本研究旨在探讨miR-144对神经母细胞瘤的侵袭和转移的影响,并探索miR-144是否通过靶定ITGβ1调节神经母细胞瘤的侵袭和转移.方法 利用生物信息学技术预测miR-144的靶基因ITGβ1,应用荧光报告基因检测以及荧光定量PCR、Western Blot实验对靶基因进行验证.在神经母细胞瘤SH-SY5Y和SK-N-BE分别瞬时转染化学合成的成熟双链miR-144和靶基因敲降质粒及对照质粒,建立过表达miR-144细胞模型和靶基因敲降细胞模型.通过 Transwell侵袭实验和划痕实验检测细胞的体外侵袭和转移能力.结果 Transwell实验结果表明,在神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和SK-N-BE中过表达miR-144后,细胞的侵袭数目分别为41±2和55±2,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01).抑制ITGβ1基因的表达后,体外划痕实验结果表明,过表达miR-144后,与对照组相比,SH-SY5Y和SK-N-BE细胞的转移能力分别下降了65.45%和75.41%(P<0.01).荧光报告基因检测结果显示过表达miR-144后,含有结合位点的荧光报告质粒的相对荧光量降低了37.11%(P<0.01),而将结合位点进行基因突变后miR-144对靶基因的抑制作用消失.过表达miR-144后,与对照组相比,SH-SY5Y和SK-N-BE细胞内的ITGβ1 mRNA水平分别降低了40%和43%,Western Blot检测结果显示,ITGβ1蛋白水平分别降低了39%和40%.结论 miR-144通过靶定ITGβ1基因抑制神经母细胞瘤的侵袭和转移过程.     

苦参碱抑制神经母细胞瘤LA-N-5细胞增殖及MYCN基因mRNA的表达

目的：神经母细胞瘤是4岁以下儿童最常见的恶性实体肿瘤,MYCN基因的高表达导致预后更加恶劣。苦参碱作为中药苦参的重要成分对多种肿瘤有治疗作用,该实验拟应用苦参碱作用神经母细胞瘤细胞(LA-N-5),对肿瘤细胞增殖及MYCN基因mRNA表达受抑制情况进行初步研究,希望可以为神经母细胞瘤的治疗开拓新的思路。方法：以终浓度为0.25 mg/mL,0.50 mg/mL,0.75 mg/mL,1.00 mg/mL苦参碱作用神经母细胞瘤LA-N-5细胞, MTT法检测LA-N-5细胞增殖情况变化,采用SYBR 绿色荧光染料Ⅰ的实时荧光定量RT-PCR检测MYCN基因mRNA表达受抑制情况。结果：苦参碱对LA-N-5细胞增殖的抑制呈明显的剂量、时间依赖性,随剂量的增加,作用时间的延长,抑制效果逐渐加强。1.00 mg/mL作用72 h后肿瘤细胞增殖抑制效率达36.3%,单细胞MYCN基因mRNA表达9.7±0.35拷贝,抑制效率达44.6%。结论：应用苦参碱在体外环境作用LA-N-5细胞,可以有效抑制该细胞的增殖、原癌基因MYCN mRNA的表达,为临床上神经母细胞瘤的治疗开拓了新的思路。     

S100A4反义核酸抑制神经母细胞瘤细胞侵袭的作用

目的　探讨S10 0A4基因在神经母细胞瘤 (NB)细胞侵袭和转移中的作用及其可能机制。方法　将S10 0A4反义核酸转染NB细胞系LA N 6,RT PCR检测S10 0A4、基质金属蛋白酸 (MMP 2 )mRNA水平 ,Transwell检测细胞迁移和侵袭能力。结果　转染反义核酸的LA N 6细胞S10 0A4、MMP 2mRNA表达与对照组相比 ,分别下调 3 5.6%和 2 5.5% ,趋化和侵袭细胞数较对照组明显减少 (P均 <0 .0 5)。结论　反义封闭S10 0A4基因可抑制LA N 6细胞迁移和侵袭力 ,伴MMP 2mRNA表达减低 ,因此 ,S10 0A4基因在NB侵袭转移过程中发挥作用 ;其作用机制可能与增加瘤细胞运动能力 ,调节MMP 2表达有关     

RNA干扰对神经母细胞瘤细胞VEGFA的mRNA表达的影响

目的 构建表达VEGF-A的短发夹RNA真核表达载体,并通过其介导的RNA干扰作用,研究对人神经母细胞瘤细胞株IGR-N-91细胞中VEGF-A的mRNA表达的影响.方法 根据VEGF-A的cDNA序列合成两对寡核苷酸片段,退火后分别插入真核表达载体组成重组质粒.对重组质粒进行PCR、测序鉴定验证后,经Western Blot筛选RNA干扰效果最佳的质粒,然后将该质粒转染人神经母细胞瘤细胞株IGR-N-91.转染48 h后提取总RNA,逆转录为CDNA,经RT-PCR半定量检测VEGF-A mRNA的表达水平.结果 成功构建含有VEGF-A的RNA干扰片段真核表达载体,经Western Blot筛选后分别得到RNA干扰效果最佳的片段.RT-PCR结果表明质粒转染人神经母细胞瘤后VEGF-A的mRNA的表达升高.结论 成功构建含有人VEGF-A的RNA干扰片段的真核表达载体,该重组质粒转染人神经母细胞瘤IGR-N-91细胞后VEGF-A的mRNA表达升高.     

Bax与p53、Bcl-2、PCNA在不同类型神经母细胞瘤中的表达及意义

目的探讨Bax与p53、Bcl-2、PCNA在不同神经母细胞瘤（组织结构不良型,UFH;组织结构良好型,FH）中的表达及意义。方法收集近6年来上海儿童医学中心保存的儿童神经母细胞瘤石蜡标本33例（UFH型10例,FH型23例;男17例,女16例;年龄1个月至15岁,平均年龄33．1个月）。利用组织芯片的高通量、低误差、经济省时等优点,将两组标本制作成组织芯片,再行免疫组化SP法检测Bax与p53、Bcl-2、PCNA在神经母细胞瘤中的表达。并采用荧光原位杂交法（FISH）检测神经母细胞瘤中p53、Bcl-2基因的表达。采用SAS统计软件对结果进行统计学处理,两样本比较采用Wilcoxon秩和检验。结果两组神经母细胞瘤（UFH型和FH型）中Bax与p53均呈低表达,差异无统计学意义（P〉0．05）;而Bcl-2和PCNA在两组肿瘤中表达均较高,差异无统计学意义（P〉0．05）。p53、Bcl-2基因检测结果与免疫组化染色结果一致。结论UFH型和FH型神经母细胞瘤在表征细胞增殖和凋亡的4个指标（Bax与p53、Bcl-2、PCNA）检测中显示小完全的一致性,表明不同组织结构类型对神经母细胞瘤的细胞增殖和凋亡无显著影响。在两组神经母细胞瘤中Bcl-2的高表达与Bax的低表达呈负相关,说明Bcl—2可能参与了儿童神经母细胞瘤的发生,而Bax可能对肿瘤的发生起抑制作用。两组神经母细胞瘤中p53基因发生突变的比例较低,而细胞增殖功能均较旺盛。     

脂质体介导S100A4基因反义寡核苷酸对神经母细胞瘤细胞的作用效率及其稳定性的研究

目的：S100A4基因在神经母细胞瘤早期转移中发挥重要作用。该研究以脂质体介导S100A4基因反义寡核苷酸转染体外培养的神经母细胞瘤细胞,观察其作用效率及稳定性。方法：以脂质体包裹5’端带有FAM荧光标记的S100A4基因反义寡核苷酸转染体外培养的神经母细胞瘤细胞,用无脂质体包裹的反义寡核苷酸为对照,在激光共聚焦显微镜下观察荧光强度变化、作用效率及存留时间。结果：经脂质体介导的S100A4基因反义寡核苷酸可以高效进入神经母细胞瘤细胞,荧光强度转染后8 h达最高值173,24 h后仍高达135,作用效率达68%,稳定表达72 h以上;无脂质体包裹的反义寡核苷酸荧光强度在转染后6 h达最高值90,作用效率35%,稳定表达仅12 h。结论：脂质体介导的S100A4基因反义寡核苷酸作用于神经母细胞瘤细胞效率高、时间持久,值得在神经母细胞瘤基因治疗中进一步探讨。     

双酚A对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞增殖的影响

目的探讨双酚A（BPA）对人神经母细胞瘤SK—N—SH细胞增殖的影响及其可能机制。方法SK—N—SH细胞经培养扩增后分为5组：组1，无干预（对照组）；组2，加17p雌二醇（E2）；组3，加BPA；组4，同时加E2和ICI 182，780；组5，同时加BPA和ICI182，780。分别在0h、24h、48h和72h进行光吸收度值（AV）检测，在72h进行流式细胞仪DNA增殖指数（PI）检测。结果组3的AV在24h、48h、72h均明显增加，分别是组1的1．53、1．25、1．20倍，72h时的PI是组1的1．42倍。组2的结果与组3相似。组4、5中细胞增殖受到ICI182，780的明显抑制。结论BPA能促进人神经母细胞瘤SK—N-SH细胞的体外增殖，该促增殖作用可能是通过雌激素受体依赖途径实现的。     

细胞色素C1对神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y增殖作用的研究

目的分析细胞色素C1(CYC1)在神经母细胞瘤(NB)增殖中的作用,探讨神经母细胞瘤增殖的分子机制。方法首先采用在SH-SY5Y细胞系中慢病毒介导敲减CYC1基因方法,建立神经母细胞瘤CYC1敲减模型,并利用实时定量RT-PCR方法验证敲减效率;随后利用荧光显微镜观察及细胞分析系统连续检测慢病毒感染SH-SY5Y细胞后连续5 d细胞增殖数。结果慢病毒介导的SH-SY5Y细胞中CYC1基因敲减效率达77.0%±4%,具极显著差异(P<0.01);通过细胞分析系统连续检测SH-SY5Y细胞慢病毒感染敲减CYC1后0~5 d细胞数发现细胞增殖速度明显降低,对照组/敲减CYC1组细胞数1~5 d比值分别为(1.00±0.11)、(1.61±0.16)、(1.58±0.17)、(1.97±0.13)、(1.44±0.13),具极显著差异(P<0.01)。结论 CYC1基因沉默可抑制神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y增殖,CYC1在调节神经母细胞瘤生长增殖方面发挥重要作用。     

胚胎干细胞基因Oct-4在神经母细胞瘤组织中的表达及意义

目的 探讨神经母细胞瘤组织中胚胎干细胞基因Oct-4的表达情况及其意义.方法 收集39例神经母细胞瘤和相应癌旁组织,应用实时定量PCR和Western印迹法检测Oct-4的表达,并分析其表达与临床病理参数的相关性.结果 术前未化疗的神经母细胞瘤Oct-4的mRNA相对表达量为6.53±1.74,明显强于瘤旁组织1.04±0.65,两组间差异有统计学意义(P＜0.05);其中Ⅲ～Ⅳ期肿瘤Oct-4 mRNA相对表达量8.81±0.67较Ⅰ～Ⅱ期肿瘤4.26±0.54高,差异有统计学意义(P＜0.05).Ⅲ～Ⅳ期肿瘤中术前未化疗的Oct-4 mRNA相对表达量8.81±0.67明显高于术前化疗的肿瘤3.15±0.42(P＜0.05).神经母细胞瘤Oct-4表达与患儿性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤部位、病理分型等参数无相关性.结论 Oct-4可能与神经母细胞瘤的发生、发展相关,化疗药物的使用对其表达有抑制作用.     

siRNA下调AEG-1表达对神经母细胞瘤细胞MMP-9的表达及侵袭能力的影响

目的 观察下调Astrocyte elevated gene-1(AEG-1)基因对神经母细胞瘤细胞中基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达以及细胞侵袭能力的影响.方法 根据RNA干扰原理,设计合成AEG-1 siRNA.通过荧光定量RT-PCR和Western blotting观察神经母细胞瘤细胞中AEG-1基因mRNA和蛋白下调情况;采用Western blotting观察下调AEG-1表达对神经母细胞瘤细胞中MMP-9蛋白表达的影响;通过侵袭实验(Transwell法)观察下调AEG-1表达对神经母细胞瘤细胞侵袭能力的影响.结论 采用AEG-1 siRNA转染神经母细胞瘤细胞,下调细胞内AEG-1的mRNA和蛋白表达(P＜0.05)后MMP-9蛋白表达抑制率分别为63.1%和58.9%.此外下调AEG-1表达使细胞侵袭能力明显减弱(P＜0.05).结论 AEG-1基因下调使神经母细胞瘤细胞中MMP-9的蛋白表达明显减少、活性明显减弱,同时使细胞的侵袭能力降低.由此可见AEG-1在肿瘤细胞的侵袭转移中可能扮演重要角色,将会成为神经母细胞瘤基因治疗的新靶点.

Abstract：

Objective To investigate the effect of astrocyte elevated gene-1 (AEG-1)siRNA induced inhibition of invasion in neuroblastoma cells.Methods A small interference RNA(siRNA) targeting to AEG-1 mRNA(AEG-1 siRNA) was constructed and transfected into neuroblastoma cells with Lipofectamine 2000.A non-specific siRNA(control siRNA) and non-treatment were used as negative control group and blank group.The expression of AEG-1 mRNA was detected by RT-PCR.The proteins of AEG-1 and MMP-9 were detected by Western blotting.Cell invasion after AEG-1 knockdown was observed by Transwell assay.Results Compared with the control group,the expression of AEG-1 mRNA and protein were significantly decreased in the cells transfected with AEG-1 siRNAs(P＜0.05).AEG-1 knockdown by siRNA markedly decreased the expression of MMP-9 protein by 63.1% in neuroblastoma cells and the ability of cell invasion (P＜0.05).Conclusions The expression of AEG-1 mRNA is down-regulated by AEG-1 siRNA in neuroblastoma cells.Moreover,knockdown of AEG-1 expression in human neuroblastoma cells significantly inhibits the expression of MMP-9 protein and cell invasion.Therefore,AEG-1 may play a key role for MMP-9 activity and cell invasion,making it a potential target gene for gene-therapy in neuroblastoma.     

肾母细胞瘤患儿p73基因的表达及其甲基化研究

目的：探讨肾母细胞瘤患儿血液中p73基因的转录表达、启动子甲基化状态及二者之间关系。方法：收集45例肾母细胞瘤患儿为病例组,以健康体检或因其他原因就诊的性别、年龄匹配的15例（排除肿瘤等恶性疾病）儿童为对照组。采集两组儿童外周血,运用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和甲基化特异性PCR (MSP)法检测p73基因转录表达水平及其启动子甲基化状态,并分析病例组中p73基因的表达及甲基化与临床资料的关系,及p73基因的甲基化对其转录表达的影响。结果：病例组中p73 mRNA的相对表达量（3.2±0.9）高于对照组（1.6±1.1）,差异有统计学意义（P<0.01）;病例组p73基因甲基化阳性率（20%）低于对照组 (73%),差异有统计学意义（P<0.01）。病例组中甲基化p73 mRNA的相对表达量大于非甲基化p73 mRNA的相对表达量（P<0.01）,且大于对照组中甲基化p73 mRNA的相对表达量（P<0.01）;非甲基化p73 mRNA的相对表达量在两组间差异无统计学意义（P=0.810）。结论：肾母细胞瘤外周血中p73基因启动子的异常甲基化是其基因表达调节方式之一,并与肾母细胞瘤的发生发展有关;发生甲基化的p73基因在肾母细胞瘤中有可能充当癌基因的角色,转录水平的过度表达与其甲基化状态有关。     

大鼠骨髓间充质干细胞去血清培养后钙激活中性蛋白酶10基因转录变化

目的检测血清剥夺是否诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）凋亡,探讨钙激活中性蛋白酶-10（Calpain-10）是否参与血清剥夺诱导的大鼠BMSCs凋亡。方法原代培养的大鼠BMSCs,流式细胞术鉴定细胞表型,去血清培养,应用PI/Annexin-V双染法流式细胞仪计数0、24、48h凋亡细胞的比例,应用荧光定量PCR测定血清剥夺24h诱导凋亡的Calpain-10基因mRNA水平。结果流式细胞术鉴定细胞发现CD29、CD44、CD105表达阳性,CD45、CD14、CD34表达阴性,符合BMSCs特点;血清剥夺后24h早期凋亡细胞比例最高。荧光定量PCR结果示与正常对照组比较血清剥夺诱导凋亡24h Calpain-10基因mRNA水平显著上调（2-ΔΔCT=22.433）。结论血清剥夺可诱导大鼠BMSCs凋亡,并上调Calpain-10基因mRNA水平,Calpain-10可能参与血清剥夺诱导的大鼠BMSCs凋亡。