PTEN基因对卵巢癌耐药细胞系C13K顺铂耐药性的影响

目的:探讨第10号染色体上PTEN对人卵巢癌顺铂耐药细胞株C13K顺铂耐药性的逆转作用。方法:将野生型PTEN基因真核表达质粒在脂质体介导下转染人卵巢癌耐药细胞系C13K细胞,同时以转染空载体和未转染C13K细胞作为对照,分别应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)及蛋白印迹法(W estern blot)检测PTEN mRNA及蛋白表达水平,对转染细胞株进行四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)实验,观察PTEN基因对肿瘤细胞生长的抑制作用和C13K细胞对顺铂药物敏感性的影响,流式细胞仪(FACS)分析细胞的凋亡。结果:转染48 h后,与对照组相比,转染野生型PTEN基因能明显增加C13K细胞PTEN mRNA和蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05);MTT法显示,转染野生型PTEN基因的C13K细胞生长明显慢于转染空载体和未转染的C13K细胞,转染PTEN的C13K细胞对顺铂的敏感性显著增加;FACS分析显示,顺铂作用24h后,转染PTEN基因能够显著提高C13K细胞凋亡率。结论:转染野生型PTEN质粒能有效地提高C13K细胞内PTEN的表达,恢复细胞对顺铂的敏感性。     

子宫颈癌细胞中RAR-β基因表达缺陷与其DNA甲基化的关系

目的观察宫颈癌细胞中RAR-β基因表达的情况,并探讨RAR-β基因DNA甲基化与RAR-β基因表达缺陷的关系。方法采用RT-PCR技术检测宫颈癌细胞系SiHa、HeLa、C33A和Caski细胞中RAR-β mRNA的表达,免疫荧光化学染色法及蛋白印迹法检测其RAR-β蛋白的表达,同时应用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）技术检测宫颈癌细胞中RAR-β基因DNA甲基化状态及采用5-脱氧-2’-杂氮胞苷（5-Aza-edR）处理后RAR-β基因DNA甲基化状态的变化,以及5-Aza-edR处理对RAR-β基因表达缺陷的影响。四甲基偶氮唑蓝（MTF）比色法测定5-Aza-edR对细胞增殖的影响。结果SiHa、HeLa、Caski和C33A细胞中RAR-β mRNA的表达水平分别为0．25±0．08、0、0．60±0．19、3．12±0．92,RAR-β蛋白表达水平分别为0．23±0.07、0、0．14±0．05、0．68±0．21。SiHa、HeLa、Caski细胞中存在RAR-β基因的表达缺失或低下,而C33A细胞中存在RAR-β基因的表达。MSP技术检测发现,SiHa、HeLa、Caski细胞中存在RAR-β基因DNA甲基化,而C33A细胞为非甲基化状态。5-Aza-edR处理后,SiHa、HeLa、Caski和C33A细胞中RAR-β mRNA的表达水平分别为1、82±0．59、2．13±0.62、1.67±0．43、2．95±0．89,RAR-β蛋白表达水平分别为0．69±0．21、0．83±0．29、0．56±0．16、0.64±0.20。5-Aza-cdR处理前后SiHa、HeLa、Caski细胞中RAR-β mRNA和蛋白的表达水平比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）;C33A细胞中RAR-β mRNA和蛋白的表达比较,差异则无统计学意义（P〉0、05）。5-Aza-edR处理后能抑制宫颈癌细胞的增殖。结论RAR-β基因的表达缺陷在宫颈癌的发生中起重要作用,RAR-β基因DNA异常甲基化是导致该基因表达缺陷的重要原因。     

低氧诱导因子1α对子宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的探讨低氧诱导因子1α（HIF-1α）对宫颈癌细胞的生物学行为的影响以及其中可能存在的分子机制。方法通过CoCl2化学诱导宫颈癌HeLa细胞缺氧;构建靶向HIF-1α的反义真核表达载体、经脂质体介导转染HeLa细胞的方法沉默HIF-1α的表达。将实验细胞分为常氧未转染对照（NN）组、常氧空质粒转染对照（NI）组、常氧转染pcDNA3．0／HIF-1α质粒（NT）组、缺氧未转染对照（HN）组、缺氧空质粒转染对照（HI）组、缺氧转染pcDNA3．0／HIF-1α质粒（HT）组。用四甲基偶氮唑蓝法、Transwell侵袭小室方法观察各组细胞的增殖、侵袭能力的改变,用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率,用RT-PCR技术检测各组细胞目的基因HIF-1α及其靶基因血管内皮生长因子（VEGF）、葡萄糖转运体1（GLUT1）、多药耐药基因1（MDR1）的表达变化。结果NT组细胞在培养12、24、48、72h时的活细胞数分别为0．053±O．003、0．074±0．004、0．148±0．015、0．192±0．038,而HT组分别为0．069±0．003、0．155±0．022、0．224±0．022、0．308±0．069;NT和HT组的细胞增殖受到抑制,NT组与NN及NI组、HT组与HN及HI组间的活细胞数分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。各组细胞的凋亡率分别是,NN组（29．27±0．18）％、NI组（31．13±0．08）％、NT组（51．11±0．14）％、HN组（11．46±0．28）％、HI组（15．77±0．49）％、HT组（40．05±0．97）％;HT组与HN及HI组、NT组与NN及NI组间分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。各组细胞的侵袭能力由高到低依次为HI、HN、NI、NN、HT、NT组,分别为（40±9）％、（37±12）％、（28±5）％、（26±7）％、（19±7）％、（10±5）％;NT组与NN及NI组、HT组与HN及HI组间分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。NT组细胞HIF-1α、VEGF、GLUT1、MDR1 mRNA的相对表达量分别为0．05±0．12、0．09±0．11、0．08±0．15、0．05±0．15,而HT组分别为0．04±0．16、0．16±0．16、0．12±0．20、0．20±0．21;NT组与NN及NI组、HT组与HN及HI组间分别比较,HIF-1α、VEGF、GLUT1、MDR1 mRNA的相对表达量均有降低,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论HIF-1α可能主要通过其下游的靶基因对宫颈癌细胞的恶性生物学行为产生影响,包括抗凋亡、促增殖、增加血液供应和能量供应、耐药等,且体外抑制HIF-1α的表达对宫颈癌细胞有抑制作用。     

PTEN基因敲减后HEC-1A细胞生长和信号通路变化的研究

目的构建人PTEN基因RNAi慢病毒载体，观察PTEN基因敲减前后人子宫内膜癌HEC-1A细胞生长和信号通路的变化，为进一步研究子宫内膜癌的发病机制提供基础。方法利用慢病毒载体系统，构建人PTEN基因RNAi慢病毒载体，转染HEC-1A细胞，建立PTEN基因敲减细胞模型HEC-1A-ND；Western Blot方法检测PTEN基因敲减前后PTEN蛋白的表达和AKT通路的活化情况，MTT法检测PTEN敲减前后细胞增殖的变化，流式细胞术检测PTEN敲减前后细胞周期的变化。结果慢病毒介导的RNAi能有效下调PTEN基因的表达，PTEN基因表达下调后，HEC-1A细胞生长受到促进，S期细胞增多，G0-G1期细胞和G2／M期细胞减少，P13K／AKT通路激活。结论成功构建人PTEN基因RNAi慢病毒载体。PTEN基因敲减后，可以通过激活P13K／AKT通路，促进细胞生长。     

MDR1及MDR3基因沉默逆转卵巢上皮性癌细胞对紫杉醇耐药的实验研究

目的 研究多药耐药基因——MDR1及MDR3基因沉默逆转卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞A2780／taxol对紫杉醇耐药的作用。方法 用真核质粒介导的针对MDR 1及MDR3基因的短发夹状RNA（shRNA）转染A2780／taxol细胞（分别为MDR1组、MDR3组）,空质粒转染作为对照（空载体组）。流式细胞仪分别检测细胞早期凋亡、罗丹明123（Rh123）积聚情况,末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法（TUNEL）检测细胞晚期凋亡情况,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞对紫杉醇的半数抑制浓度（IC50）,RT-PCR技术检测MDR1及MDR3mRNA的表达,蛋白印迹法（western blot）检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）蛋白的表达。结果转染后,MDR1组及MDR3组A2780／taxol细胞的早期凋亡率分别达（20．21±0．56）％和（10．87±1．24）％。MDR1、MDR3组A2780／taxol细胞内的Rh123平均荧光强度分别为116．6±8．1、98．4±3．8,显著高于空载体组的40．2±1．6,差异有统计学意义（P〈0．05）。TUNEL检测显示细胞发生了晚期凋亡。MDR1、MDR3组A2780／taxol细胞对紫杉醇的IC50明显下降,分别与空载体组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。转染48h后,A2780／taxol细胞中MDR1和MDR3mRNA的表达水平分别下降了（73．3±0．8）％和（51．6±0．4）％;MDR1、MDR3组细胞caspase-3的表达量分别为（80．8±2．6）％、（72．0±4．7）％,均较空载体组增加。结论 MDR1及MDR3基因沉默能恢复A2780／taxol细胞对紫杉醇的敏感性并诱导细胞凋亡,从而逆转A2780／taxol细胞对紫杉醇的耐药性。     

Edg4基因小分子干扰RNA载体的构建及其对卵巢上皮性癌细胞的沉默效应

目的构建针对Edg4基因的小分子干扰RNA（siRNA）载体,初步观察其对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞的沉默效应。方法利用软件分析、设计针对人Edg4 mRNA的siRNA靶序列,合成发夹样DNA序列;退火成双链,克隆至真核表达载体pRNAT—U6．1质粒上,经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实其序列无误后,用脂质体包裹并转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,用荧光显微镜初步观察其在SKOV3细胞中的转染率。采用实时荧光定量荧光定量PCR技术检测转染前后SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,生化法测定转染前后SKOV3细胞上清液中溶血磷脂酸（LPA）含量的变化,流式细胞术检测转染后SKOV3细胞的凋亡率。结果经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实重组真核表达载体的序列无误,并将此命名为pRNAT—U6．1—siEdg4。荧光显微镜下观察,转染后SKOV3细胞内有明显绿色荧光信号,转染率为64％;实时荧光定量PCR技术检测显示,转染后SKOV3细胞的Edg4 mRNA表达水平（0．05±0．01）明显低于转染前（0．29±0．04,P〈0．05）;SKOV3细胞上清液中LPA的含量,转染后明显低于转染前[分别为（3．0±1．0）、（7．5±2．2）μmol／L;P〈0．05];流式细胞仪检测显示,转染后SKOV3细胞的凋亡率明显高于转染前（分别为53．38％、0．51％;P〈0．05）。结论本研究成功构建了针对人Edg4基因的siRNA真核表达载体,并能较高效转染SKOV3细胞,转染后能明显抑制SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,诱导卵巢癌细胞凋亡。     

BRMS1基因抑制卵巢上皮性癌细胞体内外转移的实验研究

目的 研究BRMS1基因转染卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞后对其体内外转移的抑制作用。方法 应用脂质体介导法将BRMS1基因转染人卵巢癌细胞株A2780细胞内（转染组）,设未进行任何转染的A2780细胞为空白对照组,转染空载体pcDNA3质粒者为阴性对照组。体外观察转染前后3组细胞增殖、凋亡、细胞间缝隙通讯连接、黏附转移情况及超微结构的变化。建立裸鼠人卵巢癌移植瘤模型,观察3组裸鼠BRMS1基因抑制肿瘤体内转移的作用。结果 BRMS1基因成功转染入A2780细胞中。BRMS1基因转染后,空白对照组细胞生长速度与阴性对照组和转染组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;空白对照组、阴性对照组及转染组细胞的每孔克隆数分别为（42±7）、（39±4）及（40±4）个,3组间比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;3组细胞S期和G：／M期、Gn／G,期比例比较,差异也无统计学意义（P〉0．05）。转染组细胞问缝隙通讯连接功能增强。细胞侵袭实验显示,转染组转入底层膜的细胞数[（112±23）个]明显低于空白对照组和阴性对照组[分别为（306±49）、（322±91）个;P〈0．01]。BRMS1基因转染后,裸鼠体内转移灶,转染组为（23±7）个,分别与空白对照组和阴性对照组[分别为（96±12）、（112±20）个]比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论 作为转移抑制基因,BRMS1基因可抑制卵巢癌细胞的转移。     

过氧化物酶体增殖物激活受体γ及其配体对早孕期绒毛组织及细胞滋养细胞浸润能力的影响

目的探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）及其配体对早孕期绒毛组织及细胞滋养细胞浸润能力的影响。方法采用免疫组化方法、免疫荧光细胞化学染色法、蛋白印迹法和RT-PCR技术检测20例孕6～8周（早孕早期组）及20例孕11～12周（早孕晚期组）绒毛组织及细胞滋养细胞中的PPARγ蛋白及其mRNA的表达;并检测不同浓度PPARγ激动配体——15-脱氧-前列腺素J2（15-d-PGJ2）和曲格列酮,以及不同浓度拮抗配体——双酚丙烷二环氧甘油醚（BADGE）对原代无血清培养的细胞滋养细胞浸润能力的影响。结果（1）PPARγ／蛋白在早孕早期组和早孕晚期组绒毛组织中均有表达,主要定位在细胞滋养细胞核中,合体滋养细胞及绒毛间质细胞中无表达。（2）早孕早期组绒毛组织和培养的细胞滋养细胞中,PPARγ／蛋白表达水平分别为1．35±0．08、1．13±0．11,PPARγ／mRNA表达水平分别为36．0±5．1、13．4±3．1;早孕晚期组绒毛组织和培养的细胞滋养细胞中,PPARγ／蛋白表达水平分别为1．17±0．03、0．86±0．05,PPARγ mRNA表达水平分别为23．3±5．5、6．1±1．3,早孕晚期组PPARγ蛋白及其mRNA表达水平明显低于早孕早期组,两组分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（3）PPARγ／激动配体15-d-PGJ2和曲格列酮均有抑制细胞滋养细胞的浸润的作用。15-d-PGJ2浓度为1、10μmol／L,曲格列酮浓度为10μmol／L时,早孕早期组细胞滋养细胞浸润指数分别为0．57±0．03、0．43±0．02、0．50±0．06,早孕晚期组分别为0．69±0．02、0．59±0．03、0．66±0．05,两组分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（4）PPARγ拮抗配体BADGE浓度为20、50μmol／L时,早孕早期组细胞滋养细胞浸润指数分别为1．23±0．07和1．58±0．04;早孕晚期组分别为1．05±0．03和1．38±0．08,两组分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论PPARγ／在调节滋养细胞浸润过程中起重要作用;在早孕期胎盘绒毛组织,PPARγ／激动配体可抑制滋养细胞浸润;PPARγ／拮抗配体可促进滋养细胞浸润,且能部分逆转激动配体的作用。     

促肾上腺皮质激素释放激素、c-Fos及间隙连接蛋白43与分娩发动的相关性

目的探讨促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、c—Fos和间隙连接蛋白43（Cx43）在足月妊娠子宫平滑肌细胞中的表达变化及其与分娩发动的相关性。方法选择2006年2—9月在中南大学湘雅二医院住院的足月临产产妇30例（临产组）,足月未临产产妇30例（未临产组）,因宫颈上皮内瘤样病变行子宫切除术患者30例（对照组）。应用放射免疫方法测定3组妇女静脉血中CRH的水平;用核酸原位杂交技术和免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（SP）法检测3组妇女子宫平滑肌细胞中c—Fos、Cx43 mRNA及其蛋白的表达水平。结果（1）CRH水平在临产组产妇为（81．8±11．9）pmol／L,未临产组为（34．5±18．6）pmol／L,对照组为（1．3±0．7）pmol／L,临产组明显高于未临产组及对照组,未临产组明显高于对照组,差异均统计学意义（P〈0．05）。（2）c—Fos mRNA及其蛋白的阳性染色主要定位于子宫平滑肌细胞核内,少量位于细胞质内;子宫平滑肌细胞中c—Fos mRNA及其蛋白表达水平,临产组分别为5．4±1．7及5．4±1．5,未临产组分别为4．1±0．9及3．9±0．9,对照组分别为1．0±0．4及1．2±0．4,临产组明显高于未临产组及对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）;未临产组也明显高于对照组（P〈0．05）。（3）Cx43 mRNA及其蛋白的阳性染色定位于子宫平滑肌细胞质内;子宫平滑肌细胞中Cx43 mRNA及其蛋白表达水平,临产组分别为5．5±1．4及5．6±1．3,未临产组分别为4．1±0．6及4．1±0．5,对照组分别为1．5±0．6及1．1±0．6,临产组明显高于未临产组及对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）;未临产组也明显高于对照组（P〈0．05）。（4）3组妇女的CRH水平与子宫平滑肌细胞中c—Fos mRNA及其蛋白的表达水平呈明显正相关（r5=0．61,r6=0．50;P〈0．05）;与子宫平滑肌细胞中Cx43 mRNA及其蛋白的表达水平呈明显正相关（r3=0．52,r4=0．68;P〈0．05）;子宫平滑肌细胞中c—Fos mRNA及其蛋白的表达水平与Cx43 mRNA及其蛋白的表达水平也呈明显正相关（r5=0．51,r6=0．60;P〈0．05）。结论产妇血浆中CRH水平、子宫平滑肌细胞中c—Fos和Cx43的表达与分娩发动有一定的关系,且3者间水平变化均呈明显正相关。     

趋化因子CXCL12及其受体CXCR4对卵巢上皮性癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的 探讨趋化因子CXCL12及其受体CXCR4对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法采用RT—PCR技术和免疫细胞化学染色法检测卵巢癌细胞株CAOV3细胞中CXCL12、CXCR4mRNA和蛋白的表达,以及CXCL12（100ng／m1）作用后CAOV3细胞中整合素B1和血管内皮生长因子C（VEGF—C）mRNA的表达。实验分为6组：对照组（未加药）,实验组1（加100ng／ml的CXCL12）,实验组2（加10ng／ml的CXCL12）,实验组3（加100ng／ml的CXCL12和10斗g／ml的CXCR4抗体）,实验组4（加100ng／ml的CXCL12和1pg／ml的CXCR4拮抗剂——AMD3100）,实验组5（加10μg／ml的CXCR4抗体或卵巢癌腹水）。采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测CXCL12对CAOV3细胞增殖的影响。以穿膜小室为模型,采用重组细胞基底膜迁移、侵袭实验检测CXCL12和卵巢癌腹水对CAOV3细胞迁移、侵袭的影响。结果 CAOV3细胞中,CXCR4蛋白呈棕黄色强阳性表达,CXCR4mRNA的表达水平为0．70±0．10,经100ng／ml的CXCL12作用24h时CXCR4mRNA的表达水平（1．24±0．14）显著增加（t=-7．1088,P=0．0021）;CXCL12蛋白和mRNA均无表达。100ng／ml的CXCL12作用3h时整合素131mRNA表达水平即显著增加（作用前后分别为0．53±0．10、1．53±0．16,P〈0．01）,24h时VEGF—CmRNA表达水平显著增加（作用前后分别为0．52±0．09、1．11±0．15,P〈0．01）。对CAOV3细胞的增殖作用,实验组1分别与对照组和实验组2比较均明显增强（3组分别为0．428±0．051、0．325±0．045、0．328±0．039,P〈0．05）;实验组1分别与实验组3和实验组4比较均明显被抑制（后两组分别为0．356±0．031、0．373±0．029,P〈0．05）;而实验组5（0．349±0．038）与对照组比较,差异则无统计学意义（P〉0．05）。对CAOV3细胞的迁移和侵袭作用,实验组1分别与对照组和实验组2比较均明显增强[迁移细胞数分别为（523．3±25．2）、（108．0±7．2）、（211．7±24．7）个,侵袭细胞数分别为（39．3±4．0）、（4．0±1．0）、（15．7±3．1）个;P均〈0．01];实验组1分别与实验组3和实验组4比较均明显被抑制（P〈0．05）;但实验组5[即加入卵巢癌腹水组;迁移细胞数为（706．6±30．6）个,侵袭细胞数为（61．7±7．6）个]显著多于实验组1（P〈0．05）。结论 CXCL12可促进卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭,并上调整合素B1和VEGF—CmRNA的表达,此作用可被CXCR4抗体抑制,表明CXCL12在卵巢癌的生长和转移中发挥一定作用。     

稳定转染PTEN基因后对卵巢上皮性癌细胞磷酸酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号传导通路的影响

目的 研究外源性PTEN基因稳定转染卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞后,对卵巢癌细胞磷酸酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号传导通路的影响.方法 构建表达野生型PTEN基因的重组载体pcDNA3.1A-PTEN质粒,并转染卵巢癌细胞株HO-8910细胞(重组载体组),以转染空载体pcDNA3.1A质粒(空载体组)作为阴性对照,以未转染质粒(空白组)作为空白对照.采用逆转录(RT)PCR技术检测3组细胞中PTEN、Akt1、Akt2、PI3K mRNA的表达水平,蛋白印迹法检测3组细胞中PTEN蛋白的表达强度,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测3组细胞的生长情况[以吸光度(A)值表示,A值越大表示生长速度越快].结果 表达野生型PTEN基因的重组载体pcDNA3.1A-PTEN质粒,经测序证实构建成功.重组载体组细胞中PTEN mRNA的表达水平为(17372±23)copy/ml,高于空载体、空白组[分别为(39±1)、(78±4)copy/ml],差异均有统计学意义(P＜0.05);重组载体组细胞中PTEN蛋白的表达强度也明显高于空载体、空白组.重组载体组细胞中Akt1、Akt2、PI3KmRNA的表达水平分别为(28±2)、(7±1)、(61±2)copy/ml,低于空载体[分别为(115±5)、(18±2)、(84±2)copy/ml]、空白组[分别为(77±4)、(17±2)、(1349±7)copy/m1],差异均有统计学意义(P＜0.05).培养第5天,重组载体组细胞生长速度(A值)为90 158±47,低于空载体、空白组(分别为148 251±65、250 115±62),差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 转染表达野生型PTEN基因的重组载体能有效提高卵巢癌HO-8910细胞中PTEN mRNA和蛋白的表达,抑制细胞生长,并通过显著降低Akt1、Akt2、PI3K mRNA的表达水平,明显抑制PI3K/Akt信号传导通路.     

RNA干扰技术阻抑survivin基因表达对子宫颈癌细胞放射和化疗敏感性的影响

目的探讨利用RNA干扰(RNAi)技术阻抑survivin基因的表达,对宫颈癌HeLa细胞放射敏感性和化疗敏感性的影响。方法通过脂质体介导,将含survivin基因小分子干扰RNA的重组真核表达质粒pSilencer2．1-s2、阴性对照质粒pSilencer2．1-NC和空载质粒pSilencer2．1-U6 neo转染宫颈癌细胞系HeLa,获得HeLa-s2、HeLa-NC和HeLa-U6 neo细胞,同时设未转染的HeLa细胞为阴性对照。RT-PCR技术、蛋白印迹法分别检测survivin mRNA和蛋白的表达水平,并计算survivin mRNA和蛋白表达抑制率;激酶活性检测法测定波长在405 nm处的吸光度(A405)值,表示半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)活性;流式细胞仪检测细胞凋亡率;平板克隆形成实验观察细胞的放射敏感性变化,以克隆形成率表示;四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞存活率并计算顺铂的50％抑制浓度(IC50)。结果与HeLa-NC、HeLa-U6 neo及未转染的HeLa细胞比较,HeLa-s2细胞survivin mRNA和蛋白表达水平明显下降,survivin mRNA和蛋白表达抑制率分别为(62．8±0．3)％和(60．1±0．5)％。HeLa-s2细胞的A405值为1．261±0．043,未转染的HeLa细胞的A405值为0．314±0．012,两者比较,差异有统计学意义(P<0．05)。HeLa-s2与未转染的HeLa细胞相比,细胞凋亡率明显升高(P<0．05),分别为(29．23±1．41)％和(2．74±0．32)％。不同照射剂量下,HeLa-s2与未转染的HeLa细胞分别比较,克隆形成率均明显降低(P<0．05)。在同一顺铂浓度下,HeLa-s2与未转染的HeLa细胞比较,细胞存活率显著降低(P<0．05),HeLa-s2细胞对顺铂的IC50值较未转染的HeLa细胞下降显著(P< 0．05),分别为(0．873±0．021)和(9．212±0．033)μg／ml。结论利用RNAi技术可阻抑HeLa细胞中survivin基因的表达,增强caspase-3活性,诱导细胞凋亡,显著提高细胞的放射敏感性和对顺铂的化疗敏感性。     

X染色体相关凋亡抑制蛋白的小分子干扰RNA对卵巢上皮性癌细胞生长的影响

目的 探讨X染色体相关凋亡抑制蛋白(XIAP)的小分子干扰RNA对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞系SKOV3细胞生长的影响.方法 设计和合成长度为64 nt的脱氧寡核苷酸链,克隆至pSUPER质粒,转化大肠埃希菌DH5α菌株,构建重组质粒pSUPER-siXIAP,对其进行双酶切和DNA序列分析鉴定.间接免疫荧光染色法鉴定SKOV3细胞XIAP蛋白的表达.实验分为4组:分别用重组质粒pSUPER-siXIAP(pSUPER-siXIAP组)及阴性无关序列重组对照质粒pSUPER-nsRNA(pSUPER-nsRNA组)及空载体质粒pSUPER(pSUPER组)转染SKOV3细胞,以未转染质粒的SKOV3细胞为空白对照组.RT-PCR技术检测各组细胞XIAP mRNA的表达,蛋白印迹法检测各组细胞XIAP蛋白的表达,流式细胞仪分析各组细胞细胞周期的变化,四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察各组细胞生长的变化.结果 本实验成功构建了XIAP特异性的RNA干扰载体pSUPER-siXIAP质粒.间接免疫荧光染色法检测证实SKOV3细胞中存在XIAP蛋白的过度表达.转染后72 h,SKOV3细胞XIAP蛋白表达水平降低,空白对照组、pSUPER组、pSUPER-nsRNA组及pSUPER-siXIAP组的相对密度值分别为3584±124、2138±65、1973±80和110±12,各组间比较,差异有统计学意义(P=0.0334);转染后72 h,SKOV3细胞XIAP mRNA表达水平明显下降,空白对照组、pSUPER组、pSUPER-nsRNA组及pSUPER-siXIAP组各组的相对密度值分别为6674±274、4532±107、2322 ±57和1864±78,各组间比较,差异有统计学意义(P=0.0127).流式细胞仪检测结果显示,pSUPER-siXIAP组G1期细胞较空白对照组、pSUPER组明显增加(P＜0.05);pSUPER-siXIAP组S期细胞较空白对照组、pSUPER组明显减少(P＜0.05).MTT比色法检测结果显示,pSUPER-siXIAP组细胞生长增殖被抑制,生长速度较空白对照组细胞明显减慢(P=0.0237);pSUPER-nsRNA组和pSUPER组细胞生长速度较空白对照组细胞也明显减慢(P=0.0441,P=0.0472).结论 本研究成功构建了XIAP RNA干扰载体pSUPER-siXIAP质粒,将其转染SKOV3细胞后可有效降低其XIAP mRNA及蛋白的表达水平,并将SKOV3细胞阻滞于G1期,造成转染细胞生长速度减慢,这有望为卵巢癌基因治疗提供一个新的有希望的分子靶点.     

Over-expression of PTEN sensitizes human ovarian cancer cells to cisplatin-induced apoptosis in a p53-dependent manner

OBJECTIVE: Resistance to cisplatin-centered chemotherapy is a major cause of treatment failure in human ovarian cancer. Whereas PTEN, a tumor suppressor gene product, is believed to promote apoptosis primarily via inactivation of the PI3K/Akt cell survival pathway, recent evidence suggests that PTEN may function independently of this pathway. Activation of p53 is a key determinant of sensitivity to cisplatin-induced apoptosis. Whether PTEN can facilitate cisplatin sensitivity, and this involves the activation of p53, remains unclear. In this study, we determined whether and how PTEN over-expression sensitizes ovarian cancer cells to CDDP-induced apoptosis. METHODS AND RESULTS: Using pairs of chemosensitive and chemoresistant ovarian cancer cell lines (OV20028 vs. C13* and A2780-s vs. A2780-cp) as an in vitro model, we have examined the influence of PTEN over-expression in regulation of cisplatin-induced apoptosis. Apoptosis was assessed morphologically by Hoechst staining and confirmed by the detection of cleaved products of caspase-3 and PARP by Western blot. Over-expression of PTEN by PTEN cDNA transfection up-regulates p53 content and increases the sensitivity of chemoresistant cells to cisplatin-induced apoptosis without detectable changes in the levels of phosphorylated Akt and FKHR as well as FasL mRNA abundance as determined by Western blot and RT-PCR, respectively. PTEN-mediated chemosensitization was attenuated by p53 down-regulation by siRNA in C13*, a chemoresistant wild-type p53 cell. Moreover, PTEN over-expression failed to sensitize the chemoresistant p53 mutant ovarian cancer cell line A2780-cp to cisplatin-induced apoptosis, unless wild-type p53 was reconstituted by adenoviral p53 infection. CONCLUSION: Taken together, these data suggest that PTEN over-expression may represent a novel therapeutic approach for chemoresistant human ovarian cancer and that this may involve a p53-mediated apoptotic cascade independent of the PI3K/Akt pathway.     

白介素-28 A增加顺铂对卵巢癌细胞毒性的作用及机制研究

目的:探讨白介素-28A(IL-28A)增强顺铂对卵巢癌的细胞毒性作用及其机制.方法:实时荧光定量PCR法检测卵巢癌组织和细胞及正常卵巢上皮组织和细胞中IL-28A水平.IL-28A(100ng/ml)预处理C13K细胞24h,CCK-8和流式细胞术分别检测顺铂对C13K细胞半数抑制浓度(IC50)、细胞存活率和细胞凋...     

磷脂酰肌醇3激酶在卵巢上皮性癌组织中的表达及其抑制剂对卵巢上皮性癌细胞生长抑制作用的研究

目的 探讨细胞信号转导信使磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)在卵巢上皮性癌(卵巢癌)组织中的表达及其意义;并探讨PI3K抑制剂LY294002联合顺铂对卵巢癌细胞株的生长抑制作用.方法 应用蛋白印迹法和RT-PCR技术检测正常卵巢组织(正常组,20份)、卵巢良性上皮性肿瘤组织(良性组,6份)、卵巢交界性上皮性肿瘤组织(交界性组,6份)和卵巢癌组织(卵巢癌组,39份)中PI3K p85亚单位蛋白和mRNA的表达.将SKOV3细胞分为对照组(只加培养液)、LY294002组(加1、10、30、50、100 μmol/L LY294002)、顺铂组(加0.33、1.25、2.5、5、10 μmol/L顺铂)和联合组(加50 μmol/L LY294002+10 μmol/L顺铂),四甲基偶氮唑蓝还原法测定不同浓度的LY294002及顺铂对SKOV3细胞的生长抑制作用.结果 (1)PI3K p85亚单位蛋白的表达阳性率:正常组和良性组均为0,交界性组为2/6,卵巢癌组为85%(33/39),正常组、良性组、交界性组分别与卵巢癌组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).(2)PI3K p85亚单位mRNA的表达水平:正常组为0.178±0.102,良性组为0.643±0.112,交界性组为0.847±0.058,卵巢癌组为1.689±0.423,正常组、良性组、交界性组分别与卵巢癌组比较,差异均有统计学意义(P＜0.01).卵巢癌组织中,PI3K p85亚单位蛋白表达阳性率及mRNA的表达水平,不同年龄、病理类型间比较,差异均无统计学意义(P＞0.05);而不同病理分化程度、手术病理分期间比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).(3)LY294002及顺铂呈剂量依赖性地抑制SKOV3细胞的生长.LY294002组(50 μmol/L)、顺铂组(10 μmol/L)、联合组SKOV3细胞的抑制率分别为(46.0±2.0)%、(44.4±3.2)%、(57.1±4.1)%,联合组SKOV3细胞的抑制率高于LY294002组及顺铂组(P＜0.01).结论 PI3K p85亚单位在卵巢癌组织中呈高表达,与病理分化程度、手术病理分期有关.LY294002与顺铂联合用药对卵巢癌细胞生长的抑制具有协同效应.     

核因子κB顺式诱骗寡脱氧核苷酸对子痫前期患者脐血清培养的脐动脉平滑肌细胞功能的影响

目的 探讨核因子κB顺式诱骗寡脱氧核苷酸(ODN)对子痫前期患者脐血清诱导人脐动脉平滑肌细胞(HUASMC)前胶原Ⅰ、Ⅲ及肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达的影响.方法 将原代培养的HUASMC分4组:A组(加入正常新生儿脐血清培养)、B组(加入子痫前期患者的新生儿脐血清培养)、C组(加入子痫前期患者的新生儿脐血清及核因子κB顺式诱骗ODN培养)和D组(加入子痫前期患者的新生儿脐血清及无序ODN培养).通过四甲基偶氮唑蓝比色法及流式细胞仪检测各组HUASMC的增殖活力[以吸光度(A)表示]和凋亡率;应用RT-PCR检测各组HUASMC的前胶原Ⅰ、ⅢmRNA的表达,蛋白印迹法检测TNF-α蛋白的表达[均以A值表示].结果 (1)增殖活力:A组为0.11±0.02,B组为0.19±0.02,C组为0.14±0.02,D组为0.18±0.03;B、C、D组增殖活力显著高于A组(P＜0.05),B、D组显著高于C组(P＜0.05).(2)凋亡率:A组为(14.3±1.2)%,B组为(7.8±1.3)%,C组为(10.1±1.2)%,D组为(8.1±1.3)%;B、C、D组凋亡率显著低于A组(P＜0.05),B组与C组比较,差异也有统计学意义(P＜0.05).(3)前胶原Ⅰ mRNA:A组为0.16±0.02,B组为0.31±0.04,C组为0.23±0.04,D组为0.30±0.03,B、C、D组前胶原Ⅰ mRNA表达水平显著高于A组(P＜0.05),B组与C组比较,差异也有统计学意义(P＜0.05).(4)前胶原ⅢmRNA:4组前胶原ⅢmRNA表达水平相互比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).(5)TNF-α蛋白:A组为0.15±0.03,B组为0.74±0.11,C组为0.36±0.09,D组为0.79±0.12,B、C、D组TNF-α蛋白表达显著高于A组(P＜0.05);B、D组又显著高于C组(P＜0.05),但B组与D组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 核因子κB顺式诱骗ODN能降调子痫前期患者脐血清促HUASMC增殖、胶原合成及炎性因子合成的作用.核因子κB在子痫前期患者胎盘血管病变过程中可能起重要作用.     

卵巢上皮性癌组织中水通道1蛋白和mRNA的表达及其临床意义

目的探讨水通道1(AQP1)蛋白和mRNA在卵巢上皮性癌组织中的表达及其临床意义。方法采用免疫组化法、蛋白印迹法和RT-PCR技术检测35例卵巢上皮性癌、15例卵巢交界性上皮性肿瘤、15例卵巢良性上皮性肿瘤组织中AQP1蛋白和mRNA的表达,并以13例正常卵巢组织为对照。结果AQP1蛋白主要表达于卵巢上皮性肿瘤和正常卵巢组织的毛细血管及小血管内皮细胞膜,卵巢上皮性癌和卵巢交界性上皮性肿瘤组织中AQP1蛋白表达水平分别为0.39±0.12和0.43±0.21,AQP1mRNA表达水平分别为0.93±0.51和0.95±0.34,均明显高于卵巢良性上皮性肿瘤和正常卵巢组织(AQP1蛋白表达水平分别为0.27±0.13和0.24±0.13,AQP1mRNA表达水平分别为0.51±0.41和0.34±0.29;P<0.05)。卵巢上皮性癌患者腹水量≥1000ml者其癌组织中AQP1蛋白表达水平为0.46±0.13、AQP1mRNA表达水平为1.25±0.57,明显高于腹水量为1～499ml者(AQP1蛋白表达水平为0.35±0.11,AQP1mRNA表达水平为0.75±0.45;P<0.05);卵巢上皮性癌组织中AQP1蛋白和mRNA表达与其手术病理分期、病理类型、病理分级和有无淋巴结转移无关(P>0.05)。结论AQP1蛋白和mRNA过度表达在卵巢上皮性癌发生、发展中起一定的作用,是其腹水形成的原因之一。