MDR1及MDR3基因沉默逆转卵巢上皮性癌细胞对紫杉醇耐药的实验研究

目的 研究多药耐药基因——MDR1及MDR3基因沉默逆转卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞A2780／taxol对紫杉醇耐药的作用。方法 用真核质粒介导的针对MDR 1及MDR3基因的短发夹状RNA（shRNA）转染A2780／taxol细胞（分别为MDR1组、MDR3组）,空质粒转染作为对照（空载体组）。流式细胞仪分别检测细胞早期凋亡、罗丹明123（Rh123）积聚情况,末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法（TUNEL）检测细胞晚期凋亡情况,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞对紫杉醇的半数抑制浓度（IC50）,RT-PCR技术检测MDR1及MDR3mRNA的表达,蛋白印迹法（western blot）检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）蛋白的表达。结果转染后,MDR1组及MDR3组A2780／taxol细胞的早期凋亡率分别达（20．21±0．56）％和（10．87±1．24）％。MDR1、MDR3组A2780／taxol细胞内的Rh123平均荧光强度分别为116．6±8．1、98．4±3．8,显著高于空载体组的40．2±1．6,差异有统计学意义（P〈0．05）。TUNEL检测显示细胞发生了晚期凋亡。MDR1、MDR3组A2780／taxol细胞对紫杉醇的IC50明显下降,分别与空载体组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。转染48h后,A2780／taxol细胞中MDR1和MDR3mRNA的表达水平分别下降了（73．3±0．8）％和（51．6±0．4）％;MDR1、MDR3组细胞caspase-3的表达量分别为（80．8±2．6）％、（72．0±4．7）％,均较空载体组增加。结论 MDR1及MDR3基因沉默能恢复A2780／taxol细胞对紫杉醇的敏感性并诱导细胞凋亡,从而逆转A2780／taxol细胞对紫杉醇的耐药性。     

BRMS1基因抑制卵巢上皮性癌细胞体内外转移的实验研究

目的 研究BRMS1基因转染卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞后对其体内外转移的抑制作用。方法 应用脂质体介导法将BRMS1基因转染人卵巢癌细胞株A2780细胞内（转染组）,设未进行任何转染的A2780细胞为空白对照组,转染空载体pcDNA3质粒者为阴性对照组。体外观察转染前后3组细胞增殖、凋亡、细胞间缝隙通讯连接、黏附转移情况及超微结构的变化。建立裸鼠人卵巢癌移植瘤模型,观察3组裸鼠BRMS1基因抑制肿瘤体内转移的作用。结果 BRMS1基因成功转染入A2780细胞中。BRMS1基因转染后,空白对照组细胞生长速度与阴性对照组和转染组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;空白对照组、阴性对照组及转染组细胞的每孔克隆数分别为（42±7）、（39±4）及（40±4）个,3组间比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;3组细胞S期和G：／M期、Gn／G,期比例比较,差异也无统计学意义（P〉0．05）。转染组细胞问缝隙通讯连接功能增强。细胞侵袭实验显示,转染组转入底层膜的细胞数[（112±23）个]明显低于空白对照组和阴性对照组[分别为（306±49）、（322±91）个;P〈0．01]。BRMS1基因转染后,裸鼠体内转移灶,转染组为（23±7）个,分别与空白对照组和阴性对照组[分别为（96±12）、（112±20）个]比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论 作为转移抑制基因,BRMS1基因可抑制卵巢癌细胞的转移。     

PTEN基因逆转卵巢上皮性癌细胞耐药的机制研究

目的通过检测PTEN基因在卵巢上皮性癌（卵巢癌）顺铂敏感细胞株0V2008及0V2008配对的顺铂耐药细胞株C13K中的表达,探讨转染PTEN基因能否逆转C13K细胞对顺铂的耐药及其相关机制。方法半定量RT-PCR技术和蛋白印迹法检测0V2008和C13K细胞中PTENmRNA和蛋白的表达。将野生型PTEN基因真核表达质粒在脂质体介导下转染C13K细胞,同时以转染空载体和未转染的C13K细胞作为对照,分别应用RT-PCR技术检测各组细胞PTENmRNA表达的变化,应用蛋白印迹法检测各组细胞PTEN、蛋白激酶B（AKT）及磷酸化AKT（p-AKT）蛋白表达的变化;四甲基偶氮唑蓝（M1Tr）比色法观察转染PTEN基因后C13K细胞对顺铂敏感性的变化,流式细胞仪分析顺铂作用后的细胞凋亡情况。结果（1）PTENmRNA在0V2008和C13K细胞中的表达水平分别为1．02±0.05和0．45±0.03,而0V2008、C13K细胞中PTEN蛋白的表达水平分别为1.02±0.07、0．55±0．03,两种细胞PTENmRNA和蛋白的表达水平分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（2）PTEN基因转染48h后,C13K细胞中PTENmRNA、蛋白的表达水平分别为2.04±0．10和0．94±0．04,分别与转染空载体和未转染的C13K细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）;p-AKT蛋白的表达水平（0.94±0．07）较转染空载体（1．66±0．10）和未转染（1．68±0．14）的C13K细胞显著降低（P〈0．05）。（3）转染PTEN基因的C13K细胞对顺铂的半数抑制浓度（IC50）为（7.2±0．3）μmol／L,明显高于转染空载体和未转染的C13K细胞[分别为（12．7±0．4）、（13．0±0．3）μmol／L,P〈0,05]。（4）顺铂作用24h后,转染PTEN基因、转染空载体和未转染的C13K细胞的凋亡率分别为（41.7±0.9）％、（18．6±0．7）％和（15,3±0．8）％,前者明显高于后两者（P〈0．01）。结论PTEN基因在0V2008细胞中的表达明显高于C13K细胞。转染野生型PTEN基因能有效提高C13K细胞内PTEN基因的表达,并通过降低C13K细胞中AKT磷酸化的水平恢复C13K细胞对顺铂的敏感性。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ及其配体对早孕期绒毛组织及细胞滋养细胞浸润能力的影响

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）及其配体对早孕期绒毛组织及细胞滋养细胞浸润能力的影响。方法采用免疫组化方法、免疫荧光细胞化学染色法、蛋白印迹法和RT-PCR技术检测20例孕6～8周（早孕早期组）及20例孕11～12周（早孕晚期组）绒毛组织及细胞滋养细胞中的PPARγ蛋白及其mRNA的表达;并检测不同浓度PPARγ激动配体——15-脱氧-前列腺素J2（15-d-PGJ2）和曲格列酮,以及不同浓度拮抗配体——双酚丙烷二环氧甘油醚（BADGE）对原代无血清培养的细胞滋养细胞浸润能力的影响。结果（1）PPARγ／蛋白在早孕早期组和早孕晚期组绒毛组织中均有表达,主要定位在细胞滋养细胞核中,合体滋养细胞及绒毛间质细胞中无表达。（2）早孕早期组绒毛组织和培养的细胞滋养细胞中,PPARγ／蛋白表达水平分别为1．35±0．08、1．13±0．11,PPARγ／mRNA表达水平分别为36．0±5．1、13．4±3．1;早孕晚期组绒毛组织和培养的细胞滋养细胞中,PPARγ／蛋白表达水平分别为1．17±0．03、0．86±0．05,PPARγ mRNA表达水平分别为23．3±5．5、6．1±1．3,早孕晚期组PPARγ蛋白及其mRNA表达水平明显低于早孕早期组,两组分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（3）PPARγ／激动配体15-d-PGJ2和曲格列酮均有抑制细胞滋养细胞的浸润的作用。15-d-PGJ2浓度为1、10μmol／L,曲格列酮浓度为10μmol／L时,早孕早期组细胞滋养细胞浸润指数分别为0．57±0．03、0．43±0．02、0．50±0．06,早孕晚期组分别为0．69±0．02、0．59±0．03、0．66±0．05,两组分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（4）PPARγ拮抗配体BADGE浓度为20、50μmol／L时,早孕早期组细胞滋养细胞浸润指数分别为1．23±0．07和1．58±0．04;早孕晚期组分别为1．05±0．03和1．38±0．08,两组分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论PPARγ／在调节滋养细胞浸润过程中起重要作用;在早孕期胎盘绒毛组织,PPARγ／激动配体可抑制滋养细胞浸润;PPARγ／拮抗配体可促进滋养细胞浸润,且能部分逆转激动配体的作用。     

子(癎)前期患者与正常妊娠孕妇羊水差异蛋白质谱分析

目的 探讨并初步筛选子痫前期患者的特异性羊水标志物。方法 利用CM10蛋白芯片和表面增强激光解析离子化飞行时间质谱（SELDI TOF MS）技术，检测8例重度子瘌前期患者（研究组）和8例晚孕期正常孕妇（对照组）羊水中差异蛋白质的相对含量。并在8例中孕期（孕20±周）正常孕妇（中孕组）羊水中寻找有无这些差异蛋白的存在及其含量变化情况。结果 （1）研究组与对照组羊水蛋白质在相对分子质量／电荷比值（质／荷比）2000-50000范围内，有4种不同质荷比蛋白质的相对含量有明显差异。（2）研究组质荷比为4653的蛋白质相对含量[（1．52±0．71）％]明显低于对照组[（3．16±1．64）％]（P〈0．05），而质荷比为3841、8520、8579的蛋白质相对含量分别为（7．02±4．37）％、（3．74±1．96）%、（5．09±1．93）％，均高于对照组[（2．58±1．09）％、（1．83±0．67）％、（3．06±1．57）％，P均〈0．05]。（3）中孕组羊水中可以找到这四种差异蛋白质。结论 子痫前期患者与正常孕妇羊水蛋白质质谱存在明显差异。有4种不同质荷比相对应的蛋白质可能是子痫前期患者羊水特异性的生物标志物。     

促肾上腺皮质激素释放激素、c-Fos及间隙连接蛋白43与分娩发动的相关性

目的探讨促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、c—Fos和间隙连接蛋白43（Cx43）在足月妊娠子宫平滑肌细胞中的表达变化及其与分娩发动的相关性。方法选择2006年2—9月在中南大学湘雅二医院住院的足月临产产妇30例（临产组）,足月未临产产妇30例（未临产组）,因宫颈上皮内瘤样病变行子宫切除术患者30例（对照组）。应用放射免疫方法测定3组妇女静脉血中CRH的水平;用核酸原位杂交技术和免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（SP）法检测3组妇女子宫平滑肌细胞中c—Fos、Cx43 mRNA及其蛋白的表达水平。结果（1）CRH水平在临产组产妇为（81．8±11．9）pmol／L,未临产组为（34．5±18．6）pmol／L,对照组为（1．3±0．7）pmol／L,临产组明显高于未临产组及对照组,未临产组明显高于对照组,差异均统计学意义（P〈0．05）。（2）c—Fos mRNA及其蛋白的阳性染色主要定位于子宫平滑肌细胞核内,少量位于细胞质内;子宫平滑肌细胞中c—Fos mRNA及其蛋白表达水平,临产组分别为5．4±1．7及5．4±1．5,未临产组分别为4．1±0．9及3．9±0．9,对照组分别为1．0±0．4及1．2±0．4,临产组明显高于未临产组及对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）;未临产组也明显高于对照组（P〈0．05）。（3）Cx43 mRNA及其蛋白的阳性染色定位于子宫平滑肌细胞质内;子宫平滑肌细胞中Cx43 mRNA及其蛋白表达水平,临产组分别为5．5±1．4及5．6±1．3,未临产组分别为4．1±0．6及4．1±0．5,对照组分别为1．5±0．6及1．1±0．6,临产组明显高于未临产组及对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）;未临产组也明显高于对照组（P〈0．05）。（4）3组妇女的CRH水平与子宫平滑肌细胞中c—Fos mRNA及其蛋白的表达水平呈明显正相关（r5=0．61,r6=0．50;P〈0．05）;与子宫平滑肌细胞中Cx43 mRNA及其蛋白的表达水平呈明显正相关（r3=0．52,r4=0．68;P〈0．05）;子宫平滑肌细胞中c—Fos mRNA及其蛋白的表达水平与Cx43 mRNA及其蛋白的表达水平也呈明显正相关（r5=0．51,r6=0．60;P〈0．05）。结论产妇血浆中CRH水平、子宫平滑肌细胞中c—Fos和Cx43的表达与分娩发动有一定的关系,且3者间水平变化均呈明显正相关。     

妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中血管活性肽Apelin的表达及其意义

目的 探讨妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中血管活性肽Apelin的表达及其意义。方法 选择妊娠期高血压疾病患者36例（妊娠期高血压疾病组）,其中妊娠期高血压10例,轻度子痫前期11例,重度子痫前期15例;选择同期正常产妇15例作为正常妊娠组。采用免疫组化染色法及实时荧光定量RT-PCR分别检测两组产妇胎盘组织中Apelin-36及ApelinmRNA的表达。结果 正常妊娠组Apelin-36及ApelinmRNA分别为0．27±0．04及0．82±0．25,妊娠期高血压疾病组分别为0．18±0．05及0．31±0．21,两组比较,差异有统计学意义（P〈0．01）;其中,妊娠期高血压患者分别为0．24±0．02及0．59±0．16,轻度子痫前期患者分别为0．16±0．03及0．25±0．07,重度子痫前期患者分别为0．14±0．02及0．17±0．09,轻度、重度子痫前期患者的Apelin-36及ApelinmRNA表达水平均低于妊娠期高血压患者（P〈0．01,P〈0．01）,轻度子痫前期患者与重度子痫前期患者比较,差异也有统计学意义（P〈0．05,P〈0．05）。结论 血管活性肽Apelin在胎盘组织中表达降低,可能与妊娠期高血压疾病的发生、发展有关。     

胰岛素对子宫内膜癌细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨胰岛素对子宫内膜癌细胞系Ishikawa3-H-12细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法 应用免疫细胞化学方法和RT-PCR技术检测Ishikawa3-H-12细胞胰岛素受体（INSR）蛋白和mRNA的表达。以不同浓度胰岛素作用Ishikawa3-H-12细胞不同时间,采用四甲基偶氮唑蓝比色法、流式细胞仪检测细胞增殖、凋亡和细胞周期。结果 （1）Ishikawa3-H-12细胞INSR蛋白呈棕黄色阳性表达,并可见INSR基因的表达。（2）胰岛素以浓度和时间依赖的方式促进子宫内膜癌细胞增殖,1×10^-4mol／L胰岛素作用48h时促增殖作用最显著,增殖率为（340．2±15．9）％,与对照细胞（以胰岛素浓度为0作为对照,为100％）比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。（3）胰岛素以浓度和时间依赖的方式使Ishikawa3-H-12细胞中G0／G1期细胞比例减少,S期细胞比例增加,1×10^-4mol／L胰岛素作用72h时最显著,G0／G1期细胞比例为（27．7±2．5）％,S期细胞为（55．2±1．4）％,分别与对照细胞[分别为（67．6±1．5）％、（15．7±1．0）％]比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）;胰岛素对G2／M期细胞无影响（P〉0．05）。（4）随着胰岛素浓度的增加,Ishikawa3-H-12细胞凋亡率逐渐下降。1×10^-4mol／L胰岛素作用最显著,作用24、48、72、96h时的细胞凋亡率分别为（1．76±0．16）％、（1．70±0．15）％、（1．56±0．20）％、（1．31±0．24）％,分别与对照细[分别为（9．81±0．61）％、（9．93±1．44）％、（9．10±0．66）％、（10．30±1．20）％]比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论 胰岛素对子宫内膜癌Ishikawa3-H-12细胞具有促进增殖、抑制凋亡的作用。     

子(癎)前期孕妇脂联素及氧化低密度脂蛋白的变化和意义

目的 测定子痫前期（preeclampsia，PE）孕妇血中脂联素及氧化修饰低密度脂蛋白（oxLDL）的变化并探讨其意义。方法 采用酶联免疫吸附法测定子痫前期重度（severepreeclamp—sia，SPE）组、子痫前期轻度（mildpreeclampsia，MPE）组及对照组血清脂联素及氧化低密度脂蛋白（oxidant low—density lipoproteins，oxLDL）水平，并与其它临床指标进行相关分析。结果 （1）三组孕妇血清脂联素虽未见显著差异（P〉0．05），但对照组[（3．55±0．20）μg／dl]、SPE组[（3．01±0．31）μg／dl]、MPE组[（2．56±0．50）μg／dl]呈依次下降趋势。（2）三组孕妇oxLDL比较，SPE组[（36．12±2．37）μg／dl]和MPE组[（49．35±4．22）μg／dl]升高，与对照组[（31．71±3．51）μg／dl]比较均有统计学意义（P〈0．01，〈0．05）；但SPE组与MPE组之间无统计学意义（P〉0．05）。（3）SPE组血清脂联素与收缩压、舒张压呈负相关（r=0．49，P〈0．01；r=-0．42，P〈0．05），而血清oxLDL与收缩压、舒张压呈正相关（r=0．51，P〈0．01；r=0．47，P〈0．05）。三组孕妇血清脂联素与oxLDL均无相关性（P〉0．05）。三组孕妇血清脂联素和oxLDL与血脂其它指标及空腹血糖亦无相关性（P〉0．05）。结论 本研究提示oxLDL及脂联素可能是PE发病的重要因素。     

妊娠不同时期低蛋白饮食对子代大鼠激素抵抗的影响

目的 探讨低蛋白对大鼠出生体重影响的关键时间、成年后是否出现多种激素抵抗以及各自的特点。方法 妊娠鼠随机分为五组（每组12只）：正常对照组、妊娠早期低蛋白组、妊娠中期低蛋白组、妊娠晚期低蛋白组以及全程低蛋白组，足月自然分娩后观察新生鼠体重及数目。再以各组小于孕龄（small for gestational age，SGA）鼠为研究对象（每组9只），于生后12周时测体重（body weight，BW），双侧肾周脂重（fat weight，FW），计算FW／BW；并采用ELISA法测定血糖、胰岛素及瘦素，计算胰岛素敏感指数（insulin sentivity index，ISI）。结果 早期低蛋白饮食组所分娩的新生鼠平均体重（8．72±0．51）g，与正常对照组（7．10±0．62）g比较显著升高（P〈0．05）；全程低蛋白饮食组所分娩的新生鼠数目明显减少，且体重（4．87±0．3）g明显低于正常对照组（P均〈0．01）。晚期低蛋白组大鼠生后12周时体重（6．79±0．56）g升高但无统计学意义（P〉0．05），但胰岛素、瘦素[分别为（4．96±2．11）μg／L和（6．36±0．68）μg／L]升高及ISI（4．29±0．18）水平明显降低（P〈0．05），而全程低蛋白组鼠体重（223．64±17．91）g、肾周脂重（2．36±1．51）g及FW／BW（11．03士6．17）‰、胰岛素、瘦素水平升高[分别为（5．43±1．32）μg／L、（8．07±0．91）μg／L]，而ISI（3．91±0．42）低于对照组（P〈0．05或〈0．01）。结论 妊娠早期低蛋白可能导致出生体重的增加，全程低蛋白导致低出生体重；妊娠晚期的低蛋白及全程低蛋白引起的低出生体重鼠在成年后更容易发生胰岛素及瘦素的抵抗。     

缺氧诱导因子1α及其靶基因在子痫前期患者胎盘组织中的表达

目的探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)及其靶基因血管内皮细胞生长因子(VEGF)、可溶性血管内皮细胞生长因子受体1(sFlt-1)基因在子痫前期患者胎盘组织中的表达。方法采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)法对20例重度子痫前期患者(子痫前期组)和15例正常妊娠妇女(对照组)的胎盘组织中的HIF-1α、VEGF、sFlt-1蛋白表达进行检测;同时应用RT- PCR技术对两组孕妇胎盘组织中HIF-1α、VEGF、sFlt-1 mRNA水平进行检测,并进行相关性分析。结果(1)子痫前期组HIF-1α蛋白表达(+++)者9例(45%,9/20),sFlt-1蛋白表达(+++)者11例(55%,11/20),对照组分别为2例(13%,2/15)和3例(20%,3/15),两组分别比较,差异均有统计学意义(P＜0．05);子痫前期组VEGF蛋白表达(+++)者3例(15%,3/20),明显低于对照组的7例(47%,7/15),两组比较,差异有统计学意义(P＜0．01)。(2)子痫前期组HIF-1αmRNA、sFlt-1 mRNA水平分别为0．604±0．013、0．898±0．041,对照组分别为0．208±0．007、0．559±0．244,两组分别比较,差异均有统计学意义(P＜0．05);子痫前期组VEGF mRNA表达水平虽高于对照组,但差异无统计学意义(P＞0．05)。子痫前期组VEGF mRNA/sFlt-1 mRNA比值(0．439±0．009)低于对照组(0．824±0．011),两组比较,差异有统计学意义(P＜0．05)。(3)子痫前期组HIF-1αmRNA的表达与sFlt-1 mRNA表达呈正相关(r=0．577,P＜0．05),与VEGF mRNA/sFlt-1 mRNA比值呈负相关(r= -0．376,P＜0．05)。结论HIF-1α在子痫前期患者胎盘组织中表达水平明显升高,主要是通过调节VEGF、sFlt-1基因的转录,而影响滋养细胞的浸润和胎盘血管重铸,参与子痫前期的发病。     

应用组织芯片技术研究卵巢癌组织中缺氧诱导因子1α与血管生成的关系

目的　探讨缺氧诱导因子 1α(hypoxiainduciblefactor 1α ,HIF 1α)在卵巢癌组织中的表达及其与血管生成的关系。方法　联合应用组织芯片和原位杂交、免疫组化技术 ,检测 2 95份卵巢上皮性肿瘤 (其中卵巢癌 2 38份、交界性卵巢肿瘤 19份、良性卵巢肿瘤 38份 )及 13份正常卵巢组织中HIF 1αmRNA和血管内皮生长因子 (VEGF)的表达情况 ,以CD3 4 单克隆抗体标记血管内皮细胞来检测微血管密度 (MVD)。结果　卵巢癌、交界性卵巢肿瘤和良性卵巢肿瘤、正常卵巢组织中HIF 1αmRNA的阳性表达率分别为 81 9%、4 2 1%、13 2 %和 0。交界性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中HIF 1αmRNA的表达高于正常卵巢和良性卵巢肿瘤 ,卵巢癌高于交界性肿瘤 ,差异均有统计学意义 (P <0 0 1)。卵巢癌组织中HIF 1αmRNA的表达与手术病理分期和病理类型无关 (P >0 0 5 ) ,而与病理分级呈正相关 (r=0 2 4 6 ,P <0 0 1)。卵巢癌组织中HIF 1αmRNA表达与VEGF表达 (r =0 2 0 6 ,P =0 0 1)和MVD计数 (r =0 4 5 1,P <0 0 1)均呈显著正相关。结论　卵巢癌组织过度表达HIF 1αmRNA ,并通过诱导VEGF促进肿瘤的新生血管形成。     

短发夹状RNA对卵巢癌细胞survivin mRNA表达及紫杉醇药物敏感性的影响

目的观察表达短发夹状RNA(shRNA)的mU6/survivin质粒转染卵巢癌细胞株OVCAR3细胞后,对OVCAR3细胞survivin mRNA表达的抑制作用,以及对OVCAR3细胞紫杉醇药物敏感性的影响。方法将表达绿色荧光蛋白的pEGFPC2质粒与脂质体按不同比例转染OVCAR3细胞,流式细胞仪检测其转染效率。根据转染效率最高时pEGFPC2质粒与脂质体的比例,将mU6/survivin质粒转染入OVCAR3细胞。实验分为3组未转染组、脂质体组、转染组,RT-PCR技术检测3组OVCAR3细胞中survivin mRNA的表达,流式细胞仪分析细胞周期及细胞凋亡率的变化。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测3组OVCAR3细胞对紫杉醇的50%抑制浓度(IC50)。结果pEGFPC2质粒与脂质体按1∶2比例转染OVCAR3细胞时其转染效率最高,达23.6%。将mU6/survivin质粒与脂质体也按1∶2比例转染OVCAR3细胞24h后,未转染组、脂质体组、转染组细胞survivin mRNA的相对含量分别为0.81±0.05、0.79±0.12、0.26±0.04,转染组survivin mRNA相对含量下降至未转染组的32%,两组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。转染组转染24h后,细胞凋亡率为(31.9±1.2)%,明显高于未转染组的(4.9±0.7)%和脂质体组的(5.6±0.5)%(P=0.000);转染组细胞周期被阻滞于G0/G1期,G2/M期减少,分别与未转染组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。MTT比色法检测结果显示,未转染组、脂质体组、转染组OVCAR3细胞对紫杉醇的IC50分别为(0.305±0.032)、(0.157±0.031)、(0.019±0.001)μmol/L,转染组OVCAR3细胞对紫杉醇的IC50降低为未转染组的1/16,两组比较,差异有统计学意义(P=0.000)。结论shRNA可有效抑制卵巢癌细胞survivinmRNA的表达,并显著提高了卵巢癌细胞对紫杉醇的药物敏感性。     

Relationship of hypoxia-inducible factor-1alpha expression and vascular endothelial growth factor in SKOV-3 ovarian cancer model

OBJECTIVE: To investigate the correlation of hypoxia-inducible factor (HIF)-1alpha and vascular endothelial growth factor (VEGF) or micro-vessel density (MVD). METHODS: The ovarian cancer cell line SKOV3 was transplanted into nude mice to form xenogeneic tumor. Mice were treated with rapamycin 4 mg/kg, sulindac 100 mg/(kg.d) and saline 200 microl respectively. Expression of HIF-1alpha and VEGF proteins and MVD were determined by immunohistochemistry. The mRNA of Glut1 and VEGF was studied by RT-PCR. RESULTS: The positive expression of HIF-1alpha and VEGF was moderate to strong, and MVD was high (31 +/- 8) in control group. In rapamycin treated group, the expression of HIF-1alpha was inhibited to weak positive or negative (P < 0.05), the VEGF protein and mRNA expression decreased (P < 0.05), MVD was also suppressed to a low level (13 +/- 5). There was a significant correlation between HIF-1alpha expression and VEGF expression (by Spearman's coefficient r = 0.8264, P < 0.01), and MVD (r = 0.4842, P < 0.05). CONCLUSIONS: HIF-1alpha protein can regulate VEGF protein and its mRNA expressions. It correlates with MVD in ovarian tumor tissue.     

Significance of hypoxia in uterine cervical cancer. Multicentre study

PURPOSE: The aim of the study was to evaluate hypoxia markers (VEGF, GLUT-1, and HIF-1alpha) in cervical cancer tissue depending on staging (FIGO) and grading. We also analyzed the adverse effects of radiotherapy according to expression levels of hypoxic markers in the studied tissue. MATERIAL AND METHODS: Expression of hypoxia-inducible factor-1alpha (HIF-1alpha), glucose transporter 1 (GLUT-1) and vascular endothelial growth factor (VEGF, also known as proangiogenic factor) were estimated in biopsy or surgical specimens from 106 patients diagnosed with uterine cervical cancer. Immunohistochemical methods with EbVision+ complex using monoclonal antibodies anti-VEGF and anti-HIF-1alpha and polyclonal antibody anti-GLUT-1 were applied. RESULTS AND CONCLUSIONS: Hypoxia features measured by percentage of cells undergoing reaction with antibodies anti-HIF-1alpha, anti-GLUT-1 and anti-VEGF were similar in all clinical stages; however the biggest hypoxia features were shown in low differentiated cancers G2 and G3. The 5-year survival for FIGO Stage III patients was shorter in cases with a high expression of hypoxic markers. We observed adverse effects in 45.3% of patients, which occurred more often in patients with higher expression of the studied factors. The presence of hypoxic cells is established as one of the most important factors affecting resistance against tumor radiotherapy and patient prognosis.     

缺氧诱导卵巢上皮性癌细胞形成拟态血管的前期研究

目的探讨缺氧在卵巢上皮性癌细胞系SKOV3和ES2细胞拟态血管形成过程中的作用及西罗莫司对其的抑制效应。方法建立人工基底膜基质凝胶Matrigel三维培养系统,分别在常氧(常氧组)、缺氧(缺氧组)、缺氧时加入西罗莫司(缺氧+西罗莫司组)等条件下诱导,观察SKOV3和ES2细胞形成拟态血管的能力;应用相差显微镜和扫描电镜观察拟态血管的形态及其立体结构的特点;用RT-PCR技术检测不同条件下缺氧诱导因子(HIF)1αmRNA的相对表达量。结果培养7d后,缺氧组SKOV3和ES2细胞出现变形、伸展,形成腔样、管状、分支和网络状等管道结构;而常氧组及缺氧+西罗莫司组,部分细胞出现伸展但不形成管道结构。缺氧组SKOV3和ES2细胞的HIF-1αmRNA表达量分别为0·801±0·034和0·736±0·059,显著高于缺氧+西罗莫司组(分别为0·025±0·007和0·231±0·035;P<0·01,P<0·05)和常氧组(分别为0·010±0·004和0·011±0·002;P均<0·01)。结论缺氧是卵巢上皮性癌细胞形成拟态血管的重要诱导因素,西罗莫司通过抑制HIF-1αmRNA的表达阻断拟态血管的形成。