胰岛素对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨胰岛素对子宫内膜癌细胞系Ishikawa3-H-12细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法 应用免疫细胞化学方法和RT-PCR技术检测Ishikawa3-H-12细胞胰岛素受体（INSR）蛋白和mRNA的表达。以不同浓度胰岛素作用Ishikawa3-H-12细胞不同时间,采用四甲基偶氮唑蓝比色法、流式细胞仪检测细胞增殖、凋亡和细胞周期。结果 （1）Ishikawa3-H-12细胞INSR蛋白呈棕黄色阳性表达,并可见INSR基因的表达。（2）胰岛素以浓度和时间依赖的方式促进子宫内膜癌细胞增殖,1×10^-4mol／L胰岛素作用48h时促增殖作用最显著,增殖率为（340．2±15．9）％,与对照细胞（以胰岛素浓度为0作为对照,为100％）比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。（3）胰岛素以浓度和时间依赖的方式使Ishikawa3-H-12细胞中G0／G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,1×10^-4mol／L胰岛素作用72h时最显著,G0／G1期细胞比例为（27．7±2．5）％,S期细胞为（55．2±1．4）％,分别与对照细胞[分别为（67．6±1．5）％、（15．7±1．0）％]比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）;胰岛素对G2／M期细胞无影响（P〉0．05）。（4）随着胰岛素浓度的增加,Ishikawa3-H-12细胞凋亡率逐渐下降。1×10^-4mol／L胰岛素作用最显著,作用24、48、72、96h时的细胞凋亡率分别为（1．76±0．16）％、（1．70±0．15）％、（1．56±0．20）％、（1．31±0．24）％,分别与对照细[分别为（9．81±0．61）％、（9．93±1．44）％、（9．10±0．66）％、（10．30±1．20）％]比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论 胰岛素对子宫内膜癌Ishikawa3-H-12细胞具有促进增殖、抑制凋亡的作用。     

BRMS1基因抑制卵巢上皮性癌细胞体内外转移的实验研究

目的 研究BRMS1基因转染卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞后对其体内外转移的抑制作用。方法 应用脂质体介导法将BRMS1基因转染人卵巢癌细胞株A2780细胞内（转染组）,设未进行任何转染的A2780细胞为空白对照组,转染空载体pcDNA3质粒者为阴性对照组。体外观察转染前后3组细胞增殖、凋亡、细胞间缝隙通讯连接、黏附转移情况及超微结构的变化。建立裸鼠人卵巢癌移植瘤模型,观察3组裸鼠BRMS1基因抑制肿瘤体内转移的作用。结果 BRMS1基因成功转染入A2780细胞中。BRMS1基因转染后,空白对照组细胞生长速度与阴性对照组和转染组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;空白对照组、阴性对照组及转染组细胞的每孔克隆数分别为（42±7）、（39±4）及（40±4）个,3组间比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;3组细胞S期和G：／M期、Gn／G,期比例比较,差异也无统计学意义（P〉0．05）。转染组细胞问缝隙通讯连接功能增强。细胞侵袭实验显示,转染组转入底层膜的细胞数[（112±23）个]明显低于空白对照组和阴性对照组[分别为（306±49）、（322±91）个;P〈0．01]。BRMS1基因转染后,裸鼠体内转移灶,转染组为（23±7）个,分别与空白对照组和阴性对照组[分别为（96±12）、（112±20）个]比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论 作为转移抑制基因,BRMS1基因可抑制卵巢癌细胞的转移。     

趋化因子CXCL12及其受体CXCR4对卵巢上皮性癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的 探讨趋化因子CXCL12及其受体CXCR4对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法采用RT—PCR技术和免疫细胞化学染色法检测卵巢癌细胞株CAOV3细胞中CXCL12、CXCR4mRNA和蛋白的表达,以及CXCL12（100ng／m1）作用后CAOV3细胞中整合素B1和血管内皮生长因子C（VEGF—C）mRNA的表达。实验分为6组：对照组（未加药）,实验组1（加100ng／ml的CXCL12）,实验组2（加10ng／ml的CXCL12）,实验组3（加100ng／ml的CXCL12和10斗g／ml的CXCR4抗体）,实验组4（加100ng／ml的CXCL12和1pg／ml的CXCR4拮抗剂——AMD3100）,实验组5（加10μg／ml的CXCR4抗体或卵巢癌腹水）。采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测CXCL12对CAOV3细胞增殖的影响。以穿膜小室为模型,采用重组细胞基底膜迁移、侵袭实验检测CXCL12和卵巢癌腹水对CAOV3细胞迁移、侵袭的影响。结果 CAOV3细胞中,CXCR4蛋白呈棕黄色强阳性表达,CXCR4mRNA的表达水平为0．70±0．10,经100ng／ml的CXCL12作用24h时CXCR4mRNA的表达水平（1．24±0．14）显著增加（t=-7．1088,P=0．0021）;CXCL12蛋白和mRNA均无表达。100ng／ml的CXCL12作用3h时整合素131mRNA表达水平即显著增加（作用前后分别为0．53±0．10、1．53±0．16,P〈0．01）,24h时VEGF—CmRNA表达水平显著增加（作用前后分别为0．52±0．09、1．11±0．15,P〈0．01）。对CAOV3细胞的增殖作用,实验组1分别与对照组和实验组2比较均明显增强（3组分别为0．428±0．051、0．325±0．045、0．328±0．039,P〈0．05）;实验组1分别与实验组3和实验组4比较均明显被抑制（后两组分别为0．356±0．031、0．373±0．029,P〈0．05）;而实验组5（0．349±0．038）与对照组比较,差异则无统计学意义（P〉0．05）。对CAOV3细胞的迁移和侵袭作用,实验组1分别与对照组和实验组2比较均明显增强[迁移细胞数分别为（523．3±25．2）、（108．0±7．2）、（211．7±24．7）个,侵袭细胞数分别为（39．3±4．0）、（4．0±1．0）、（15．7±3．1）个;P均〈0．01];实验组1分别与实验组3和实验组4比较均明显被抑制（P〈0．05）;但实验组5[即加入卵巢癌腹水组;迁移细胞数为（706．6±30．6）个,侵袭细胞数为（61．7±7．6）个]显著多于实验组1（P〈0．05）。结论 CXCL12可促进卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭,并上调整合素B1和VEGF—CmRNA的表达,此作用可被CXCR4抗体抑制,表明CXCL12在卵巢癌的生长和转移中发挥一定作用。     

靶向调控的活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3联合细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂flavopiridol对卵巢上皮性癌的治疗作用

目的 观察人端粒酶逆转录酶启动子-二步转录增强系统调控下表达活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的重组腺病毒AdHTVP2G5-rev-casp3联合细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂flavopiridol对卵巢上皮性癌(卵巢癌)的治疗作用.方法 应用活细胞计数法--细胞计数试剂盒8(CCK-8)、流式细胞仪和蛋白印迹法(western blot)检测AdHTVP2G5-rev-casp3联合flavopiridol作用后卵巢癌AO细胞的细胞存活率、凋亡率、细胞周期和细胞中活性caspase-3片段p17及其底物聚(腺苷二磷酸-核糖)多聚酶的裂解片段p85的表达情况;观测AdHTVP2G5-rev-casp3联合flavopiridol治疗前后荷卵巢癌裸鼠生存情况、移植瘤体积、肝酶水平及各器官组织的病理检查结果.结果 AdHTVP2G5-rev-casp3[感染复数(MOI)=5～20]或flavopiridol(300 nmol/L)单独作用均不引起AO细胞的显著凋亡,凋亡率均＜11%;联合应用能产生显著的协同杀伤作用,当两者分别以MOI=20、300 nmol/L联合作用时,细胞存活率为11.6%,凋亡率为73.5%,该协同作用在AdHTVP2G5-rev-casp3感染细胞后72 h再加入flavopiridol作用48 h最为显著.低剂量(MOI=10)的AdHTVP2G5-rev-casp3能引起细胞的S期比例显著增高(62.5%).两者联合作用后的AO细胞中p17和p85的表达水平也显著高于两者单独作用时.单独应用AdHTVP2G5-rev-casp3或flavopiridol均可延长荷瘤裸鼠的生存时间[分别为(141±14)、(134±10)d]并抑制肿瘤生长(抑瘤率分别为30%、40%),但两者联合应用具有协同作用,裸鼠生存时间可达(286±6)d,抑瘤率为81%.两者联合应用后裸鼠的肝酶水平无显著升高,肝等各器官组织的HE染色病理检查未见异常.结论 低剂量的活性caspase-3可引起卵巢癌细胞在S期的募集,从而增强细胞对flavopiridol的敏感性;低剂量的活性caspase-3联合flavopiridol对卵巢癌细胞具有显著的协同杀伤作用,能显著抑制移植瘤的生长并延长荷瘤裸鼠的生存期,并降低flavopiridol对肝脏的毒性作用.     

PTEN基因逆转卵巢上皮性癌细胞耐药的机制研究

目的通过检测PTEN基因在卵巢上皮性癌（卵巢癌）顺铂敏感细胞株0V2008及0V2008配对的顺铂耐药细胞株C13K中的表达,探讨转染PTEN基因能否逆转C13K细胞对顺铂的耐药及其相关机制。方法半定量RT-PCR技术和蛋白印迹法检测0V2008和C13K细胞中PTENmRNA和蛋白的表达。将野生型PTEN基因真核表达质粒在脂质体介导下转染C13K细胞,同时以转染空载体和未转染的C13K细胞作为对照,分别应用RT-PCR技术检测各组细胞PTENmRNA表达的变化,应用蛋白印迹法检测各组细胞PTEN、蛋白激酶B（AKT）及磷酸化AKT（p-AKT）蛋白表达的变化;四甲基偶氮唑蓝（M1Tr）比色法观察转染PTEN基因后C13K细胞对顺铂敏感性的变化,流式细胞仪分析顺铂作用后的细胞凋亡情况。结果（1）PTENmRNA在0V2008和C13K细胞中的表达水平分别为1．02±0.05和0．45±0.03,而0V2008、C13K细胞中PTEN蛋白的表达水平分别为1.02±0.07、0．55±0．03,两种细胞PTENmRNA和蛋白的表达水平分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（2）PTEN基因转染48h后,C13K细胞中PTENmRNA、蛋白的表达水平分别为2.04±0．10和0．94±0．04,分别与转染空载体和未转染的C13K细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）;p-AKT蛋白的表达水平（0.94±0．07）较转染空载体（1．66±0．10）和未转染（1．68±0．14）的C13K细胞显著降低（P〈0．05）。（3）转染PTEN基因的C13K细胞对顺铂的半数抑制浓度（IC50）为（7.2±0．3）μmol／L,明显高于转染空载体和未转染的C13K细胞[分别为（12．7±0．4）、（13．0±0．3）μmol／L,P〈0,05]。（4）顺铂作用24h后,转染PTEN基因、转染空载体和未转染的C13K细胞的凋亡率分别为（41.7±0.9）％、（18．6±0．7）％和（15,3±0．8）％,前者明显高于后两者（P〈0．01）。结论PTEN基因在0V2008细胞中的表达明显高于C13K细胞。转染野生型PTEN基因能有效提高C13K细胞内PTEN基因的表达,并通过降低C13K细胞中AKT磷酸化的水平恢复C13K细胞对顺铂的敏感性。     

人端粒酶逆转录酶启动子-二步转录增强系统调控下的活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的构建及其对卵巢上皮性癌的治疗作用

目的构建含人端粒酶逆转录酶启动子．二步转录增强系统（hTERTp．TSTA）调控下的活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（rev-caspase-3）的重组腺病毒AdHTVP2G5-rev-casp3,并检测其对卵巢上皮性癌（卵巢癌）的治疗作用。方法采用基因重组法构建AdHTVP2G5-rev-casp3,经DNA测序鉴定并证实其序列正确。实验分为4组：分别以AdHTVP2G5-rev-casp3（AdHTVP2G5-rev-casp3组）、含hTERTp调控下的rev—caspase-3的重组腺病毒AdHT-rev-casp3（AdHT-rev-casp3组）和含人巨细胞病毒启动子（CMVp）调控下的rev—caspase-3的重组腺病毒Ad—rev—casp3（Ad-rev-casp3组）转染人卵巢癌细胞系AO细胞及正常人脐静脉内皮细胞系HUVEC细胞,以含hTERTp-TSTA调控下的增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组腺病毒AdHTVP2G5-EGFP（AdHTVP2G5-EGFP组）为阴性对照。采用蛋白印迹法（westernblot）、细胞计数法（CCK-8）、流式细胞术分别检测各组AO和HUVEC细胞中caspase-3的活性单位p17蛋白及其底物聚腺苷二磷酸-核糖多聚酶的裂解片段p85蛋白的表达强度、细胞存活率、细胞凋亡率和细胞周期的变化;westernblot法检测各组裸鼠移植瘤及肝脏组织中p17蛋白的表达强度,检测各组裸鼠生存率、肿瘤体积、体内肝酶水平及各器官组织的病理检查结果。结果AO细胞中p17蛋白表达强度,AdHTVP2G5-rev—casp3组明显高于Ad-rev-casp3和AdHT-rev-casp3组;而HUVEC细胞中AdHTVP2G5-rev-casp3组则明显低于Ad—rev—casp3,与AdHT-rev-casp3组相似。当病毒感染复数（UOI）为70时,AO细胞的存活率和凋亡率,AdHTVP2G5．rev—casp3组（分别为17．8％和40．2％）与AdHT—rev—casp3组（分别为75．2％和16．1％）比较,差异有统计学意义（P〈0．01）;而HUVEC细胞的存活率和凋亡率,AdHTVP2G5．rev—casp3组（分别为97．7％和2．1％）与AdHT-rev-casp3组（分别为98．5％和1．7％）比较,差异则无统计学意义（P〉0．05）。荷瘤裸鼠肿瘤组织中p17蛋白的表达强度,AdHTVP2G5-rev—casp3组最高,Ad-rev-casp3组次之,AdHT—rev-casp3组最弱;而其肝脏组织中p17蛋白的表达强度,Ad-rev—casp3组最高（与其在肿瘤组织中相似）,其他各组几乎无p17蛋白表达。荷瘤裸鼠的生存时间,AdHTVP2G5-rev-casp3和Ad-rev-casp3组分别为（259±14）和（213±16）d,明显长于AdHT—rev—casp3和AdHTVP2G5-EGFP组的（177±12）和（109±7）d（P〈0．01）。荷瘤裸鼠的肿瘤体积,用药53d后AdHTVP2G5-rev-casp3组（为406mm^3）明显小于AdHT-rev-casp3、Ad—rev—casp3和AdHTVP2G5-EGFP组（分别为990、645、1728mm^3;P〈0．01）。荷瘤裸鼠体内的肝酶水平,Ad—rev—CaS．p3组明显高于其他各组（P〈0．01）。各组荷瘤裸鼠的肝脏及其他器官组织经HE染色显示均无明显变化。结论hTERTp-TSTA系统调控下的rev—caspase-3致细胞凋亡的能力明显强于hTERTp,并同时保证了被作用肿瘤的靶向性,在明显抑制卵巢癌移植瘤的生长并延长荷瘤裸鼠生存时间的同时降低了凋亡基因对肝脏的毒性作用。     

促肾上腺皮质激素释放激素、c-Fos及间隙连接蛋白43与分娩发动的相关性

目的探讨促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、c—Fos和间隙连接蛋白43（Cx43）在足月妊娠子宫平滑肌细胞中的表达变化及其与分娩发动的相关性。方法选择2006年2—9月在中南大学湘雅二医院住院的足月临产产妇30例（临产组）,足月未临产产妇30例（未临产组）,因宫颈上皮内瘤样病变行子宫切除术患者30例（对照组）。应用放射免疫方法测定3组妇女静脉血中CRH的水平;用核酸原位杂交技术和免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（SP）法检测3组妇女子宫平滑肌细胞中c—Fos、Cx43 mRNA及其蛋白的表达水平。结果（1）CRH水平在临产组产妇为（81．8±11．9）pmol／L,未临产组为（34．5±18．6）pmol／L,对照组为（1．3±0．7）pmol／L,临产组明显高于未临产组及对照组,未临产组明显高于对照组,差异均统计学意义（P〈0．05）。（2）c—Fos mRNA及其蛋白的阳性染色主要定位于子宫平滑肌细胞核内,少量位于细胞质内;子宫平滑肌细胞中c—Fos mRNA及其蛋白表达水平,临产组分别为5．4±1．7及5．4±1．5,未临产组分别为4．1±0．9及3．9±0．9,对照组分别为1．0±0．4及1．2±0．4,临产组明显高于未临产组及对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）;未临产组也明显高于对照组（P〈0．05）。（3）Cx43 mRNA及其蛋白的阳性染色定位于子宫平滑肌细胞质内;子宫平滑肌细胞中Cx43 mRNA及其蛋白表达水平,临产组分别为5．5±1．4及5．6±1．3,未临产组分别为4．1±0．6及4．1±0．5,对照组分别为1．5±0．6及1．1±0．6,临产组明显高于未临产组及对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）;未临产组也明显高于对照组（P〈0．05）。（4）3组妇女的CRH水平与子宫平滑肌细胞中c—Fos mRNA及其蛋白的表达水平呈明显正相关（r5=0．61,r6=0．50;P〈0．05）;与子宫平滑肌细胞中Cx43 mRNA及其蛋白的表达水平呈明显正相关（r3=0．52,r4=0．68;P〈0．05）;子宫平滑肌细胞中c—Fos mRNA及其蛋白的表达水平与Cx43 mRNA及其蛋白的表达水平也呈明显正相关（r5=0．51,r6=0．60;P〈0．05）。结论产妇血浆中CRH水平、子宫平滑肌细胞中c—Fos和Cx43的表达与分娩发动有一定的关系,且3者间水平变化均呈明显正相关。     

MDR1及MDR3基因沉默逆转卵巢上皮性癌细胞对紫杉醇耐药的实验研究

目的 研究多药耐药基因——MDR1及MDR3基因沉默逆转卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞A2780／taxol对紫杉醇耐药的作用。方法 用真核质粒介导的针对MDR 1及MDR3基因的短发夹状RNA（shRNA）转染A2780／taxol细胞（分别为MDR1组、MDR3组）,空质粒转染作为对照（空载体组）。流式细胞仪分别检测细胞早期凋亡、罗丹明123（Rh123）积聚情况,末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法（TUNEL）检测细胞晚期凋亡情况,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞对紫杉醇的半数抑制浓度（IC50）,RT-PCR技术检测MDR1及MDR3mRNA的表达,蛋白印迹法（western blot）检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）蛋白的表达。结果转染后,MDR1组及MDR3组A2780／taxol细胞的早期凋亡率分别达（20．21±0．56）％和（10．87±1．24）％。MDR1、MDR3组A2780／taxol细胞内的Rh123平均荧光强度分别为116．6±8．1、98．4±3．8,显著高于空载体组的40．2±1．6,差异有统计学意义（P〈0．05）。TUNEL检测显示细胞发生了晚期凋亡。MDR1、MDR3组A2780／taxol细胞对紫杉醇的IC50明显下降,分别与空载体组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。转染48h后,A2780／taxol细胞中MDR1和MDR3mRNA的表达水平分别下降了（73．3±0．8）％和（51．6±0．4）％;MDR1、MDR3组细胞caspase-3的表达量分别为（80．8±2．6）％、（72．0±4．7）％,均较空载体组增加。结论 MDR1及MDR3基因沉默能恢复A2780／taxol细胞对紫杉醇的敏感性并诱导细胞凋亡,从而逆转A2780／taxol细胞对紫杉醇的耐药性。     

Edg4基因小分子干扰RNA载体的构建及其对卵巢上皮性癌细胞的沉默效应

目的构建针对Edg4基因的小分子干扰RNA（siRNA）载体,初步观察其对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞的沉默效应。方法利用软件分析、设计针对人Edg4 mRNA的siRNA靶序列,合成发夹样DNA序列;退火成双链,克隆至真核表达载体pRNAT—U6．1质粒上,经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实其序列无误后,用脂质体包裹并转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,用荧光显微镜初步观察其在SKOV3细胞中的转染率。采用实时荧光定量荧光定量PCR技术检测转染前后SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,生化法测定转染前后SKOV3细胞上清液中溶血磷脂酸（LPA）含量的变化,流式细胞术检测转染后SKOV3细胞的凋亡率。结果经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实重组真核表达载体的序列无误,并将此命名为pRNAT—U6．1—siEdg4。荧光显微镜下观察,转染后SKOV3细胞内有明显绿色荧光信号,转染率为64％;实时荧光定量PCR技术检测显示,转染后SKOV3细胞的Edg4 mRNA表达水平（0．05±0．01）明显低于转染前（0．29±0．04,P〈0．05）;SKOV3细胞上清液中LPA的含量,转染后明显低于转染前[分别为（3．0±1．0）、（7．5±2．2）μmol／L;P〈0．05];流式细胞仪检测显示,转染后SKOV3细胞的凋亡率明显高于转染前（分别为53．38％、0．51％;P〈0．05）。结论本研究成功构建了针对人Edg4基因的siRNA真核表达载体,并能较高效转染SKOV3细胞,转染后能明显抑制SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,诱导卵巢癌细胞凋亡。     

小分子细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制剂flavopiridol联合泰素治疗卵巢癌的实验研究

目的:检测flavopiridol联合泰素对人卵巢癌细胞系SKOV3、裸鼠人卵巢癌皮下及腹腔移植瘤模型的治疗作用。方法:应用CCK-8法、流式细胞术和原位细胞凋亡检测法(TUNEL)检测flavopiridol和泰素作用后卵巢癌细胞系SKOV3的细胞存活率和凋亡率;应用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)检测作用前后细胞中cyclinD1的表达:应用ELISA法检测细胞中活性caspase-3的表达。建立裸鼠人卵巢癌皮下及腹腔移植瘤模型,观测flavopiridol和泰素治疗前后裸鼠肿瘤体积的变化并计算抑瘤率,用TUNEL和免疫组化法分别检测作用前后肿瘤组织中的凋亡情况和微血管密度(MVD)值。结果:flavopiri-dol(300nmol/L)或泰素(1μmol/L)单独应用24h均能显著降低细胞存活率,增强caspase-3活性,诱导细胞凋亡,并下调细胞中cyclinD1的表达。Taxol先作用24h再用flavopiridol作用24h的联合用药对二者的上述作用产生显著的协同效应:联合用药后细胞存活率为(5.2±0.8)%,凋亡率为(51.10±2.52)%,caspase-3活性相对值为0.602±0.008,cy-clinD1相对表达水平为0.264±0.076。Flavopiridol和泰素单独应用均能显著抑制皮下移植瘤生长(抑瘤率分别为84.5%和85.7%),并降低肿瘤组织MVD值(分别为12.4±4.7vs 35.2±10.3和15.2±2.9 vs 35.2±10.3)。二者联合应用抑瘤作用稍差(抑瘤率68.9%),抑制MVD作用(23.0±5.1 vs 35.2±10.3)也不及单药治疗。结论:Flavopiridol和泰素均能通过致凋亡作用显著抑制卵巢癌细胞及移植瘤生长,二者联合应用对体外培养的卵巢癌细胞具有协同杀伤作用,但体内治疗中无协同抑瘤作用。     

活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3分子的构建及其致卵巢上皮性癌细胞凋亡的实验研究

目的 构建能自我激活的活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3分子,并探讨其对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞的致凋亡作用.方法利用基因重组技术构建活性caspase-3分子--rev-caspase-3及其重组腺病毒--Ad-rev-casp3;应用免疫组化方法、细胞计数试剂盒8、流式细胞仪和蛋白印迹法分别检测rev-caspase-3作用后卵巢癌细胞系AO细胞中活性caspae-3蛋白的表达情况、细胞存活率、凋亡率、细胞周期、caspase-3活性亚单位p17和聚(腺苷二磷酸-核糖)多聚酶(PARP)的分解产物p85的表达水平,应用透射电镜观察rev-caspase-3作用后细胞的超微结构,实时PCR技术检测细胞中凋亡相关基因的表达情况;建立卵巢癌裸鼠皮下及腹腔移植瘤模型,观测rev-caspase-3作用后裸鼠生存情况及肿瘤体积的变化.结果 Ad-rev-casp3作用后的AO细胞中显著表达活性caspase-3蛋白,细胞质明显棕染;细胞中活性caspase-3亚单位p17和PARP裂解片段p85的表达水平升高.Ad-rev-casp3以感染复数(MOI)为70作用后的AO细胞存活率为30.3%,凋亡率为40.2%.Ad-rev-casp3以MOI=10作用后的细胞凋亡率只为3.4%,但此时S期细胞比例高达56.5%,G1期比例下降至9.8%,与未感染Ad-rev-casp3(MOI=0)的AO细胞的S期和G1期比例显著不同(P均＜0.05).Ad-rev-casp3作用后的AO细胞呈现显著的凋亡形态改变,电镜下见明显的凋亡小体形成;细胞中活性caspase-3基因的表达水平显著升高,为9.44.Ad-rev-casp3能显著延长荷瘤裸鼠的生存期,平均生存时间为(213±16)d,并显著抑制移植瘤的生长,在第1次注射后53 d时抑瘤率为70%.结论 表达rev-caspase-3的重组腺病毒载体对卵巢癌细胞有强烈的致凋亡作用,并可显著延长荷瘤裸鼠的生存期,抑制肿瘤生长.     

Sequential combination therapy with flavopiridol and autocatalytic caspase-3 driven by amplified hTERT promoter synergistically suppresses human ovarian carcinoma growth <Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis> and in mice

Background

Induction of cell apoptosis and regulation of cell cycle are very attractive for treatments of tumors including ovarian carcinoma. Flavopiridol is a potent small molecular cyclin-dependent kinase(cdk) inhibitor, but its antitumor efficacy is not satisfied yet. Caspase-3 play a major role in the transduction of apoptotic signals and the execution of apoptosis in mammalian cells. We have successfully constructed the recombinant adenovirues AdHTVP2G5-rev-casp3 containing autocatalytic caspase-3 (rev-caspase-3) driven by amplified hTERT promoter system (TSTA-hTERTp). In this study, we applied it with flavopiridol to investigate their antitumor effect on ovarian cancer in vitro and in vivo.

Methods

Cell viabilities were determined using Cell Counting Kit 8 and flow cytometry. RT-PCR and immunoblotting assays were used to detect cellular apoptotic activities. Tumor growth and survival of mice bearing tumors were studied.

Results

Flavopiridol or AdHTVP2G5-rev-casp3 at low dosage alone was mildly cytotoxic in vitro with a viability rate of 86.5?±?4.7% for 300 nM flavopiridol and 88.9?±?5.4% for AdHTVP2G5-rev-casp3 (MOI 20). By contrast, significant synergism of their sequential combination was observed, and the treatment of AdHTVP2G5-rev-casp3 (MOI 20) infection for 72 h, followed by flavopiridol (300 nM) for 48 h, can result in the most synergistic cell death, with cell survival rate and apoptotic rate of 11.6% and 69.7%, respectively. The sequential combination showed synergistic tumor suppression rate of 77.8%, which was significantly higher than that of AdHTVP2G5-rev-casp3 (33.6%) or flavopiridol (40.1%) alone. The mean survival of mice treated with the combination was 286?±?8 d, which was synergistically longer than that of mice treated with AdHTVP2G5-rev-casp3 (141?±?14d), flavopiridol (134?±?10 d) or controls (106?±?11 d) (P?<?0.01).

Conclusions

The sequential combination of rev-caspase-3 and flavopiridol result in significant synergistic cell killing effects, significant tumor growth suppression and extended survival of mice bearing OVCAR3 cells. The combination should be further explored as a potential clinically useful regimen against ovarian cancer.

     

Synergistic antitumor effect of tumor necrosis factor–related apoptosis-inducing ligand combined with cisplatin in ovarian carcinoma cell lines in vitro and in vivo

Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) has been shown to exert selectively cytotoxic activity against many tumor cells but not normal cells. In this study, we evaluated the antitumor activity of TRAIL and cisplatin (CDDP) both separately and combined in the human ovarian cancer cell lines. In vitro study showed that TRAIL elicited significant cell apoptosis of cell lines 3AO, SKOV3, and OVCAR3 in a dose- and time-dependent manner (P < 0.05), while normal ovarian epithelial cells were resistant; this toxicity-free effect may be the result of upregulation of TRAIL receptors DcR1 and DcR2. Combined TRAIL and CDDP therapy produced more profound cell killing in 3AO cells than each alone (P < 0.05), and CDDP could upregulate the expression of both death and decoy TRAIL receptors. To further evaluate the apoptosis-inducing effects of TRAIL and the combination therapy, the abdominally and subcutaneously spread tumors in nude mice via inoculation of 3AO cells were established, and treatment of TRAIL resulted in a dose- and time-dependent inhibition of tumor growth while slight damage was observed in normal tissues. Furthermore, combined TRAIL and CDDP therapy had a synergistic effect in the regression of established ovarian cancer xenografts than TRAIL treatment alone (P < 0.05). We also examined the apoptosis-related gene expression in the transplantation tumors after TRAIL treatment, and the data suggested that the intracellular mechanism of TRAIL may be associated with downregulation of Bcl-2 and upregulation of CD95 and Apo2.7.     

Differential induction of apoptosis by tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in human ovarian carcinoma cells

OBJECTIVES: In this study, we examine the sensitivity of a panel of ovarian carcinoma cells, which includes four primary ovarian cancer cell samples, and four normal ovarian epithelium samples to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). We also examine the intracellular regulation of TRAIL-mediated apoptosis. METHODS: The sensitivity to TRAIL was determined by short-term survival assays on seven ovarian carcinoma cell lines, four primary samples of ovarian cancer, and four normal ovarian epithelium samples. We assessed the activation of the apoptotic pathway in TRAIL-resistant and -sensitive tumor cells. The expression of TRAIL receptors was determined by flow cytometry. The protein expression of FADD, XIAP, caspase-8, caspase-3, BAX, and c-FLIP were determined by immunoblot analyses. RESULTS: We show that ovarian cancer cells display variable sensitivity to TRAIL-induced apoptosis although most cell lines have similar sensitivity to cisplatin. Normal ovarian epithelium samples were mostly sensitive to TRAIL. In sensitive cells, TRAIL induced caspase-8-dependent apoptosis, which subsequently led to activation of caspase-3. Both sensitive and resistant cells expressed caspase-8, caspase-3, FADD, XIAP, and c-FLIP at similar levels. A significant enhancement in cell death was observed in TRAIL-resistant cells when c-FLIP(L) levels were downregulated by RNA interference. CONCLUSIONS: These data suggest that sensitivity to TRAIL and chemotherapy does not necessarily correlate in human ovarian cancer cells. Cancerous cells isolated from patients with ovarian cancer show variable sensitivity to TRAIL but most normal ovarian epithelial cells are sensitive. In human ovarian cancer cells, c-FLIP(L) may participate to the regulation of the TRAIL signaling cascade.     

Mast cell density, angiogenesis, blood clotting, and prognosis in women with advanced ovarian cancer

OBJECTIVE: To determine clinical or biological associations between mast cell density, blood clotting, angiogenesis, and survival of patients with advanced ovarian cancer. METHODS: Tumor tissue sections were assessed for mast cell density by staining for mast cell tryptase, blood clotting by staining of thrombosed blood vessels, and angiogenesis by CD34 expression. Chi-square, Kaplan-Meier, and Cox proportional hazard statistical analyses were used. RESULTS: 44 women with stage III-IV ovarian cancers had tumor blocks available for immunohistochemical analysis. Higher mean vessel density (MVD) (>11 vessels/400x field) predicted for better survival than lower MVD (< or =11 vessels/400x field) (P = 0.004). Women whose tumors had low levels of peri-tumoral mast cell infiltration had a mean survival of 40.6 months compared to 50.6 months in those whose tumors had high levels (P = 0.47). Tumors with higher MVD and high peri-tumoral mast cell infiltration had a mean survival of 80.3 months compared to 37.8 months in those with low mast cell density or low MVD (P = 0.015). Patients with tumors showing a low degree of blood clotting had a mean survival of 45.5 compared to 45.1 months in those with tumors showing a high degree of blood clotting (P = 0.91). There was no significant association between angiogenesis and mast cell density (P = 0.123). In multivariate analysis, higher MVD remained as a significant prognostic factor for improved survival after adjusting for clotting and mast cell density. CONCLUSIONS: Our data suggest that peri-tumoral mast cell infiltration in tumors with high MVD predicts for improved survival in women with advanced epithelial ovarian cancer.     

αvβ6整合素对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的影响

目的　探讨αvβ6整合素介导的细胞与细胞外基质的黏附 ,及其对顺铂诱导的卵巢癌细胞凋亡的影响。方法　采用流式细胞仪测定卵巢癌细胞株SKOV3、AO、3AO细胞表面αvβ6整合素的表达 ,并利用酶联免疫吸附实验、吖啶橙 溴化乙锭双荧光染色法分析顺铂诱导的细胞凋亡及αvβ6整合素对细胞凋亡的影响。结果　SKOV3、AO、3AO细胞均表达αvβ6整合素 ,其相对荧光指数 (FI)均为 1 0 3± 0 0 1。顺铂可以诱导SKOV3、AO、3AO细胞凋亡 ,经顺铂 (10 μg/ml)作用 4 8h后 ,酶联免疫吸附实验结果显示 ,生长于αvβ6整合素配体———纤维粘连蛋白 (FN)上的细胞的富集系数 (EF)分别为 2 11± 0 0 4、2 15± 0 0 6、2 11± 0 0 4 ,明显低于生长于非整合素配体———多聚赖氨酸 (polylisin)上的细胞 (分别为 3 5 1± 0 0 3、3 5 5± 0 0 4、3 6 6± 0 0 4 ,P <0 0 1) ;吖啶橙 溴化乙锭双荧光染色法结果显示 ,生长于FN上的细胞凋亡率分别为 (5 0± 0 7) %、(5 0± 0 7) %、(6 0± 0 7) % ,明显低于生长于polylisin上的细胞凋亡率[分别为 (2 8 0± 0 7) %、(2 8 0± 0 7) %、(2 9 0± 0 7) % ,P <0 0 0 1],用αvβ6整合素的特异性阻断抗体封闭过的细胞再次生长于FN上时 ,细胞凋亡率 [分别为 (15 0± 0