PTEN基因逆转卵巢上皮性癌细胞耐药的机制研究

目的通过检测PTEN基因在卵巢上皮性癌（卵巢癌）顺铂敏感细胞株0V2008及0V2008配对的顺铂耐药细胞株C13K中的表达,探讨转染PTEN基因能否逆转C13K细胞对顺铂的耐药及其相关机制。方法半定量RT-PCR技术和蛋白印迹法检测0V2008和C13K细胞中PTENmRNA和蛋白的表达。将野生型PTEN基因真核表达质粒在脂质体介导下转染C13K细胞,同时以转染空载体和未转染的C13K细胞作为对照,分别应用RT-PCR技术检测各组细胞PTENmRNA表达的变化,应用蛋白印迹法检测各组细胞PTEN、蛋白激酶B（AKT）及磷酸化AKT（p-AKT）蛋白表达的变化;四甲基偶氮唑蓝（M1Tr）比色法观察转染PTEN基因后C13K细胞对顺铂敏感性的变化,流式细胞仪分析顺铂作用后的细胞凋亡情况。结果（1）PTENmRNA在0V2008和C13K细胞中的表达水平分别为1．02±0.05和0．45±0.03,而0V2008、C13K细胞中PTEN蛋白的表达水平分别为1.02±0.07、0．55±0．03,两种细胞PTENmRNA和蛋白的表达水平分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（2）PTEN基因转染48h后,C13K细胞中PTENmRNA、蛋白的表达水平分别为2.04±0．10和0．94±0．04,分别与转染空载体和未转染的C13K细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）;p-AKT蛋白的表达水平（0.94±0．07）较转染空载体（1．66±0．10）和未转染（1．68±0．14）的C13K细胞显著降低（P〈0．05）。（3）转染PTEN基因的C13K细胞对顺铂的半数抑制浓度（IC50）为（7.2±0．3）μmol／L,明显高于转染空载体和未转染的C13K细胞[分别为（12．7±0．4）、（13．0±0．3）μmol／L,P〈0,05]。（4）顺铂作用24h后,转染PTEN基因、转染空载体和未转染的C13K细胞的凋亡率分别为（41.7±0.9）％、（18．6±0．7）％和（15,3±0．8）％,前者明显高于后两者（P〈0．01）。结论PTEN基因在0V2008细胞中的表达明显高于C13K细胞。转染野生型PTEN基因能有效提高C13K细胞内PTEN基因的表达,并通过降低C13K细胞中AKT磷酸化的水平恢复C13K细胞对顺铂的敏感性。     

稳定转染PTEN基因后对卵巢上皮性癌细胞磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号传导通路的影响

目的 研究外源性PTEN基因稳定转染卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞后,对卵巢癌细胞磷酸酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号传导通路的影响.方法 构建表达野生型PTEN基因的重组载体pcDNA3.1A-PTEN质粒,并转染卵巢癌细胞株HO-8910细胞(重组载体组),以转染空载体pcDNA3.1A质粒(空载体组)作为阴性对照,以未转染质粒(空白组)作为空白对照.采用逆转录(RT)PCR技术检测3组细胞中PTEN、Akt1、Akt2、PI3K mRNA的表达水平,蛋白印迹法检测3组细胞中PTEN蛋白的表达强度,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测3组细胞的生长情况[以吸光度(A)值表示,A值越大表示生长速度越快].结果 表达野生型PTEN基因的重组载体pcDNA3.1A-PTEN质粒,经测序证实构建成功.重组载体组细胞中PTEN mRNA的表达水平为(17372±23)copy/ml,高于空载体、空白组[分别为(39±1)、(78±4)copy/ml],差异均有统计学意义(P＜0.05);重组载体组细胞中PTEN蛋白的表达强度也明显高于空载体、空白组.重组载体组细胞中Akt1、Akt2、PI3KmRNA的表达水平分别为(28±2)、(7±1)、(61±2)copy/ml,低于空载体[分别为(115±5)、(18±2)、(84±2)copy/ml]、空白组[分别为(77±4)、(17±2)、(1349±7)copy/m1],差异均有统计学意义(P＜0.05).培养第5天,重组载体组细胞生长速度(A值)为90 158±47,低于空载体、空白组(分别为148 251±65、250 115±62),差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 转染表达野生型PTEN基因的重组载体能有效提高卵巢癌HO-8910细胞中PTEN mRNA和蛋白的表达,抑制细胞生长,并通过显著降低Akt1、Akt2、PI3K mRNA的表达水平,明显抑制PI3K/Akt信号传导通路.     

凋亡抑制基因survivin在卵巢上皮性癌组织中的表达及其与bcl-2、bax蛋白表达的关系

目的　探讨凋亡抑制基因survivin在卵巢上皮性癌中的表达 ,及其与bcl 2、bax蛋白表达的相关性。方法　应用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术 ,检测 35例卵巢上皮性癌组织中survivin基因的表达 ;应用免疫组织化学链霉亲和素 生物素 过氧化物酶复合物 (SABC)方法 ,检测bcl 2及bax蛋白的表达 ,并与卵巢上皮性交界性肿瘤、良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织各 10例进行对照。结果　卵巢上皮性癌、交界性肿瘤组织中 ,survivin基因的表达率分别为 83%及 80 % ,显著高于良性卵巢肿瘤及正常卵巢组织的表达率 2 0 %及 0 % (P均 <0 .0 5 )。survivin基因表达与卵巢上皮性癌的临床分期、病理学类型、组织学分级及淋巴结转移无相关性 (P均 >0 .0 5 )。survivin基因表达与bcl 2蛋白表达呈正相关 (P <0 0 1) ,而与bax蛋白表达呈负相关 (P <0 .0 5 )。结论　survivin基因可通过抑制癌细胞凋亡 ,对卵巢上皮性癌的发生和发展起作用 ;survivin基因可能与凋亡相关基因bcl 2、bax ,在卵巢上皮性癌的发展中分别起协同和拮抗作用。     

C-erbB2、nm23和p53蛋白在卵巢上皮性癌中的表达及其临床意义

目的探讨ＣｅｒｂＢ２、ｎｍ２３和ｐ５３３种基因蛋白在卵巢上皮性癌中表达的关系。方法应用链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶连接法检测７０例卵巢上皮性癌石蜡切片中ＣｅｒｂＢ２、ｎｍ２３和ｐ５３蛋白的表达情况。应用ＫａｐｌａｎＭｅｉｅｒ法及多变量Ｃｏｘ比例风险回归模型,分析这３种蛋白表达与患者预后的关系。结果（１）ＣｅｒｂＢ２蛋白表达率为３１．４％,与其临床分期有关;ｎｍ２３蛋白表达率为３８．６％,其表达在有无盆腔淋巴结转移标本中有一定意义;ｐ５３蛋白表达率为３４．３％,在浆液性卵巢癌中的表达率较粘液癌为高。（２）３种基因蛋白表达比较,差异无显著性（Ｐ＞０．０５）。（３）患者生存随访表明,ＣｅｒｂＢ２表达患者的平均生存时间短于无表达患者;ｎｍ２３和ｐ５３对生存期影响不显著。结论ＣｅｒｂＢ２蛋白表达与卵巢上皮性癌的恶性程度有显著相关性,对其预后有显著影响。ｎｍ２３蛋白表达可能与盆腔淋巴结转移有关,ｐ５３蛋白表达与卵巢癌病理分型有关,但二者均与预后关系不显著。     

子宫内膜癌和卵巢上皮性癌PTEN基因突变及其蛋白表达的意义

目的　探讨子宫内膜癌和卵巢上皮性癌组织中抑癌基因PTEN的突变及其蛋白表达与肿瘤发生、发展的关系。方法　应用聚合酶链反应 单链构象多态性分析 (PCR SSCP)和DNA序列分析法 ,检测子宫内膜癌 (5 2例 )、卵巢上皮性癌 (6 0例 )中PTEN基因第 5和第 8外显子的突变 ,免疫组织化学法检测PTEN蛋白的表达。结果　子宫内膜癌组织 :(1)PTEN基因突变率为 2 5 % ,高于正常子宫内膜 (0 ,P <0 0 5 ) ;PTEN基因突变率与子宫内膜癌的病理分级、组织类型、肌层浸润深度密切相关(P <0 0 5 )。(2 )PTEN蛋白缺失率为 6 0 % ,高于正常子宫内膜组织 (0 ,P <0 0 5 ) ;子宫内膜癌组织中PTEN蛋白表达率与病理分级和组织类型密切相关 (P <0 0 5 ) ,而与手术病理分期和肌层浸润深度无关 (P >0 0 5 )。卵巢上皮性癌组织 :(1)PTEN基因的突变率为 5 % ,与正常卵巢组织 (0 )和良性卵巢肿瘤 (0 )相比 ,差异无显著性 (P >0 0 5 )。 (2 )PTEN蛋白缺失率为 2 3% ,显著高于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织 (均为 0 ,P <0 0 5 ) ;卵巢上皮性癌组织中的PTEN蛋白缺失率与其组织类型及患者的年龄、绝经与否无明显相关性 (P >0 0 5 ) ,与临床分期和病理分级有关 (P <0 0 5 )。结论　PTEN基因的突变和蛋白表达缺失均参与子宫内膜癌的发生发     

多基因蛋白联合检测判断卵巢上皮性癌患者预后的初步探讨

目的初步探讨多基因蛋白联合检测判断卵巢上皮性癌（卵巢癌）预后的价值。方法选择广西医科大学附属肿瘤医院1991--2001年间确诊为卵巢癌Ⅱ～Ⅲ期的患者共80例,患者均接受理想的肿瘤细胞减灭术和以铂类为主的化疗,其中预后好组（指存活期≥2年）46例,预后差组（指存活期〈2年）34例。采用组织芯片与免疫组化法对两组患者癌组织进行多个基因蛋白（共17个,即ToPo—Ⅱ、Ki-67、MGMT、PCNA、p27、p53、p16、P—gP、LRP、GST-π、bcl-2、C—myc、Fas、bax、MSH2、MRP、BCRP蛋白）表达的检测,并分析其与卵巢癌患者预后的关系;对两组中表达有差异的6个蛋白（即P—gP、BCRP、MGMT、MSH2、p27和p16蛋白）进行多基因蛋白联合检测,并对据此判断的卵巢癌患者预后的价值进行分析。结果（1）预后差组P—gP、BCRP、MSH2蛋白阳性表达率（分别为62％、50％和50％）明显高于预后好组（分别为33％、28％和28％,P〈0．05）;而预后好组MGMT、p27、p16蛋白阳性表达率（分别为43％、54％和43％）明显高于预后差组（分别为18％、29％和24％,P〈0．05）。（2）Cox模型分析显示,MRP、C—myc、LRP、p16、p27、MGMT、ToP0-Ⅱ、P—gP、GST-π蛋白表达与卵巢癌患者的预后有关（P〈0．01）。其中,MRP、C—myc、LRP、ToPo—Ⅱ、P—gP、GST-π蛋白阳性表达者预后差,而MGMT、p27、p16蛋白阳性表达者预后好。（3）多基因蛋白联合检测结果显示,P—gP＋MGMT蛋白联合检测呈阳性表达者与预后密切相关（P〈0．01）,两者联合检测对卵巢癌患者预后总的预测准确率达70％。结论P—gP、MGMT、p27、p16蛋白可作为预测卵巢癌患者预后的标志物,而多基因蛋白联合检测则能更好地预测卵巢癌患者的预后。     

卵巢上皮性癌淋巴结转移相关差异表达蛋白内质网氨基肽酶1的表达及意义

目的 从基因转录及蛋白表达的水平检测内质网氨基肽酶1(ERAP1)在卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞、组织中的表达,探讨其与卵巢癌转移的关系.方法 应用实时荧光定量PCR技术、蛋白印迹法检测在卵巢癌淋巴结非定向转移细胞系(SKOV3)与淋巴结定向高转移细胞系(SKOV3-pm2、SKOV3-pm3、SKOV3-pm4)中ERAP1 mRNA和蛋白的表达情况;并应用免疫组化方法在人卵巢癌原发灶与相应的淋巴结转移灶、裸鼠卵巢癌移植瘤原发灶与相应的淋巴结转移灶中对ERAP1的蛋白表达进行验证.结果 SKOV3、SKOV3-pm2、SKOV3-pm3、SKOV3-pm4细胞中ERAP1 mRNA和蛋白的表达呈下降趋势(分别为0.118±0.012、0.031±0.003、0.028±0.003、0.016±0.005;0.91±0.33、0.09±0.03、0.10±0.04、0.05±0.04),其中,SKOV3细胞中ERAP1 mRNA和蛋白的表达显著高于SKOV3-pm2、SKOV3-pm3、SKOV3-pm4细胞,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).ERAP1蛋白在人卵巢痛原发灶(184±14)和相应的淋巴结转移灶、裸鼠卵巢癌移植瘤原发灶(143±22)和相应的淋巴结转移灶(97±12)中的表达均呈下降趋势,分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).结论 卵巢癌中ERAP1表达的下降或缺失与淋巴结转移有关.     

紫杉醇化疗后卵巢上皮性癌组织中COP9、JAK2、HSP、NADH基因表达的变化及其意义

目的 探讨卵巢上皮性癌(卵巢癌)紫杉醇化疗后癌组织中COP9、JAK2、HSP、NADH基因表达的变化及其意义.方法 采用RT-PCR技术及实时定量PCR技术检测54份卵巢癌组织中JAK2、HSP、NADH和COP9基因的表达,并分析其临床意义.其中,接受紫杉醇化疗者33份(接受2～4、6～10个疗程化疗者分别为15、18份),未接受化疗者21份;病理分级:G1～G2 24份,G330份;病理类型:浆液性囊腺癌26份,黏液性囊腺癌21份,子宫内膜样腺癌7份;手术病理分期:Ⅲ期49份,Ⅳ期5份.结果 RT-PCR技术检测显示,COP9基因过度表达率化疗者为39%,明显低于未化疗者的95%(P<0.01);而JAK2、HSP、NADH基因过度表达率化疗者分别为91%、97%及94%,明显高于未化疗者的29%、48%及43%(P<0.05).除JAK2基因过度表达率在不同病理分级的癌组织中比较,差异有统计学意义(P<0.01)外,其他基因在不同病理分级、病理类型、手术病理分期及不同疗程化疗者间比较,差异均无统计学意义(P>0.05).进一步行实时定量PCR技术检测显示,化疗者COP9、JAK2、HSP和NADH基因的拷贝数分别为568、7653、5766和3200,未化疗者分别为1886、3094、3341和1522,两者分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05).除COP9基因的拷贝数在不同疗程化疗患者的癌组织中比较,差异无统计学意义(P>0.05)外,其他基因在不同疗程化疗、病理分级的癌组织中比较,差异均有统计学意义(P<0.05);上述4个基因拷贝数在不同病理类型间比较,差异均无统计学意义(P>0.05).Ⅳ期患者癌组织中HSP、NADH基因拷贝数明显高于Ⅲ期(P值分别为<0.01、<0.05);但COP9及JAK2基因拷贝数在两者间比较,差异无统计学意义(P>0.05).JAK2、HSP、NADH基因表达3者间均呈明显正相关关系(r=0.56、0.44、0.57,P均<0.01);COP9与JAK2基因表达呈明显负相关关系(r=-0.48,P<0.01),但与HSP、NADH基因表达无明显相关性(r=-0.18、-0.06,P均>0.05).结论 COP9基因表达的下调和JAK2、HSP、NADH基因表达的上调可能与卵巢癌紫杉醇化疗耐药有一定的关系.     

卵巢交界性肿瘤中ras P21蛋白的表达及其临床意义

目的：探讨rasP21蛋白在卵巢交界性肿瘤（OBT）中的表达及其临床意义。方法：应用免疫组织化学SP法对41份OBT中rasP21蛋白的表达进行检测,同时选取10份正常卵巢组织、20份卵巢上皮性良性肿瘤、24份卵巢上皮性癌标本作对照研究。结果：rasP21在OBT中的阳性表达率为43．9％,与正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤及卵巢癌相比,其阳性表达率及强度差异均有显著性,随着病变恶性程度提高,表达逐渐增强（P＜0．05）,粘液性OBT与卵巢粘液性良性肿瘤及卵巢恶性肿瘤相比,阳性表达率及表达强度差异均有显著性（P＜0．05）,而浆液性OBT与同种病理类型的其他卵巢肿瘤相比,未见上述结果。除rasP21的表达强度与OBT肿瘤大小有关外,其表达结果与OBT的其他临床病理因素均无关（P＞0．05）。结论：rasP21表达与OBT的发生有关,检测rasP21蛋白有助于粘液性OBT与其他卵巢粘液性肿瘤的鉴别。     

卵巢上皮性癌中survivin和VEGF-C蛋白表达的相关性及意义

目的:探讨生存素(survivin)、血管内皮生长因子-C(VEGF-C)在卵巢上皮性癌发生、发展及腹腔转移中的作用,以及两蛋白表达的相关性。方法:采用免疫组化法检测132例原发性卵巢上皮性癌、50例交界性上皮性肿瘤及50例良性上皮性肿瘤组织中survivin和VEGF-C蛋白的表达,分析其表达与临床病理特征的关系。结果:卵巢癌组织中survivin和VEGF-C阳性表达率分别为90.1%(119/132)和87.9%(116/132),明显高于良性肿瘤组[22.0%(11/50),35.0%(15/50)]和交界性肿瘤组[48.0%(24/50),56.0%(28/50)](P0.05)。卵巢癌组织中survivin和VEGF-C表达呈正相关(r=0.592,P0.05)。肿瘤分化越低、临床分期越高、脉管内有癌栓及有淋巴结转移的卵巢癌组织中,survivin和VEGF-C蛋白的阳性率越高。结论:VEGF-C与survivin可能在卵巢癌的发生发展过程中发挥着协调作用,两者联合检测可作为判断卵巢癌恶性程度、侵袭、预后的重要指标。     

上皮性卵巢癌PTEN蛋白表达分析

目的：探讨抑癌基因PTEN的蛋白表达与上皮性卵巢癌的发生、发展之间的关系。方法：对74例上皮性卵巢癌应用免疫组化方法检测PTEN蛋白的表达。结果：上皮性卵巢癌中PTEN蛋白有一定的表达缺失，在G1、G2级组织表达率（90．62％）高于G3级组织表达率（66．67％），二者差异有显著性；不同的临床分期中，I、Ⅱ期阳性表达为22／24（91．67％），Ⅲ、Ⅳ期阳性表达为35／50（70％），二者差异有显著性。在浆液性和粘液性两种不同的组织类型间，表达率分别为82．98％和66．67％，二者无明显差别。结论：PTEN蛋白的表达缺失在上皮性卵巢癌的发生、发展过程中有一定的作用，且与病变进展和分化有关。     

晚期卵巢上皮性癌的治疗及其对预后的影响

目的:探讨晚期卵巢上皮性癌的治疗及其对预后的影响。方法:回顾分析晚期卵巢上皮性癌患者76例的临床资料,生命统计采用Kaplan-Meier法及Log-rank法检验,利用COX风险比例回归模型判断患者独立的预后影响因素并进行分析。结果:分期、残余灶、腹膜后淋巴结清除术及术后化疗的疗程数是影响预后的重要因素。行和未行腹膜后淋巴结清除术,总的5年存活率分别是52％和22％(P<0.01)。其中残余灶≤2cm者,行与未行腹膜后淋巴结清除术的5年存活率分别是65％、30％(P<0.01)。残余灶>2cm者,行与未行腹膜后淋巴结清除术的5年存活率分别是21％、9％,但差异没有显著性(P>0.05)。结论:理想的肿瘤细胞减灭术、腹膜后淋巴结清除术及术后至少6个疗程的化疗是改善患者预后的重要措施,但如残余灶>2cm,则不必行腹膜后淋巴结清除术。     

细胞周期素D1蛋白在卵巢上皮性肿瘤中的表达及其意义

目的　研究细胞周期素D1(cyclinD1)在卵巢上皮性肿瘤中的表达及意义。方法　 1997～ 2 0 0 0年采用免疫组织化学SP法 ,检测恶性卵巢上皮性肿瘤、交界性肿瘤、良性肿瘤、正常卵巢组织cyclinD1的表达。结果　在恶性卵巢上皮性肿瘤 ,良性肿瘤 ,正常卵巢组织之间cyclinD1的表达差异有显著性 (P <0 0 1)。cyclinD1的表达率与组织分化程度和临床分期有显著相关性 (P <0 0 5 ) ,cyclinD1的过度表达见于组织分化差 ,肿瘤发病的晚期。结论　cyclinD1在卵巢癌组织中广泛存在 ,并与组织分化 ,临床分期有一定相关性 ,提示该基因在卵巢癌的发生、发展中起一定作用     

上皮性卵巢癌中PTEN突变分析

目的 :探讨抑癌基因PTEN与上皮性卵巢癌的发生发展之间的关系。方法 :收集上皮性卵巢癌 6 0例 (浆液性 4 7例 ,粘液性 13例 )和良性上皮性卵巢肿瘤 10例及正常卵巢组织 5例 ,提取组织DNA后用PCR SSCP方法检测PTEN基因的第 5、8外显子的突变。结果 :3例 (2例浆液性腺癌、1例粘液性腺癌 )突变 ,并经DNA测序结果证实。结论 :在上皮性卵巢癌的发生发展过程中PTEN突变可能起作用 ,但不能除外该基因有突变以外的其他异常改变参与了肿瘤的发生。     

磷脂酰肌醇3激酶在卵巢上皮性癌组织中的表达及其抑制剂对卵巢上皮性癌细胞生长抑制作用的研究

目的 探讨细胞信号转导信使磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)在卵巢上皮性癌(卵巢癌)组织中的表达及其意义;并探讨PI3K抑制剂LY294002联合顺铂对卵巢癌细胞株的生长抑制作用.方法 应用蛋白印迹法和RT-PCR技术检测正常卵巢组织(正常组,20份)、卵巢良性上皮性肿瘤组织(良性组,6份)、卵巢交界性上皮性肿瘤组织(交界性组,6份)和卵巢癌组织(卵巢癌组,39份)中PI3K p85亚单位蛋白和mRNA的表达.将SKOV3细胞分为对照组(只加培养液)、LY294002组(加1、10、30、50、100 μmol/L LY294002)、顺铂组(加0.33、1.25、2.5、5、10 μmol/L顺铂)和联合组(加50 μmol/L LY294002+10 μmol/L顺铂),四甲基偶氮唑蓝还原法测定不同浓度的LY294002及顺铂对SKOV3细胞的生长抑制作用.结果 (1)PI3K p85亚单位蛋白的表达阳性率:正常组和良性组均为0,交界性组为2/6,卵巢癌组为85%(33/39),正常组、良性组、交界性组分别与卵巢癌组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).(2)PI3K p85亚单位mRNA的表达水平:正常组为0.178±0.102,良性组为0.643±0.112,交界性组为0.847±0.058,卵巢癌组为1.689±0.423,正常组、良性组、交界性组分别与卵巢癌组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).卵巢癌组织中,PI3K p85亚单位蛋白表达阳性率及mRNA的表达水平,不同年龄、病理类型间比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);而不同病理分化程度、手术病理分期间比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).(3)LY294002及顺铂呈剂量依赖性地抑制SKOV3细胞的生长.LY294002组(50 μmol/L)、顺铂组(10 μmol/L)、联合组SKOV3细胞的抑制率分别为(46.0±2.0)%、(44.4±3.2)%、(57.1±4.1)%,联合组SKOV3细胞的抑制率高于LY294002组及顺铂组(P＜0.01).结论 PI3K p85亚单位在卵巢癌组织中呈高表达,与病理分化程度、手术病理分期有关.LY294002与顺铂联合用药对卵巢癌细胞生长的抑制具有协同效应.