小分子干扰RNA对卵巢癌紫杉醇耐药株的多药耐药性逆转的研究

目的 探讨小分子干扰RNA（small interfering RNAs，siRNA）对A2780／Taxol细胞多药耐药性的逆转作用：方法 2005-07—2005-12华中科技大学同济医学院附属协和医院根据多药耐药基因1（MDR1）序列设计2条siRNA，将siRNA包装入质粒，经转化、克隆、扩增、纯化，与pEGFPN-1质粒一起共转染A2780／Taxol细胞，流式细胞仪、MTF、RT-PCR和Western blot分别检测转染效率、紫杉醇的半数抑制浓度（IC50）、细胞P-gp蛋白及MDR1 mRNA表达。结果 两种重组质粒与EGFP质粒转染效率无明显差异，P-gp表达水平明显下调。两条siRNA对紫杉醇敏感性的相对逆转率分别达63．8％及51．2％。MDR1基因不同程度的沉默，MDR-A能更有效封闭MDR1基因,MDR1 mRNA相对水平下降（67．3±0．8）％.结论 siRNA能有效逆转MDR1基因编码P-gP介导的A27801Taxol细胞多药耐药．     

BRMS1基因抑制卵巢上皮性癌细胞体内外转移的实验研究

目的 研究BRMS1基因转染卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞后对其体内外转移的抑制作用。方法 应用脂质体介导法将BRMS1基因转染人卵巢癌细胞株A2780细胞内（转染组）,设未进行任何转染的A2780细胞为空白对照组,转染空载体pcDNA3质粒者为阴性对照组。体外观察转染前后3组细胞增殖、凋亡、细胞间缝隙通讯连接、黏附转移情况及超微结构的变化。建立裸鼠人卵巢癌移植瘤模型,观察3组裸鼠BRMS1基因抑制肿瘤体内转移的作用。结果 BRMS1基因成功转染入A2780细胞中。BRMS1基因转染后,空白对照组细胞生长速度与阴性对照组和转染组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;空白对照组、阴性对照组及转染组细胞的每孔克隆数分别为（42±7）、（39±4）及（40±4）个,3组间比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;3组细胞S期和G：／M期、Gn／G,期比例比较,差异也无统计学意义（P〉0．05）。转染组细胞问缝隙通讯连接功能增强。细胞侵袭实验显示,转染组转入底层膜的细胞数[（112±23）个]明显低于空白对照组和阴性对照组[分别为（306±49）、（322±91）个;P〈0．01]。BRMS1基因转染后,裸鼠体内转移灶,转染组为（23±7）个,分别与空白对照组和阴性对照组[分别为（96±12）、（112±20）个]比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论 作为转移抑制基因,BRMS1基因可抑制卵巢癌细胞的转移。     

MDR1及MDR3基因沉默对紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol凋亡能力的影响

目的:探讨采用RNA干扰技术沉默多药耐药基因MDR1及MDR3后对卵巢癌紫杉醇耐药细胞株A2780/Taxol凋亡能力的影响.方法:将MDR1和MDR3的siRNA重组质粒转染A2780/Taxol,通过MTT法、流式细胞术、免疫荧光法及Western blot方法分别检测细胞对紫杉醇的敏感性、细胞周期和凋亡率、细胞中caspase-3的活性及MDR编码的P-gp蛋白的表达的变化.结果:转染SiRNAs重组质粒后,A2780/Taxol对紫杉醇敏感性的相对逆转率分别为64.3%及53.9%,细胞凋亡率由1.59%分别增加到9.43%和8.66%,细胞中caspase-3活性增强,P-gp蛋白含量明显减少,与对照组比差异有统计学意义(P＜0.05).结论:MDR1和MDR3的siRNA质粒可通过诱导卵巢癌紫杉醇耐药细胞A2780/Taxol凋亡,恢复其对紫杉醇的敏感性.     

低氧诱导因子1α对子宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的探讨低氧诱导因子1α（HIF-1α）对宫颈癌细胞的生物学行为的影响以及其中可能存在的分子机制。方法通过CoCl2化学诱导宫颈癌HeLa细胞缺氧;构建靶向HIF-1α的反义真核表达载体、经脂质体介导转染HeLa细胞的方法沉默HIF-1α的表达。将实验细胞分为常氧未转染对照（NN）组、常氧空质粒转染对照（NI）组、常氧转染pcDNA3．0／HIF-1α质粒（NT）组、缺氧未转染对照（HN）组、缺氧空质粒转染对照（HI）组、缺氧转染pcDNA3．0／HIF-1α质粒（HT）组。用四甲基偶氮唑蓝法、Transwell侵袭小室方法观察各组细胞的增殖、侵袭能力的改变,用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率,用RT-PCR技术检测各组细胞目的基因HIF-1α及其靶基因血管内皮生长因子（VEGF）、葡萄糖转运体1（GLUT1）、多药耐药基因1（MDR1）的表达变化。结果NT组细胞在培养12、24、48、72h时的活细胞数分别为0．053±O．003、0．074±0．004、0．148±0．015、0．192±0．038,而HT组分别为0．069±0．003、0．155±0．022、0．224±0．022、0．308±0．069;NT和HT组的细胞增殖受到抑制,NT组与NN及NI组、HT组与HN及HI组间的活细胞数分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。各组细胞的凋亡率分别是,NN组（29．27±0．18）％、NI组（31．13±0．08）％、NT组（51．11±0．14）％、HN组（11．46±0．28）％、HI组（15．77±0．49）％、HT组（40．05±0．97）％;HT组与HN及HI组、NT组与NN及NI组间分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。各组细胞的侵袭能力由高到低依次为HI、HN、NI、NN、HT、NT组,分别为（40±9）％、（37±12）％、（28±5）％、（26±7）％、（19±7）％、（10±5）％;NT组与NN及NI组、HT组与HN及HI组间分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。NT组细胞HIF-1α、VEGF、GLUT1、MDR1 mRNA的相对表达量分别为0．05±0．12、0．09±0．11、0．08±0．15、0．05±0．15,而HT组分别为0．04±0．16、0．16±0．16、0．12±0．20、0．20±0．21;NT组与NN及NI组、HT组与HN及HI组间分别比较,HIF-1α、VEGF、GLUT1、MDR1 mRNA的相对表达量均有降低,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论HIF-1α可能主要通过其下游的靶基因对宫颈癌细胞的恶性生物学行为产生影响,包括抗凋亡、促增殖、增加血液供应和能量供应、耐药等,且体外抑制HIF-1α的表达对宫颈癌细胞有抑制作用。     

PTEN基因逆转卵巢上皮性癌细胞耐药的机制研究

目的通过检测PTEN基因在卵巢上皮性癌（卵巢癌）顺铂敏感细胞株0V2008及0V2008配对的顺铂耐药细胞株C13K中的表达,探讨转染PTEN基因能否逆转C13K细胞对顺铂的耐药及其相关机制。方法半定量RT-PCR技术和蛋白印迹法检测0V2008和C13K细胞中PTENmRNA和蛋白的表达。将野生型PTEN基因真核表达质粒在脂质体介导下转染C13K细胞,同时以转染空载体和未转染的C13K细胞作为对照,分别应用RT-PCR技术检测各组细胞PTENmRNA表达的变化,应用蛋白印迹法检测各组细胞PTEN、蛋白激酶B（AKT）及磷酸化AKT（p-AKT）蛋白表达的变化;四甲基偶氮唑蓝（M1Tr）比色法观察转染PTEN基因后C13K细胞对顺铂敏感性的变化,流式细胞仪分析顺铂作用后的细胞凋亡情况。结果（1）PTENmRNA在0V2008和C13K细胞中的表达水平分别为1．02±0.05和0．45±0.03,而0V2008、C13K细胞中PTEN蛋白的表达水平分别为1.02±0.07、0．55±0．03,两种细胞PTENmRNA和蛋白的表达水平分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（2）PTEN基因转染48h后,C13K细胞中PTENmRNA、蛋白的表达水平分别为2.04±0．10和0．94±0．04,分别与转染空载体和未转染的C13K细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）;p-AKT蛋白的表达水平（0.94±0．07）较转染空载体（1．66±0．10）和未转染（1．68±0．14）的C13K细胞显著降低（P〈0．05）。（3）转染PTEN基因的C13K细胞对顺铂的半数抑制浓度（IC50）为（7.2±0．3）μmol／L,明显高于转染空载体和未转染的C13K细胞[分别为（12．7±0．4）、（13．0±0．3）μmol／L,P〈0,05]。（4）顺铂作用24h后,转染PTEN基因、转染空载体和未转染的C13K细胞的凋亡率分别为（41.7±0.9）％、（18．6±0．7）％和（15,3±0．8）％,前者明显高于后两者（P〈0．01）。结论PTEN基因在0V2008细胞中的表达明显高于C13K细胞。转染野生型PTEN基因能有效提高C13K细胞内PTEN基因的表达,并通过降低C13K细胞中AKT磷酸化的水平恢复C13K细胞对顺铂的敏感性。     

姜黄素对卵巢癌耐药细胞A2780/taxol凋亡诱导作用及其机制探讨

目的探究姜黄素对卵巢癌耐药细胞A2780/taxol凋亡诱导作用及其机制。方法体外培养卵巢癌耐药细胞A2780/taxol细胞株,实验分为:A组(紫杉醇100μg/ml)、B组(紫杉醇100μg/ml+姜黄素10μmol)、C组(紫杉醇100μg/ml+姜黄素20μmol)、D组(紫杉醇100μg/ml+姜黄素40μmol)、E组(紫杉醇100μg/ml+姜黄素80μmol)。导致显微镜下观察姜黄素作用A2780/taxol细胞后细胞形态;MTT法检测细胞增殖的影响,Western Blot检测P-糖蛋白(P-gp)、蛋白激酶C-α(PKC-α)表达情况,用流式细胞仪检测A2780/taxol细胞凋亡情况。结果紫杉醇与不同浓度姜黄素作用A2780/taxol细胞,较A组能够明显抑制细胞生长(P<0.05);Western Blot检测姜黄素干预组P-gp、PKC-α蛋白表达水平低于对照组(P<0.05);姜黄素组A2780/taxol细胞凋亡率高于常规培养组(P<0.05);姜黄素联合紫杉醇组A2780/taxol细胞凋亡率高于单独使用紫杉醇组(P<0.05)。结论姜黄素可通过抑制P-gp、PKC-α蛋白表达,提高紫杉醇对A2780/taxol细胞毒性,进而降低细胞耐药性,另外姜黄素可促进A2780/taxol细胞凋亡。     

胰岛素对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨胰岛素对子宫内膜癌细胞系Ishikawa3-H-12细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法 应用免疫细胞化学方法和RT-PCR技术检测Ishikawa3-H-12细胞胰岛素受体（INSR）蛋白和mRNA的表达。以不同浓度胰岛素作用Ishikawa3-H-12细胞不同时间,采用四甲基偶氮唑蓝比色法、流式细胞仪检测细胞增殖、凋亡和细胞周期。结果 （1）Ishikawa3-H-12细胞INSR蛋白呈棕黄色阳性表达,并可见INSR基因的表达。（2）胰岛素以浓度和时间依赖的方式促进子宫内膜癌细胞增殖,1×10^-4mol／L胰岛素作用48h时促增殖作用最显著,增殖率为（340．2±15．9）％,与对照细胞（以胰岛素浓度为0作为对照,为100％）比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。（3）胰岛素以浓度和时间依赖的方式使Ishikawa3-H-12细胞中G0／G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,1×10^-4mol／L胰岛素作用72h时最显著,G0／G1期细胞比例为（27．7±2．5）％,S期细胞为（55．2±1．4）％,分别与对照细胞[分别为（67．6±1．5）％、（15．7±1．0）％]比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）;胰岛素对G2／M期细胞无影响（P〉0．05）。（4）随着胰岛素浓度的增加,Ishikawa3-H-12细胞凋亡率逐渐下降。1×10^-4mol／L胰岛素作用最显著,作用24、48、72、96h时的细胞凋亡率分别为（1．76±0．16）％、（1．70±0．15）％、（1．56±0．20）％、（1．31±0．24）％,分别与对照细[分别为（9．81±0．61）％、（9．93±1．44）％、（9．10±0．66）％、（10．30±1．20）％]比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论 胰岛素对子宫内膜癌Ishikawa3-H-12细胞具有促进增殖、抑制凋亡的作用。     

Edg4基因小分子干扰RNA载体的构建及其对卵巢上皮性癌细胞的沉默效应

目的构建针对Edg4基因的小分子干扰RNA（siRNA）载体,初步观察其对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞的沉默效应。方法利用软件分析、设计针对人Edg4 mRNA的siRNA靶序列,合成发夹样DNA序列;退火成双链,克隆至真核表达载体pRNAT—U6．1质粒上,经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实其序列无误后,用脂质体包裹并转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,用荧光显微镜初步观察其在SKOV3细胞中的转染率。采用实时荧光定量荧光定量PCR技术检测转染前后SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,生化法测定转染前后SKOV3细胞上清液中溶血磷脂酸（LPA）含量的变化,流式细胞术检测转染后SKOV3细胞的凋亡率。结果经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实重组真核表达载体的序列无误,并将此命名为pRNAT—U6．1—siEdg4。荧光显微镜下观察,转染后SKOV3细胞内有明显绿色荧光信号,转染率为64％;实时荧光定量PCR技术检测显示,转染后SKOV3细胞的Edg4 mRNA表达水平（0．05±0．01）明显低于转染前（0．29±0．04,P〈0．05）;SKOV3细胞上清液中LPA的含量,转染后明显低于转染前[分别为（3．0±1．0）、（7．5±2．2）μmol／L;P〈0．05];流式细胞仪检测显示,转染后SKOV3细胞的凋亡率明显高于转染前（分别为53．38％、0．51％;P〈0．05）。结论本研究成功构建了针对人Edg4基因的siRNA真核表达载体,并能较高效转染SKOV3细胞,转染后能明显抑制SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,诱导卵巢癌细胞凋亡。     

抑制卵巢癌A2780/Taxol细胞hsa-miR-27a表达对紫杉醇敏感性影响的研究

目的:研究抑制卵巢癌A2780/Taxol细胞hsa-miR-27a表达对紫杉醇敏感性的影响。方法:用浓度递增法建立卵巢癌耐紫杉醇细胞系A2780/Taxol;Stem-loop real-time PCR技术检测A2780/Taxol及亲本细胞A2780中hsa-miR-27a表达水平;利用脂质体Lipofectamine2000将化学合成的miR-27a抑制物及阴性对照(Negative Control,NC)转染A2780/Taxol细胞;分别用Real-time PCR和蛋白印迹法技术检测MDR1mRNA和P-glyco-protein(P-gp)蛋白表达;MTT检测A2780/Taxol对紫杉醇敏感性的变化;流式细胞术检测细胞内P-gp荧光底物罗丹明123(Rh-123)的荧光强度。结果:(1)成功建立了卵巢癌耐紫杉醇细胞系A2780/Taxol;(2)miR-27a在A2780/Taxol细胞中高表达,与A2780细胞相比,表达增高2.2倍。(3)P-gp蛋白在A2780/Taxol细胞中高表达,在A2780细胞中未检测出其表达;(4)转染miR-27a抑制物后,A2780/Taxol细胞的MDR1mRNA和P-gp表达下降,与转染NC组相比,P-gp表达降低36%;对紫杉醇的敏感性增加,IC50为0.53μmol/L,与转染NC组IC506.8μmol/L相比,有明显差异;(5)流式细胞仪结果显示,细胞内Rh-123荧光强度在转染抑制物的A2780/Taxol细胞为5.10±0.35,与A2780/Taxol细胞的2.95±0.39和转染NC的A2780/Taxol细胞的3.30±0.45相比,差异均有统计学意义。结论:hsa-miR-27a在卵巢癌耐紫杉醇A2780/Taxol细胞中高表达,可能通过间接调节P-gp的表达和功能,参与耐药。抑制miR-27a表达后,可以增加A2780/Taxol细胞对紫杉醇的敏感性,部分逆转耐药。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ及其配体对早孕期绒毛组织及细胞滋养细胞浸润能力的影响

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）及其配体对早孕期绒毛组织及细胞滋养细胞浸润能力的影响。方法采用免疫组化方法、免疫荧光细胞化学染色法、蛋白印迹法和RT-PCR技术检测20例孕6～8周（早孕早期组）及20例孕11～12周（早孕晚期组）绒毛组织及细胞滋养细胞中的PPARγ蛋白及其mRNA的表达;并检测不同浓度PPARγ激动配体——15-脱氧-前列腺素J2（15-d-PGJ2）和曲格列酮,以及不同浓度拮抗配体——双酚丙烷二环氧甘油醚（BADGE）对原代无血清培养的细胞滋养细胞浸润能力的影响。结果（1）PPARγ／蛋白在早孕早期组和早孕晚期组绒毛组织中均有表达,主要定位在细胞滋养细胞核中,合体滋养细胞及绒毛间质细胞中无表达。（2）早孕早期组绒毛组织和培养的细胞滋养细胞中,PPARγ／蛋白表达水平分别为1．35±0．08、1．13±0．11,PPARγ／mRNA表达水平分别为36．0±5．1、13．4±3．1;早孕晚期组绒毛组织和培养的细胞滋养细胞中,PPARγ／蛋白表达水平分别为1．17±0．03、0．86±0．05,PPARγ mRNA表达水平分别为23．3±5．5、6．1±1．3,早孕晚期组PPARγ蛋白及其mRNA表达水平明显低于早孕早期组,两组分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（3）PPARγ／激动配体15-d-PGJ2和曲格列酮均有抑制细胞滋养细胞的浸润的作用。15-d-PGJ2浓度为1、10μmol／L,曲格列酮浓度为10μmol／L时,早孕早期组细胞滋养细胞浸润指数分别为0．57±0．03、0．43±0．02、0．50±0．06,早孕晚期组分别为0．69±0．02、0．59±0．03、0．66±0．05,两组分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（4）PPARγ拮抗配体BADGE浓度为20、50μmol／L时,早孕早期组细胞滋养细胞浸润指数分别为1．23±0．07和1．58±0．04;早孕晚期组分别为1．05±0．03和1．38±0．08,两组分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论PPARγ／在调节滋养细胞浸润过程中起重要作用;在早孕期胎盘绒毛组织,PPARγ／激动配体可抑制滋养细胞浸润;PPARγ／拮抗配体可促进滋养细胞浸润,且能部分逆转激动配体的作用。     

短发夹状RNA干扰对子宫颈癌细胞中Pin1基因表达及细胞增殖和凋亡的影响

目的研究短发夹状RNA(shRNA)干扰对宫颈癌细胞中Pin1基因表达及细胞增殖和凋亡的影响。方法构建靶向Pin1基因的shRNA真核表达质粒pSIREN-Pin1,在脂质体介导下转染人宫颈癌细胞系HeLa细胞(HeLa/p-shRNA组),同时以对照质粒pSIREN-Con(HeLa/p-Con组)和无血清培养基转染HeLa细胞(HeLa组)作为对照,分别应用RT-PCR技术及蛋白印迹法检测Pin1mRNA及蛋白表达水平,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法和软琼脂细胞克隆实验检测细胞增殖状况,流式细胞仪分析细胞凋亡情况。结果转染后48h,HeLa/p-shRNA组Pin1mRNA及蛋白表达水平分别为0·19±0·05和0·33±0·14,HeLa/p-Con组分别为0·84±0·16和0·79±0·17,HeLa组分别为0·89±0·11和0·81±0·15,前组Pin1mRNA及蛋白表达水平分别与后两组比较,差异均有统计学意义(P<0·05);转染pSIREN-Pin1质粒后HeLa细胞中Pin1mRNA及蛋白表达抑制率分别为77%和58%。MTT比色法检测显示,HeLa/p-shRNA组细胞增殖率明显下降(P<0·05)。软琼脂克隆实验显示,HeLa/p-shRNA组细胞克隆小而稀疏,细胞克隆形成率为(12±3)%,明显低于HeLa/p-Con组的(20±5)%和HeLa组的(24±4)%(P<0·05)。流式细胞仪分析显示,HeLa/p-shRNA组细胞凋亡率为(24·3±5·7)%,明显高于HeLa/p-Con组的(5·0±1·4)%和HeLa组的(1·8±0·4)%(P<0·05)。结论shRNA干扰技术能有效抑制靶基因Pin1的表达,进而可抑制宫颈癌细胞增殖并诱导细胞凋亡增加,为宫颈癌的基因研究及治疗提供新思路。     

短发夹状RNA对卵巢癌细胞survivin mRNA表达及紫杉醇药物敏感性的影响

目的观察表达短发夹状RNA(shRNA)的mU6/survivin质粒转染卵巢癌细胞株OVCAR3细胞后,对OVCAR3细胞survivin mRNA表达的抑制作用,以及对OVCAR3细胞紫杉醇药物敏感性的影响。方法将表达绿色荧光蛋白的pEGFPC2质粒与脂质体按不同比例转染OVCAR3细胞,流式细胞仪检测其转染效率。根据转染效率最高时pEGFPC2质粒与脂质体的比例,将mU6/survivin质粒转染入OVCAR3细胞。实验分为3组未转染组、脂质体组、转染组,RT-PCR技术检测3组OVCAR3细胞中survivin mRNA的表达,流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡率的变化。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测3组OVCAR3细胞对紫杉醇的50%抑制浓度(IC50)。结果pEGFPC2质粒与脂质体按1∶2比例转染OVCAR3细胞时其转染效率最高,达23.6%。将mU6/survivin质粒与脂质体也按1∶2比例转染OVCAR3细胞24h后,未转染组、脂质体组、转染组细胞survivin mRNA的相对含量分别为0.81±0.05、0.79±0.12、0.26±0.04,转染组survivin mRNA相对含量下降至未转染组的32%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。转染组转染24h后,细胞凋亡率为(31.9±1.2)%,明显高于未转染组的(4.9±0.7)%和脂质体组的(5.6±0.5)%(P=0.000);转染组细胞周期被阻滞于G0/G1期,G2/M期减少,分别与未转染组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。MTT比色法检测结果显示,未转染组、脂质体组、转染组OVCAR3细胞对紫杉醇的IC50分别为(0.305±0.032)、(0.157±0.031)、(0.019±0.001)μmol/L,转染组OVCAR3细胞对紫杉醇的IC50降低为未转染组的1/16,两组比较,差异有统计学意义(P=0.000)。结论shRNA可有效抑制卵巢癌细胞survivinmRNA的表达,并显著提高了卵巢癌细胞对紫杉醇的药物敏感性。     

p53基因转染对卵巢癌MDR细胞药物敏感性及恶性表型的影响

研究 ｐ５３基因导入已知内源背景的肿瘤 ＭＤＲ细胞所致的恶性表型和ＭＤＲ表型的改变及两者的关系。方法：用磷酸钙沉淀法将含有野生型及全长反义 ｐ５３ｃＤＮＡ的逆转录病毒载体ｐＤＷｐ５３及 ｐＤＡｐ５３转染病毒包装细胞 ＰＡ３１７,测定病毒滴度。用此病毒感染卵巢癌多药耐药细胞株Ａ２７８０／ＡＤＭ,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｌｏｔ鉴定,检测转导基因后细胞株的恶性度、多药耐药性等情况。结果：野生型及反义全长ｐ５３ｃＤＮＡ均转入 ＰＡ３１７细胞获得效价为（１－ １．５） Ｘ１０５ＣＦＵ／ｍｌ的前病毒,以此感染卵巢癌多药耐药细胞株Ａ２７８０／ＡＤＭ,Ｓｏｕｔｈｅｍ Ｂｌｏｔ证实ｐ５３基因导入该细胞并整合到基因组ＤＮＡ中,进一步测试观察到：①导入野生型ｐ５３基因的Ａ２７８０／ＡＤＭ细胞生长被抑制、恶性度降低,细胞形态和生长曲线改变,软琼脂集落形成率及裸鼠接种成瘤率降低;②细胞多药耐药性减弱,对ＡＤＭ耐药性下降,Ｐ－ｇｐ表达降低;③反义ｐ５３的导入也对Ａ２７８０／ＡＤＭ恶性度有一定的影响;④野生型ｐ５３导致的ＭＤＲ细胞恶性表型与ＭＤＲ水平的降低似有平行关系。结论：ｐ５３基因对肿瘤细胞ｍｄｒ－ １基因的表达可能起调控作用,ｐ５３发生突变的 Ｍ?     

RNA干扰技术逆转卵巢上皮性癌细胞多药耐药的研究

目的探讨应用RNA干扰(RNAi)技术逆转卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞多药耐药的可行性。方法将设计合成的针对多药耐药基因MDR1的特异性小分子干扰RNA(siRNA),用脂质体转染具有MDR1基因高表达的卵巢癌紫杉醇耐药细胞株OVCAR8/TR。用荧光定量RT-PCR技术和流式细胞仪分别测定转染前后细胞MDR1mRNA及糖蛋白P-gp表达的变化;三磷酸腺苷(ATP)生物荧光法检测转染前后细胞对顺铂、氟尿嘧啶、阿霉素和紫杉醇药物敏感性(以ATP抑制率判断)的变化情况。结果转染后24、48、72、96和120h,OVCAR8/TR细胞MDR1mRNA的抑制率分别为26·42%、84·00%、78·43%、45·85%和0;转染后48h MDR1mRNA的抑制率达到最高峰。转染后24、48、72、96和120h,OVCAR8/TR细胞P-gp的抑制率分别为16·71%、49·64%、85·23%、65·98%和9·44%;转染后72h P-gp的抑制率达到最高。转染MDR1siRNA后,能够明显提高OVCAR8/TR细胞对紫杉醇和阿霉素的敏感性,在紫杉醇的作用下,转染前后OVCAR8/TR细胞的ATP抑制率分别为(25·8±3·1)%和(78·0±9·8)%,转染前后比较,差异有统计学意义(P<0·05)。结论在OVCAR8/TR细胞中,针对MDR1合成的siRNA能够有效地抑制MDR1mRNA和P-gp的表达,并能恢复其对紫杉醇和阿霉素的敏感性。应用RNAi技术,能够逆转卵巢癌细胞对化疗药物的多药耐药。     

白细胞介素6诱导卵巢上皮性癌细胞对化疗药物产生耐药的机制研究

目的 探讨白细胞介素6(IL-6)诱导卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞对化疗药物产生耐药的机制及相关信号传导通路.方法 应用外源性重组IL-6短期处理或将正义IL-6基因(ssIL-6)稳定转染至A2780细胞(不表达IL-6但表达其受体、对顺铂和紫杉醇敏感),同时将反义IL-6基因(asIL-6)稳定转染至SKOV3细胞(高表达IL-6及其受体、对顺铂和紫杉醇耐药),应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、逆转录PCR(RT-PCR)技术及蛋白印迹法(western blot)观察IL-6是否影响卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性,并对可能的信号传导通路进行研究.结果 (1)外源性重组IL-6处理A2780细胞后,对顺铂和紫杉醇的耐药倍数分别为6.25和7.31倍;ssIL-6转染A2780细胞后(内源性过表达IL-6),IL-6低、中、高表达细胞对顺铂的耐药倍数分别为7.13、7.47和8.34倍,对紫杉醇的耐药倍数分别为7.61、8.27和10.70倍;而asIL-6转染SKOV3细胞后(抑制内源性IL-6表达),IL-6中、高抑制表达细胞对顺铂的耐药倍数分别为0.15和0.10倍,对紫杉醇的耐药倍数分别为0.10和0.08倍,可恢复SKOV3细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性.(2)外源性IL-6作用后,上调了A2780细胞中耐药相关基因MDR1和GST-π以及凋亡抑制基因bcl-2、bcl-xL和XIAP mRNA和蛋白的表达;与此相一致,ssIL-6转染的A2780细胞中MDR1、GST-π及bcl-2、bcl-xL、XIAP mRNA和蛋白的表达水平增加,而asIL-6转染的SKOV3细胞则明显降低.(3)有丝分裂原活化的蛋白激酶-细胞外信号调节激酶(MEK)抑制剂--PD98059和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抑制剂--wortmannin能分别阻断IL-6诱导的卵巢癌细胞细胞外信号调节激酶(ERK)和蛋白激酶B(Akt)的活化作用,且两者均能阻断IL-6诱导的卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇产生的耐药,细胞生长明显减少.结论 IL-6诱导的卵巢癌细胞化疗耐药很可能与其上调卵巢癌细胞耐药相关基因MDR1、GST-π和凋亡抑制基因bcl-2、bcl-xL、XIAP的表达以及活化MEK/ERK和PI3K/Akt信号传导通路有关.     

紫杉醇诱导卵巢癌细胞凋亡及对survivin基因表达的影响

目的 :观察紫杉醇对人卵巢癌细胞系A2 780凋亡的作用 ,探讨其对卵巢癌细胞survivin基因表达的影响。方法 :应用MTT、流式细胞仪等方法研究紫杉醇对卵巢癌细胞系A2 780凋亡的诱导作用 ,运用RT- PCR分析紫杉醇对卵巢癌细胞survivin表达的影响。结果 :紫杉醇可诱导卵巢癌细胞系A2 780凋亡 ,不同浓度的紫杉醇引起的凋亡率不同 ,在紫杉醇浓度≥ 10 - 7mol.L- 1时 ,凋亡率显著升高。经紫杉醇作用后的卵巢癌细胞表达sur vivin较用药前明显下降。结论 :紫杉醇可能通过抑制survivin的表达 ,促进肿瘤细胞凋亡。     

微小RNA 27a在卵巢上皮性癌紫杉醇耐药细胞中的表达及其与耐药的关系

目的 研究微小RNA 27a(miR-27a)在卵巢上皮性癌(卵巢癌)紫杉醇耐药细胞中的表达及其与耐药的关系.方法 采用实时PCR技术检测卵巢癌A2780细胞及其紫杉醇耐药细胞A2780/Taxol中miR-27a的表达水平.利用脂质体lipofectamine 2000将成熟miR-27a的模拟物、阻遏物及阴性对照(NC)转染A2780和A2780/Taxol细胞,实时PCR技术检测转染细胞中MDRI基因mRNA的表达;蛋白印迹法检测转染细胞中P-糖蛋白(P-gp)和同源结构域相关的蛋白激酶2(HIPK2)蛋白的表达;采用四甲基偶氮唑蓝比色法、流式细胞仪分别检测紫杉醇作用于转染后细胞的增殖情况及细胞凋亡率.结果 (1)miR-27a在A2780/Taxol细胞中高表达,与A2780细胞相比表达水平增高2.2倍,差异有统计学意义(P<0.05).(2)转染miR-27a阻遏物后,A2780/Taxol细胞中MDR1 mRNA的表达水平为0.61±0.14,与转染NC细胞(表达水平为1.00)比较下降39%,差异有统计学意义(P<0.05);P-gp印蛋白的表达水平为(26±5)%,HIPK2蛋白的表达水平为(30±6)%,分别与转染NC细胞的P-gp蛋白[(43±7)%]和HIPK2蛋白[(19±4)%]的表达水平比较,差异均有统计学意义(P<0.05);A2780/Taxol细胞对紫杉醇的敏感性增加,半数抑制浓度(IC50)为0.5 μmol/L,与转染NC细胞(IC50为6.8 μmol/L)比较,差异有统计学意义(P<0.05);细胞凋亡率明显升高,达(32.5±3.6)%,与转染NC细胞的凋亡率(5.6±2.1)%比较,差异有统计学意义(P<0.05).(3)转染miR-27a模拟物后,A2780细胞中MDR1 mRNA的表达水平为2.21±0.11,与转染NC细胞(表达水平为1.00)比较升高121%,差异有统计学意义(P<0.05).结论 miR-27a在卵巢癌紫杉醇耐药细胞中高表达,其町能通过调控靶基因HIPK2,间接调节MDB1及P-gp的表达和功能而参与耐药.     

不同蛋白激酶C同工酶亚型对卵巢癌细胞耐药性的影响

目的 :检测不同的蛋白激酶 (PKC)同工酶亚型在人卵巢癌耐药细胞中的表达和功能 ,探讨它们与P 糖蛋白 (P gp)介导的多药耐药性之间的关系。方法 :采用免疫荧光及免迹印迹方法检测PKCα和PKCβI在人卵巢A2 780细胞和A2 780 /ADM耐药细胞中的表达 ,免疫印迹法检测P gp的表达 ,并用流式细胞仪测定细胞内柔红霉素 (DNR)及罗丹明 1 2 3 (Rh1 2 3 )的荧光强度。结果 :在A2 780 /ADM细胞中 ,PKC与P gp的表达较A2 780细胞增高 ,PKCβI表达在两者间无明显改变 ;在A2 780 /ADM中DNR及Rh1 2 3的荧光强度较A2 780中降低。A2 780 /ADM细胞与抗PKCα抗体共同卵孕育后细胞内DNR含量上升 ,与十字孢碱 (SP)作用后细胞内Rh1 2 3泵出减少 ,积聚量升高。结论 :PKCα可能在P gp介导的人卵巢癌细胞多药耐药中起重要作用