血管紧张素Ⅱ2型受体介导抑制大鼠颈动脉新生内膜增生的机制

目的:探讨血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)介导抑制新生内膜增生作用的机制。方法:大鼠颈动脉球囊损伤后,局部转染带有大鼠AT2R基因重组腺病毒转染(pAdCMV／AT2R)或空载腺病毒转染 (pAd-GFP),分正常组(6只)、未转染组(18只)、pad-GFP组(18只)、pAdCMV／AT2R组(18只)。于术后7、14、21天取材,用逆转录一多聚酶链反应、Western印迹杂交检测AngⅡ1型受体(AT1R)、AT2R、胞外调控激酶1和2、基本转录元件结合蛋白2在大鼠颈动脉壁中的表达变化。结果:未转染组和pad-GFP组AT1R、AT2R、胞外调控激酶1和2、基本转录元件结合蛋白2的7、14、21天mRNA及蛋白表达显著高于正常组,pAdCMV／AT2R组AT2R的表达显著高于正常组、未转染组和pAd-GFP组(P<0．01),胞外调控激酶1和2、基本转录元件结合蛋白2的表达显著低于未转染组和pAd-GFP组(P<0．01),而AT1R的表达在未转染组、pAd-GFP组、pAdCMV／AT2R组无显著差异(P>0．05)。结论:AT2R灭活AT1R激活的胞外调控激酶1和2,降低基本转录元件结合蛋白2表达,可能是AT2R介导抑制新生内膜形成的机制之一。     

BTEB2反义基因转染对大鼠颈动脉球囊损伤后内皮修复的影响

目的构建反义基本转录元件结合蛋白2(BTEB2)重组腺病毒载体,并研究BTEB2反义RNA对动脉损伤后内皮修复的影响。方法通过RTPCR从培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)中制备BTEB2cDNA,将其反向克隆至腺病毒载体,构建反义BTEB2重组腺病毒;用重组腺病毒局部转染球囊损伤的大鼠颈动脉,观察反义BTEB2基因转染对BTEB2蛋白表达及损伤内皮修复的影响。结果构建的BTEB2反义重组腺病毒经鉴定正确,其滴度为5×1010pfumL;反义BTEB2重组腺病毒转染可显著抑制BTEB2蛋白表达,明显促进内皮的修复,改善损伤动脉的内皮依赖性舒张功能。结论成功构建了反义BTEB2重组腺病毒载体。BTEB2反义基因转染可显著促进大鼠颈动脉球囊损伤后的内皮修复。     

纳米粒子载反义单核细胞趋化蛋白-1基因局部定位转染抑制兔颈动脉内膜损伤后内膜增生的研究

目的 观察纳米粒子包载反义单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）基因局部腔内转染对兔颈动脉球囊损伤后内膜增生的影响。方法 采用球囊导管损伤动脉内膜的方法建立兔颈动脉球囊损伤模型。用纳米粒子包载反义MCP-1基因。采用保留灌注的方法进行局部腔内定位转染。结果 聚合酶联反应检测发现重组基因整合，RNANorthern杂交观察到转基因治疗组有反义MCP-1基因表达，内源性MCP-1基因的表达受抑制，转基因治疗组内膜/中膜面积比降低42%。结论 纳米粒子可以作为转基因载体。反义MCP-1基因的表达能够有效抑制球囊损伤后新生内膜的增生。     

小鼠颈动脉损伤新生内膜增生与局部转录因子Id1的关系

目的研究转录因子Id1在小鼠颈动脉损伤后血管壁的动态表达及在损伤血管新生内膜增生中的作用。方法采用昆明小鼠颈动脉球囊损伤动物模型,随机均分为四组:正常对照组、血管损伤后7天、14天及28天组。HE染色评价血管内膜增生情况。逆转录聚合酶链反应、Western blotting及免疫组织化学染色等方法检测血管壁Id1的表达。结果正常对照组小鼠颈动脉内膜/中膜面积比值很小,损伤7天组颈动脉内膜/中膜面积比值显著高于正常对照组(P0.05),损伤14天组和28天组颈动脉内膜/中膜面积比值明显高于7天组(P0.05)。正常对照组小鼠颈动脉血管壁Id1 mRNA和蛋白表达很低,损伤后7天血管壁Id1 mRNA和蛋白表达水平明显增加,损伤14天Id1 mRNA和蛋白表达显著高于7天组(P0.05),但损伤28天组Id1 mRNA和蛋白表达较14天组有所降低(P0.05)。免疫组织化学显示正常血管壁Id1表达很弱;随血管损伤时间延长Id1表达逐渐增强,14天达到高峰,28天表达出现减弱。结论颈动脉损伤后局部Id1表达动态改变伴随血管损伤新生内膜增生的变化,提示转录因子Id1可能参与血管损伤后新生内膜增生的调控过程。     

反义CD151基因抑制血管损伤后内膜增生的实验研究

选择雄性SD大鼠57只,12只作为空白对照组(A组),其余45只随机分为反义CD151基因治疗组(B组)、载体对照组(C组)、生理盐水对照组(D组)。建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,用血管腔内保留灌注和血管外膜渗透途径,将携带反义CD151基因的质粒转染入大鼠球囊损伤后的颈动脉中;取术后14d时的造模血管标本,以免疫组化法分析CD151蛋白表达;取28d时的造模血管标本,以HE染色观察形态学变化,测算管腔面积(LA)、内膜厚度(IT)、中膜厚度(MT)、内膜面积(IA)、中膜面积(MA)、IT/MT及IA/MA。结果免疫组化分析显示,B、C、D组血管CD151蛋白表达均较A组增强,B组明显弱于C、D组。HE染色病理切片显示,B组的LA、IT、MT、IA、MA、IT/MT及IA/MA均显著小于C、D组(P均<0.05)。提示反义CD151基因的局部转染可显著抑制大鼠颈动脉球囊损伤后血管内膜增生。     

腺病毒介导组织因子途径抑制物基因转染兔损伤颈动脉后的表达及对内膜增生的抑制作用

目的 检测人组织因子途径抑制物(tissue factor pathway inhibitor,TFPI)基因腺病毒载体系统在体表达及对兔颈动脉球囊损伤后新生内膜增生的抑制作用.方法 共采用中国大耳白兔70只.分为4组,分别为腺病毒介导TFPI基因(Ad-TFPI)转染组、腺病毒介导LacZ基因(Ad-LacZ)转染组、PBS组及假手术组,前3组分别于颈动脉球囊损伤后局部转染Ad-TFPI、Ad-LacZ或PBS,假手术组只分离颈总动脉,不做球囊损伤.Ad-TFPI组和Ad-LacZ组每组25只动物,PBS组及假手术组每组10只.Ad-TFPI组和Ad-LacZ组分别于术后3、7、10、14和28 d各处死3只动物,用RT-PCR、ELISA方法 ,检测TFPI在颈动脉壁中的表达.术后4周时,4组剩余动物(每组10只)行颈动脉造影检测最小管腔直径,之后取血管标本,观察病理形态学变化,测算出血管新生内膜面积、内膜与中膜的比例(I/ M)、管腔狭窄程度.结果 基因转染后3 d,Ad-TFPI 组检测到TFPI mRNA及蛋白表达,10～14 d为表达高峰,28 d有所下降但仍可检测到,Ad-LacZ组未测到人TFPI的表达.基因转染后4周,颈动脉造影结果 示Ad-TFPI组最小管腔直径明显大于PBS组和Ad-LacZ组[(1.17±0.43)mm比(0.43±0.33)mm、(0.39±0.24)mm],管腔狭窄百分率明显低于PBS组和Ad-LacZ组[(32±8.2)%比(79±10.2)%、(81±13.1)%],P均<0.01.形态学检查分析结果 显示Ad-TFPI组新生内膜面积明显小于PBS组和LacZ组[(0.17±0.03)mm2比(0.73±0.03)mm2、(0.78±0.04)mm2],L/ M值明显小于PBS组和LacZ组(1.02±0.25比2.76±0.33、2.92±0.24),管腔狭窄程度明显低于PBS组和LacZ组[(24.5±2.1)%比(78.2±2.8)%、(81.3±3.2)%],P均<0.01.结论 人TFPI腺病毒表达载体可在体内有效表达,并且对血管成形术后再狭窄有抑制作用.     

CBP基因沉默对大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生的影响

目的 观察小干扰RNA (siRNA)重组慢病毒介导的CREB结合蛋白(CBP)基因沉默对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增生的影响,并探讨其作用机制.方法 雄性SD大鼠48只,随机分为4组:假手术组、PBS对照组、慢病毒介导CBP基因siRNA转染组(CBP-siRNA-Lenti组)及慢病毒介导非CBP同源序列siRNA转染组(NC-siRNA-Lenti组),建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,术后28天处死动物.分别用实时定量PCR、Western Blot检测大鼠颈动脉CBP和乙酰化核因子κB p65(NF-κB p65)的表达水平;病理组织学观察血管内膜增生情况;免疫组织化学染色对损伤血管壁增殖细胞核抗原(PCNA)的表达进行评估.结果 术后28天,与PBS对照组和NC-siRNA-Lenti组比较,CBP-siRNA-Lenti组CBP mRNA和蛋白的表达显著下调(P均＜0.05),CBP沉默能明显抑制新生内膜面积(0.108 ±0.008 mm2比0.238±0.022 mm2、0.252±0.016 mm2,P ＜0.05)、内膜与中膜面积比(0.706±0.062比1.483 ±0.136、1.497±0.137,P＜0.05)的增加,及下调血管壁乙酰化NF-κB p65和PCNA的表达水平(P均＜0.05).结论 慢病毒介导的CBP基因沉默能有效地抑制颈动脉球囊损伤后新生内膜的形成,其机制可能与抑制NF-κB p65的过度乙酰化有关.     

他莫昔芬对雌二醇抑制动脉损伤后内膜增生的影响

目的探讨他莫昔芬对雌二醇抑制大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生的影响。方法8～10周龄SD大鼠,分为雄性组和雌性组,每组21只,各组又平分为3个亚组去势对照组,雌二醇组,他莫昔芬组。应用F2.0经皮腔内冠状动脉成形术(PTCA)球囊导管损伤血管内膜。2周后处死动物,取出左、右颈总动脉作切片观察。结果雄性组内膜面积、内膜面积／肌层面积值,雌二醇组均小于去势对照组(均P<0．05);他莫昔芬组与去势对照组无显著性差异(均P>0．05)。雌性组内膜面积、内膜面积／肌层面积值,雌二醇组均小于去势对照组(均P<0．05),而他莫昔芬组与去势对照组相比亦无统计学差异(均P>0．05)。结论雌二醇对去势雄性、雌性大鼠颈总动脉损伤后均有抑制内膜增生作用;他莫昔芬拮抗雌二醇的作用,提示雌二醇通过受体抑制内膜增生。     

外加低压稳恒直流电场对兔腹主动脉球囊损伤后血管新生内膜增生的影响

目的探讨外加低压稳恒直流电场对血管损伤后新生内膜增生的影响。方法健康日本大耳白兔65只,随机分为正常对照组、假手术组以及实验组,其中实验组分为3．0V,4．0V两个亚组。建立兔腹主动脉球囊损伤模型后,在兔腹主动脉两侧腰大肌内埋植一对铂电极,实验组给予电刺激（3．0V／cm或4．0V／cm,30min／d）。于术后1周、2周及4周留取血管标本,HE染色观察血管新生内膜增生情况,天狼猩红染色及Western blot观察血管损伤后I型、Ⅲ型胶原蛋白的表达。结果血管内膜损伤后1周,实验组与假手术组之间内,中膜面积比无显著差异。血管内膜损伤后2周及4周,3．0V实验亚组和4．0V实验亚组内,中膜面积比显著低于假手术组（P〈0．01）。3．0V和4．0V实验亚组之间差异无统计学意义（P〉0．05）。天狼猩红染色显示术后4周,3．0V实验亚组和4．0V实验亚组的血管新生内膜中Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达低于假手术组。Western blot结果显示术后4周,实验组Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达与假手术组相比,差异无统计学意义。结论适宜的外加稳恒直流电场抑制血管损伤后新生内膜的增生,同时抑制新生内膜Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的表达,但对血管壁总Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白表达无影响。     

反义血管紧张素Ⅱ受体Ⅰ_B基因转移对大鼠颈动脉损伤后新生内膜的影响

目的　探讨腺病毒载体介导的大鼠反义血管紧张素Ⅱ受体ⅠB(AT1B)RNA转移对大鼠颈动脉损伤后新生内膜的影响。方法　利用重组腺病毒载体将大鼠反义AT1B RNA转移至大鼠颈动脉球囊损伤模型中 ,2 1天后观察其对新生内膜形成的影响。结果　用腺病毒载体转导大鼠反义AT1BRNA至大鼠球囊损伤的颈动脉 ,与对照组相比 ,2 1天后损伤血管新生内膜 /中层面积比降低了 4 7%(P <0 0 0 1)。结论　反义AT1BRNA对血管成形术后再狭窄可能有一定的预防作用。     

Fas配体基因导入对大鼠颈动脉损伤后新生内膜的影响

目的 :探讨腺病毒载体介导 Fas配体 （Fas L）基因导入对大鼠颈动脉损伤后新生内膜的影响。方法 :利用重组腺病毒载体将 Fas L 导入大鼠颈动脉球囊损伤的内膜 ,14d后观察其对新生内膜形成的影响。结果 :通过腺病毒载体介导导入 Fas L 基因的被球囊损伤的大鼠颈动脉 ,与 Ad- β gal基因的对照组相比较 ,14d后损伤血管新生内膜 /中膜面积比降低了 73%（P<0 .0 1）。结论 :Fas L 可抑制新生内膜的增生。     

Roscovitine抑制大鼠颈总动脉球囊损伤后内膜增生的研究

目的:观察roscovitine对球囊损伤后大鼠颈总动脉血管平滑肌细胞及内膜增生的抑制作用,以期提供新型的支架涂层药物。方法:建立大鼠颈总动脉球囊损伤模型模拟经皮冠状动脉腔内介入术(PCI)术后再狭窄,干预组损伤局部给予roscovitine(200μmol/L)孵育10分钟。14天后取材,免疫荧光染色观察roscovitine对局部血管平滑肌细胞增殖的作用;HE染色观察roscovitine对内膜增生的作用。结果:本研究建立了大鼠颈总动脉球囊损伤模型,球囊损伤后14天,局部血管平滑肌细胞增殖活跃、内膜增生明显。Roscovitine干预后,血管平滑肌细胞增殖率明显降低,内膜增生被显著抑制,管腔狭窄率和内膜中膜面积比值显著降低。结论:Roscovitine显著抑制大鼠颈总动脉球囊损伤后局部血管平滑肌细胞增殖,进而有效抑制内膜增生,降低再狭窄发生率。     

大鼠血管紧张素Ⅱ2型受体基因转染对颈动脉球囊损伤后新生内膜形成的影响

目的　探讨腺病毒载体介导的大鼠血管紧张素Ⅱ2型受体(AT2R)基因转染对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜形成的影响。方法　应用带有绿色荧光蛋白报告基因的重组腺病毒载体将大鼠AT2R基因转移至颈动脉球囊损伤模型中,2 1d后取材,应用免疫组织化学方法检测AT2R在动脉壁中的表达,图像分析观察其对新生内膜形成的影响。结果　在体大鼠颈动脉腺病毒载体的转染率达4 0 % ,AT2R基因在血管壁的新生内膜、中膜、外膜稳定表达,转染AT2R基因的球囊损伤后颈动脉与绿色荧光蛋白基因对照组相比,血管新生内膜 中膜面积比降低了4 8%。结论　AT2R基因转染可抑制颈动脉球囊损伤后新生内膜的形成,对血管成形术后再狭窄可能有一定的预防作用。     

Kindlin-2 RNA干扰减轻大鼠颈动脉内膜增生

目的观察Kindlin-2 RNA干扰对球囊损伤的大鼠颈动脉内膜增生的影响。方法构建并制备Kindlin-2 siRNA和阴性对照慢病毒载体并感染球囊损伤的大鼠颈动脉,1周和4周后取损伤的颈动脉,实时定量PCR检测Kindlin-2 mRNA的表达,HE染色评估术后4周颈动脉内膜增生情况,并行免疫荧光或免疫组化检测颈动脉中Kindlin-2、α-actin、PCNA和β1整合素的表达,Masson染色了解颈动脉中胶原纤维合成情况。结果 Kindlin-2RNA干扰能明显降低1周时颈动脉中Kindlin-2 mRNA的表达水平(P0.05),并显著抑制4周后颈动脉的内膜增生(P0.05)。与阴性对照组相比,Kindlin-2 siRNA组术后4周颈动脉中Kindlin-2、α-actin、PCNA和β1整合素的表达水平均明显降低,颈动脉内膜和中膜胶原纤维的合成也减少。结论 Kindlin-2 RNA干扰可能通过抑制血管平滑肌细胞增殖、迁移和细胞外基质合成减轻血管内膜增生。     

逆转录病毒载体介导的端粒酶抑制基因促进肝癌细胞凋亡

目的:探讨逆转录病毒载体介导的反义端粒酶抑制基因对肝癌细胞系BEL-7402的凋亡诱导作用.方法:用电穿孔的方法把正、反义端粒酶抑制基因导入包装细胞,包装出完整的病毒,用此病毒感染肝癌细胞系BEL-7402,绘制细胞生长曲线来研究其抗肿瘤疗效.应用MTT、流式细胞术研究细胞凋亡情况.结果:肿瘤细胞感染逆转录病毒后,肿瘤生长受到明显抑制,转染反义hTR病毒组BEL-7402细胞凋亡率显著高于转染正义hTR病毒和生理盐水组(61.32%±2.24%vs23.02%±2.13%,4.11%±1.00%,P<0.01),转染反义hTR与5-FU联用细胞凋亡率更高,为71.71%±2.53%.结论:反义端粒酶抑制基因能明显抑制肿瘤细胞的体外生长,与抗肿瘤药物5-FU有协同作用,联合用药可以增强疗效,具有明显抗肿瘤作用.     

Effects of adenovirus-mediated human cyclooxygenase-2 antisense RNA on the growth of hepatocellular carcinoma

AIM: To investigate the relation between the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) and liver cancer, to construct the recombinant adenovirus encoding human COX-2 antisense RNA, and to explore its effects on liver cancer cell proliferation. METHODS: We studied the expression of COX-2 in 34 cases of hepatocellular carcinoma (HCC) and SMMC7402 and SMMC7721 by immunohistochemical technique. Recombinant adenovirus Ad-AShcox-2 was constructed and transfected into human HCC cell lines SMMC7402 and SMMC7721, and its effects on COX-2 expression, cell apoptosis and cell cycle were analyzed by flow cytometry. Cell proliferation was determined by colony-forming efficiency. RESULTS: We observed COX-2 expression in 82.4% of HCC and SMMC7402 cells, but no COX-2 expression in SMMC7721 cells. In addition, recombinant adenovirus encoding antisense COX-2 fragment Ad-AShcox-2 was obtained with the titer of 1.06×1012PFU/mL. Ad-AShcox-2 could reduce the expression of COX-2 and enhance the percentage of cells in G1/G0 phase in SMMC7402 cell line. The difference of apoptotic index between the Ad-AShcox-2 group and control group was statistically significant (tcontrol group=32.62 and tAd-Lacz = 10.93, P<0.001) in SMMC7402 but not in SMMC7721. Similarly, colony-forming rates of SMMC7402 and SMMC7721 cell lines, after the transfer of Ad-AShcox-2, were (2.7±0.94)% and (33.6±4.24)%, respectively. CONCLUSION: Reduction in the expression of COX-2 can inhibit COX-2 expressing HCC cells.