子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A细胞雌激素受体表达

目的研究子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A雌激素受体(ER)的表达情况。方法应用免疫细胞化学和逆转录酶-多聚酶链反应(RT-PCR)技术,检测Ishikawa和HEC-1A细胞中ERα、ERβ蛋白和mRNA表达水平。结果Ishikawa细胞中,ERα、ERβ蛋白均呈阳性表达,而在HEC-1A细胞中ERα呈弱阳性表达,ERβ阴性表达;Ishikawa细胞中ERα、ERβmRNA表达水平均显著高于HEC-1A细胞;(P<0.01)。结论Ishikawa细胞是ER阳性子宫内膜癌细胞系,而HEC-1A细胞则为ER低表达细胞系。     

雌激素受体亚型α对子宫内膜癌细胞HEC-1B侵袭能力调控的研究

目的：特异性下调子宫内膜癌细胞中的ERα基因，探讨E胁亚型表达在子宫内膜癌侵袭中的作用。方法：将ERa的小干扰RNA（siRNA-small interfering RNA）转染子宫内膜癌细胞HEC-1B，通过RT-PCR和Western blot证实ERα基因的有效阻断。通过transwell小室法检测下调ERa基因表达前后HEC-1B细胞的侵袭能力；应用RT-PCR检测转染前后细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA表达水平的变化；Western blot及明胶酶谱分别检测细胞分泌TIMP-1、TIMP-2、MMP-2和MMP-9蛋白的水平。结果：（1）将ERα-siRNA转染HEC-1B细胞后，转染效率大于90％，ERα mRNA及蛋白的表达水平均明显下调（分别为72％，67％）；（2）下调ERα基因表达后，肿瘤细胞的侵袭能力下降（P〈0．05）；在mRNA水平和蛋白水平均可检测到ERα-siRNA组细胞的MMP-2、MMP-9表达下降（P〈0．05），TIMP-1、TIMP-2表达增加（P〈0．05）。结论：使用ERα-siRNA能够有效地阻断ERa基因表达；子宫内膜癌细胞中，17β-雌二醇对MMPs／TIMPs具有调节作用，这种作用可通过ERα介导；ERα表达水平影响子宫内膜癌细胞的侵袭能力。     

子宫内膜癌细胞中细胞膜雌激素受体表达的初步研究

目的探讨子宫内膜癌细胞中细胞膜雌激素受体的表达情况。方法对子宫内膜癌高分化细胞系Ishikawa和中分化细胞系HEC-1A的细胞膜和整个细胞(包括细胞膜、细胞质和细胞核)雌激素受体(ER)α、β表达情况进行研究。用来检测细胞膜雌激素受体的细胞经固定处理,用来检测整个细胞ER的细胞经渗透处理,分别对固定与渗透处理的Ishikawa和HEC-1A细胞进行间接免疫荧光染色,并在荧光显微镜下观察ER的分布。另对Ishikawa和HEC-1A活细胞(用来检测细胞膜雌激素受体)、渗透处理的Ishikawa和HEC-1A细胞(用来检测整个细胞ER)进行间接免疫荧光染色,并用流式细胞仪检测ER的相对荧光强度来表示ER的表达强度。以上实验均以未用一抗的细胞为阴性对照。结果荧光显微镜下观察显示,固定处理的Ishikawa和HEC-1A细胞膜均可见ERα和ERβ标记的荧光,渗透处理的Ishikawa和HEC-1A细胞,除细胞膜外,在细胞内部也可见ERα和ERβ标记的荧光。流式细胞仪检测显示,Ishikawa活细胞ERα及ERβ相对荧光强度分别为1．09±0．21和1．27±0．33,高于阴性对照(均为1．00),但两者分别与阴性对照比较,差异均无统计学意义(P＞0．05);渗透处理的Ishikawa细胞ERα及ERβ相对荧光强度分别为4．21±0．34和4．69±1．96,均高于活细胞,两者分别与活细胞比较,差异均有统计学意义(P＜0．05)。HEC-1A活细胞ERα及ERβ相对荧光强度分别为1．58±0．13和1．49±0．04,高于阴性对照(均为1．00),与阴性对照分别比较,差异均有统计学意义(P＜0．05);渗透处理的HEC-1A细胞ERα及ERβ相对荧光强度分别为2．34±0．33和2．52±0．15,均高于活细胞,两者分别与活细胞比较,差异均有统计学意义(P＜0．05)。结论子宫内膜癌细胞系Ishikawa和HEC-1A细胞中均存在细胞膜雌激素受体。     

ERRα过度表达对子宫内膜癌Ishikawa细胞内分泌治疗的影响

目的探讨孤儿受体-雌激素受体相关受体α（ERRα）在子宫内膜癌Ishikawa细胞中过度表达对内分泌治疗的影响。方法重组并构建含有绿色荧光蛋白（GFP）和G418耐药筛选标记的真核表达质粒pEGFP-N1-3FLAG-ERRα,瞬时转染子宫内膜癌细胞株Ishikawa后采用实时荧光定量PCR技术和蛋白印迹法检测ERRαmRNA和蛋白的表达情况。使用不同浓度的ICI182780处理子宫内膜癌Ishikawa细胞、Ishikawa-空载体细胞（Ishikawa-空）和ERRα过度表达的（Ishikawa-ERRα）细胞,流式细胞技术检测分析10-6mol/LICI182780对细胞诱导的凋亡情况。结果瞬时转染pEGFP-N1-ERRα质粒后,Ishikawa在mRNA和蛋白水平均能检测到ERRα的表达增加。流式细胞仪细胞凋亡分析表明,ERRα过度表达导致子宫内膜癌细胞Ishikawa耐受ICI182780的诱导凋亡作用（P〈0.05）。结论 ERRα过度表达为激素依赖性的子宫内膜癌细胞株Ishikawa提供了一种耐受内分泌治疗的机制。     

子宫内膜癌细胞雌激素受体亚型的调控和功能的初步研究

目的初步建立子宫内膜癌雌激素受体（ER）亚型α或β弱表达的细胞模型,研究雌激素及他莫昔芬（TAM）与ER亚型的关系。方法分别设计针对ERα和ERβ的反义寡脱氧核苷酸（ODN）、正义ODN、错义ODN,并转染子宫内膜癌细胞株Ishikawa,将Ishikawa细胞分为4组,即未转染组、反义ODN组、正义ODN组及错义ODN组。蛋白印迹法测定转染后细胞ERα和ERβ蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测转染ODN后,17β雌二醇和TAM对Ishikawa细胞生长的影响。结果（1）分别针对ERα及ERβ的反义ODN可以选择性下调转染的Ishikawa细胞中ERα及ERβ蛋白的表达（分别下调45％和54％）。（2）17β雌二醇及TAM可以促进未转染组Ishikawa细胞的生长。转染ERα反义ODN后,可抑制17β雌二醇及TAM对Ishikawa细胞的促生长作用,以转染后的24、48及72h为著,反义ODN组各时间点分别与未转染、正义ODN、错义ODN组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（3）转染ERβ反义ODN后,17β雌二醇对Ishikawa细胞的促生长作用的改变不明显。转染ERβ反义ODN可抑制TAM对Ishikawa细胞的促生长作用,以转染后72h为著,反义ODN组分别与未转染、正义ODN、错义ODN组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论（1）反义核酸技术能够特异性地有效下调Ishikawa细胞中ERα和ERβ蛋白的表达,其可作为子宫内膜癌细胞中ER调控的一种有效的实验手段。（2）17β雌二醇促进子宫内膜癌细胞生长的作用主要通过ERβ介导;ERβ和ERβ均参与TAM促进子宫内膜癌细胞生长的作用。     

子宫内膜癌组织中雌激素受体相关受体亚型的表达及其意义

目的探讨雌激素受体相关受体(ERR)亚型在子宫内膜癌组织中的表达及其临床意义.方法选取46例子宫内膜癌及24例正常子宫内膜新鲜组织,采用RT-PCR技术和免疫组化法检测ERR亚型α、β、γ在组织中的表达,并根据雌激素受体(ER)α的表达情况将其分为ERα(+)和ERα(-)者.结果 ERRα、β、γ的 mRNA和蛋白表达之间均呈明显正相关关系(r=0.462, P=0.009; r=0.689, P=0.016 ; r=0.673, P=0.001).内膜癌组织ERα(+)者中,ERRα mRNA阳性表达率及表达水平(分别为42%,0.24±0.18)均明显低于正常内膜组织ERα(+)者(分别为78%,0.42±0.23;P=0.019,P=0.021);内膜癌组织中ERRβ mRNA阳性表达率及表达水平(分别为23%,0.21±0.16)与正常内膜组织(分别为22%,0.27±0.15)相比,差异无统计学意义(P>0.05);ERRγ mRNA在内膜癌及正常内膜组织中均呈现高表达,ERα(+)的内膜癌组织中ERRγ mRNA的表达水平(0.93±0.24)明显高于正常内膜组织(0.72±0.21,P=0.023).ERRα mRNA表达阳性的内膜癌患者中,手术病理分期为Ⅰ期患者所占百分比(30%)明显低于ERRα mRNA表达阴性者(70%,P=0.017),但其Ⅱ～Ⅳ期患者及深肌层浸润患者所占百分比(分别为70%和78%)均明显高于ERRα mRNA表达阴性者(分别为30%和43%;P=0.017,P=0.033);内膜癌组织中ERRβ mRNA的表达与手术病理分期、病理分级、肌层浸润及淋巴结转移无关(P>0.05);ERRγ mRNA表达阳性的内膜癌患者中,淋巴结有转移患者所占百分比(18%)明显低于ERRγ mRNA表达阴性者(58%,P=0.021),但其与手术病理分期、病理分级及肌层浸润程度无关(P>0.05).结论 ERR亚型可能是ER以外与子宫内膜癌发生关系密切的又一受体.ERRα可能是子宫内膜癌预后不良的指标,而ERRγ高表达可能提示预后良好.     

雌激素受体相关受体亚型在卵巢癌中的表达及其与预后的关系

目的探讨雌激素受体相关受体（ERRs）亚型α、β、γ在卵巢癌中的表达及其与预后的关系。方法激光共聚焦显微镜观察ERRα蛋白在卵巢癌细胞株SKOV3和OVCAR3细胞内的定位。RT-PCR技术检测33份卵巢癌组织以及12份正常卵巢组织中3种ERRs亚型的mRNA表达,并结合临床病理指标分析其预后情况。结果ERRα蛋白主要分布于SKOV3和OVCAR3细胞的细胞核内。卵巢癌组织中ERRα mRNA的阳性表达率（58％）和ERRγ mRNA的阳性表达率（48％）显著高于正常卵巢组织（分别为17％和33％,P〈0．05）;ERRβ mRNA的阳性表达率在卵巢癌组织和正常卵巢组织中都很低（分别为9％和0）,两者比较,差异无统计学意义（P=0．795）。ERRα mRNA的阳性表达与卵巢癌的手术病理分期（r=0．639,P=0．017）、病理分级（r=0．520,P=0．022）呈正相关。ERRα mRNA阳性表达的卵巢癌患者,其中位数整体生存时间（19．0个月）明显短于ERRα mRNA阴性表达患者（31．5个月,P=0．015）,但两者间的无瘤生存时间（分别为12．6和14．5个月）比较,差异无统计学意义（P=0.820）;ERRγ mRNA阳性表达患者的中位数无瘤生存时间（18．0个月）显著长于ERRγ mRNA阴性表达患者（13．5个月,P=0．020）,但两者间中位数整体生存时间（分别为23．4和19．6个月）比较,差异无统计学意义（P=0．093）。结论ERRα蛋白主要表达于卵巢癌细胞核内。ERRα mRNA高表达与卵巢癌患者的预后差有关,而ERRγ mRNA高表达可能提示患者预后较好。     

不同雌激素受体表达状态的子宫内膜癌细胞中转录因子的活性分析

目的 分析并比较不同雌激素受体(ER)表达状态的子宫内膜癌细胞中转录因子的活 性.方法 采用实时荧光定量RT-PCR技术检测子宫内膜癌细胞系RL-952[Erα、Erβ表达均阳性(+)]、HEC-1A[Erα表达弱阳性(±)、Erβ表达阴性(-)]、HEC-1B[Erα、Erβ表达均(-)]细胞中Erα mRNA的表达.采用345通量转录因子芯片检测RL-952、HEC-1A、HEC-1B细胞中转录因子的活性,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法检测不同转录活性的转录因子NFkKBp65、p38MAPK以验证芯片检测结果.结果 Erα mRNA在RL-952、HEC-1A、HEC-1B细胞中表达水平依次递减,分别为(6780±282)、(684±84)、(168±38)copy/ng.转录因子NFkBp65、p38MAPK的转录活性采用ELISA方法检测(分别为2.0±0.4、0.9±0.5,P=0.020)与芯片检测(分别为3003±530、882±538,P:0.017)结果一致.在345个转录因子中,筛选出与ER功能相关的差异表达的转录因子共28个,与ER(+)的RL-952细胞相比,ER(-)的HEC-1A、HEC-1B细胞中转录因子活性同时上调的有13种,同时下调的有15种.转录因子TTF(1)-1、NRF-1、TCE的活性与Erα mRNA表达水平呈明显线性正相关关系(r=0.523,P=0.037),而转录因子RFX123和Ikaros的活性与Erα mRNA表达水平呈明显非线性负相关关系(r=-0.312,P=0.041).结论转录因子芯片检测是筛选子宫内膜癌致病机制中主要转录因子的先进技术.转录因子TTF(1)-1、NRF-1、TCE可能与ER(+)子宫内膜癌中的信号传导通路相关;转录因子RFX123和Ikams可能与ER(-)子宫内膜癌中的信号传导通路相关.     

雌激素受体相关受体在妇科恶性肿瘤细胞株中的表达

目的 明确孤儿受体-雌激素受体相关受体ERR（estrogen receptor—related receptors，ERR）α、β、γ各亚型在子宫内膜癌细胞株，卵巢细胞株，乳腺癌细胞株中的表达情况。方法 采用定量PCR方法定性检测ERRs家族中各亚型的mRNA表达，采用Westston Blot印迹的方法检测雌激素受体相关受体ERR各亚型的表达。结果 实时荧光定量PCR分析及Western Blot蛋白印记检测显示子宫内膜癌细胞株、卵巢癌细胞株及乳腺癌细胞株中ERRα均有高水平表达；子宫内膜癌Hec11A、Hec-1B细胞和卵巢癌Mdah-2774、SKOV-3、OVCAR-3呈现ERRβ阳性表达；而ERRγ表达见于宫内膜癌Hec-1B、Ishikawa细胞，卵巢癌Mdah-2774、SKOV-3、OVCAR-3细胞和乳腺癌MCF-7细胞。结论ERRα和ERRγ在多种不同类型的恶性肿瘤细胞株中均有表达，而ERRβ的表达水平相对较低，本研究提供了ERR家族表达在细胞株中的表达模式。     

子宫内膜癌细胞中[12Asp]K-ras4B基因对雌激素受体亚型转录活性的影响

目的　探讨人子宫内膜癌细胞株HEC 1A细胞ras基因第 12密码子中突变型 (即[12 Asp]K ras4B基因 )对雌激素受体 (ER)及其亚型α、β蛋白的表达和转录活性的影响。 方法　 ( 1)用蛋白免疫印迹法检测 [12 Asp]K ras4B基因对ERα、ERβ蛋白表达的影响。 ( 2 )构建含荧光素酶报告基因和ER反应元件 (ERE)的真核表达质粒 pGL3 ERE luciferase ,与表达绿色荧光蛋白的 pEGFP N1质粒共同转染鼠成纤维细胞株NIH3T3细胞及HEC 1A细胞 ,观察雌二醇调节 [12 Asp]K ras4B基因对ER的转录活性 ;分别转染含有全长野生型ERαcDNA的 pSV5 HER0和抑制raf基因的 pCMV rafS6 2 1A ,探讨 [12 Asp]K ras4B/raf信号通路对ER转录活性的调节作用。 结果　 ( 1)NIH3T3细胞转染 pcDI [12 Asp]K ras4B质粒与转染空载体 pcDI质粒比较 ,ERα表达水平增加 3 6倍 (分别为 97± 2 5和 349± 6 7,P <0 0 1) ,ERβ增加 1 9倍 (分别为 12 8± 37和 2 4 9± 30 ,P <0 0 5 )。 ( 2 ) pCMV rafS6 2 1A质粒分别转染到含 pcDI [12 Asp]K ras4B质粒的NIH3T3细胞和HEC 1A细胞 ,转染前、后NIH3T3细胞ERα蛋白表达水平分别为 72 4± 4 5和 310± 4 6 (P <0 0 5 ) ,ERβ蛋白表达水平分别为 4 93± 2 0和2 84± 2 0 (P <0 0 1) ;转染前、后HEC 1A细胞ER     

Function of estrogen receptor isoforms α and β in endometrial carcinoma cells

The aim of this study was to explore how to modulate the expression of estrogen receptors (ER) alpha and beta and to verify the role of ERalpha and beta in relationship to estrogen and tamoxifen (TAM). A series of oligodeoxyribonucleotides (ODN) corresponding to regions of the ERalpha or beta was tested in human endometrial cancer cell lines (HEC-1B). The change in HEC-1B proliferation in response to 17beta-estradiol (E(2)) and TAM under the impact of antisense ODN was studied. The results of the study are as follows: 1) transfection with antisense ODN significantly inhibited ERalpha and ERbeta protein production, 2) the cells lost the ability to proliferate in response to E(2) after transfection with ERalpha antisense ODN especially at 24, 48, and 72 h. There was no obvious change in response to E(2) in HEC-1B cell lines that were transfected with ERbeta antisense ODN, and 3) after transfection with ERalpha antisense ODN, HEC-1B cells lost the ability to proliferate in response to TAM at 48 h. This inhibition was also observed after transfection with ERbeta antisense ODN at 24 h. ERalpha may be the primary receptor in the proliferation of HEC-1B cells in response to E(2). Both ERalpha and ERbeta are involved in the agonist impact of TAM on endometrial cancer cells.     

Stromal cell-derived factor 1alpha stimulates human endometrial carcinoma cell growth through the activation of both extracellular signal-regulated kinase 1/2 and Akt

OBJECTIVE: The aim of study was to investigate the proliferative effects of stromal cell-derived factor-1alpha (SDF-1alpha) on endometrial carcinomas cell lines with different estrogen receptors (ER) and PTEN protein profiles. METHODS: MTT assays was used to detect the proliferation of HEC-1A and Ishikawa cells, and Western blotted analysis was used to detect activation of Akt and ERK1/2 in both cell lines after exposure to various concentrations of SDF-1alpha, MAPK-specific inhibitor PD98059 or PI3K-specific inhibitor LY294002. RESULTS: Low concentrations of SDF-1alpha (50 ng/ml) induced proliferation in both cell lines. ERK1/2 was significantly activated for more than 2 h by SDF-1alpha at 20 ng/ml in HEC-1A cells, but not in Ishikawa cells. In contrast, Akt was significantly activated for over 2 h in Ishikawa cells but remained unchanged in HEC-1A cells. High concentrations of SDF-1alpha activated Akt and ERK1/2 pathways in both cell lines in a dose-dependent manner, which was primarily inhibited by LY294002 for pAkt and by PD98059 for pERK 1/2. CONCLUSIONS: SDF-1alpha could stimulate the cell proliferation of endometrial carcinoma with different expression status of ER and PTEN in vitro, likely through the activation of both Akt and ERK1/2 signaling pathways.     

信号通路抑制剂对PTEN基因不同表达状态子宫内膜癌细胞的作用

目的 比较相关信号通路抑制剂诱导PTEN基因不同表达状态子宫内膜癌细胞的增殖和凋亡情况.方法 以PTEN反义寡核昔酸及PTEN真核表达载体转染子宫内膜癌细胞(HEC-1A、Ishikawa)后,激光共聚焦显微镜观察PTEN蛋白的表达.表皮生长因子受体、丝裂原活化蛋白激酶及雷帕霉素靶蛋白信号通路抑制剂--RG-14620、SB203580(SB)及西罗莫司分别处理HEC-1A、HEC-1A-PTEN-null、Ishikawa、Ishikawa-PTEN细胞,荧光染色法、流式细胞仪、四甲基偶氮唑蓝比色法分别检测细胞凋亡时的形态学改变、细胞凋亡率、细胞周期分布、细胞存活率.结果 转染后,Ishikawa-PTEN细胞内PTEN蛋白表达增加,HEC-1A-FFEN-null细胞内PTEN蛋白表达受到抑制.RG-14620、SB及西罗莫司处理后,Ishikawa和HEC-1A-PTEN-null细胞荧光染色见核呈浓集周缩改变;细胞发生明显凋亡及G1期阻滞,尤以SB作用最为显著,Ishikawa+SB、HEC-1A-PTEN-null+SB的细胞凋亡率分别为(37.8±0.8)%、(31.6±0.8)%,G_1期细胞比例增加[分别为(87.5±1.9)%、(84.1±3.2)%];细胞增殖受到抑制,尤以SB处理后作用为显著,Ishikawa+SB、HEC-1A-PTEN-null+SB的细胞存活率仅为(49.0±1.7)%、(54.0±2.1)%.结论 PTEN基因缺失使相应信号通路抑制剂作用的子宫内膜癌细胞增殖明显受抑,细胞阻滞于G1期,细胞凋亡增加,对相关信号通路抑制剂的敏感性增加.     

阻断丝裂原活化蛋白激酶信号通路对子宫内膜癌生长抑制作用的研究

目的:研究丝裂原活化蛋白激酶(MAPK/ERK)信号通路抑制剂(PD98059)对ER阳性表达的Ishikawa和ER低表达的HEC-1A人子宫内膜癌细胞系的裸鼠体内抗增殖作用,探讨阻断MAPK/ERK信号传导通路治疗子宫内膜癌的可行性。方法:体外培养人子宫内膜癌Ishikawa、HEC-1A细胞,将对数生长期的两种细胞分别接种于裸鼠背部皮下,建立子宫内膜癌裸鼠移植瘤模型。将两种细胞系成瘤阳性裸鼠随机分为对照组和实验组,每组6只,分别腹腔注射生理盐水和PD98059,每周2次,共3周,观察各组裸鼠移植瘤的生长情况,建立移植瘤生长曲线,计算抑瘤率。实验结束时取肿瘤组织切片HE染色,原位末端标记(TUNEL)法检测组织细胞的凋亡,Western blot检测各组织中ERK1/2的活化。结果:(1)PD98059能有效抑制人子宫内膜癌Ishikawa、HEC-1A细胞裸鼠皮下移植瘤的生长;(2)HE染色可见实验组瘤细胞核浆比相对较小,血管密度降低;TUNEL染色可见两种细胞移植瘤中实验组细胞凋亡率较对照组明显增加;(3)Western blot检测结果:PD98059能有效降低裸鼠移植瘤组织中p-ERK表达。结论:PD98059通过阻断MAPK/ERK信号传导通路增加Ishikawa和HEC-1A细胞裸鼠移植瘤组织中细胞凋亡,抑制肿瘤生长,抗肿瘤效果明显,可成为治疗子宫内膜癌的有效方法。