MDR1及MDR3基因沉默逆转卵巢上皮性癌细胞对紫杉醇耐药的实验研究

目的 研究多药耐药基因——MDR1及MDR3基因沉默逆转卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞A2780／taxol对紫杉醇耐药的作用。方法 用真核质粒介导的针对MDR 1及MDR3基因的短发夹状RNA（shRNA）转染A2780／taxol细胞（分别为MDR1组、MDR3组）,空质粒转染作为对照（空载体组）。流式细胞仪分别检测细胞早期凋亡、罗丹明123（Rh123）积聚情况,末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法（TUNEL）检测细胞晚期凋亡情况,四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测细胞对紫杉醇的半数抑制浓度（IC50）,RT-PCR技术检测MDR1及MDR3mRNA的表达,蛋白印迹法（western blot）检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）蛋白的表达。结果转染后,MDR1组及MDR3组A2780／taxol细胞的早期凋亡率分别达（20．21±0．56）％和（10．87±1．24）％。MDR1、MDR3组A2780／taxol细胞内的Rh123平均荧光强度分别为116．6±8．1、98．4±3．8,显著高于空载体组的40．2±1．6,差异有统计学意义（P〈0．05）。TUNEL检测显示细胞发生了晚期凋亡。MDR1、MDR3组A2780／taxol细胞对紫杉醇的IC50明显下降,分别与空载体组比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。转染48h后,A2780／taxol细胞中MDR1和MDR3mRNA的表达水平分别下降了（73．3±0．8）％和（51．6±0．4）％;MDR1、MDR3组细胞caspase-3的表达量分别为（80．8±2．6）％、（72．0±4．7）％,均较空载体组增加。结论 MDR1及MDR3基因沉默能恢复A2780／taxol细胞对紫杉醇的敏感性并诱导细胞凋亡,从而逆转A2780／taxol细胞对紫杉醇的耐药性。     

PTEN基因逆转卵巢上皮性癌细胞耐药的机制研究

目的通过检测PTEN基因在卵巢上皮性癌（卵巢癌）顺铂敏感细胞株0V2008及0V2008配对的顺铂耐药细胞株C13K中的表达,探讨转染PTEN基因能否逆转C13K细胞对顺铂的耐药及其相关机制。方法半定量RT-PCR技术和蛋白印迹法检测0V2008和C13K细胞中PTENmRNA和蛋白的表达。将野生型PTEN基因真核表达质粒在脂质体介导下转染C13K细胞,同时以转染空载体和未转染的C13K细胞作为对照,分别应用RT-PCR技术检测各组细胞PTENmRNA表达的变化,应用蛋白印迹法检测各组细胞PTEN、蛋白激酶B（AKT）及磷酸化AKT（p-AKT）蛋白表达的变化;四甲基偶氮唑蓝（M1Tr）比色法观察转染PTEN基因后C13K细胞对顺铂敏感性的变化,流式细胞仪分析顺铂作用后的细胞凋亡情况。结果（1）PTENmRNA在0V2008和C13K细胞中的表达水平分别为1．02±0.05和0．45±0.03,而0V2008、C13K细胞中PTEN蛋白的表达水平分别为1.02±0.07、0．55±0．03,两种细胞PTENmRNA和蛋白的表达水平分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。（2）PTEN基因转染48h后,C13K细胞中PTENmRNA、蛋白的表达水平分别为2.04±0．10和0．94±0．04,分别与转染空载体和未转染的C13K细胞比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）;p-AKT蛋白的表达水平（0.94±0．07）较转染空载体（1．66±0．10）和未转染（1．68±0．14）的C13K细胞显著降低（P〈0．05）。（3）转染PTEN基因的C13K细胞对顺铂的半数抑制浓度（IC50）为（7.2±0．3）μmol／L,明显高于转染空载体和未转染的C13K细胞[分别为（12．7±0．4）、（13．0±0．3）μmol／L,P〈0,05]。（4）顺铂作用24h后,转染PTEN基因、转染空载体和未转染的C13K细胞的凋亡率分别为（41.7±0.9）％、（18．6±0．7）％和（15,3±0．8）％,前者明显高于后两者（P〈0．01）。结论PTEN基因在0V2008细胞中的表达明显高于C13K细胞。转染野生型PTEN基因能有效提高C13K细胞内PTEN基因的表达,并通过降低C13K细胞中AKT磷酸化的水平恢复C13K细胞对顺铂的敏感性。     

低氧诱导因子1α对子宫颈癌细胞生物学行为的影响

目的探讨低氧诱导因子1α（HIF-1α）对宫颈癌细胞的生物学行为的影响以及其中可能存在的分子机制。方法通过CoCl2化学诱导宫颈癌HeLa细胞缺氧;构建靶向HIF-1α的反义真核表达载体、经脂质体介导转染HeLa细胞的方法沉默HIF-1α的表达。将实验细胞分为常氧未转染对照（NN）组、常氧空质粒转染对照（NI）组、常氧转染pcDNA3．0／HIF-1α质粒（NT）组、缺氧未转染对照（HN）组、缺氧空质粒转染对照（HI）组、缺氧转染pcDNA3．0／HIF-1α质粒（HT）组。用四甲基偶氮唑蓝法、Transwell侵袭小室方法观察各组细胞的增殖、侵袭能力的改变,用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率,用RT-PCR技术检测各组细胞目的基因HIF-1α及其靶基因血管内皮生长因子（VEGF）、葡萄糖转运体1（GLUT1）、多药耐药基因1（MDR1）的表达变化。结果NT组细胞在培养12、24、48、72h时的活细胞数分别为0．053±O．003、0．074±0．004、0．148±0．015、0．192±0．038,而HT组分别为0．069±0．003、0．155±0．022、0．224±0．022、0．308±0．069;NT和HT组的细胞增殖受到抑制,NT组与NN及NI组、HT组与HN及HI组间的活细胞数分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。各组细胞的凋亡率分别是,NN组（29．27±0．18）％、NI组（31．13±0．08）％、NT组（51．11±0．14）％、HN组（11．46±0．28）％、HI组（15．77±0．49）％、HT组（40．05±0．97）％;HT组与HN及HI组、NT组与NN及NI组间分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）。各组细胞的侵袭能力由高到低依次为HI、HN、NI、NN、HT、NT组,分别为（40±9）％、（37±12）％、（28±5）％、（26±7）％、（19±7）％、（10±5）％;NT组与NN及NI组、HT组与HN及HI组间分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）。NT组细胞HIF-1α、VEGF、GLUT1、MDR1 mRNA的相对表达量分别为0．05±0．12、0．09±0．11、0．08±0．15、0．05±0．15,而HT组分别为0．04±0．16、0．16±0．16、0．12±0．20、0．20±0．21;NT组与NN及NI组、HT组与HN及HI组间分别比较,HIF-1α、VEGF、GLUT1、MDR1 mRNA的相对表达量均有降低,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论HIF-1α可能主要通过其下游的靶基因对宫颈癌细胞的恶性生物学行为产生影响,包括抗凋亡、促增殖、增加血液供应和能量供应、耐药等,且体外抑制HIF-1α的表达对宫颈癌细胞有抑制作用。     

趋化因子CXCL12及其受体CXCR4对卵巢上皮性癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的 探讨趋化因子CXCL12及其受体CXCR4对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法采用RT—PCR技术和免疫细胞化学染色法检测卵巢癌细胞株CAOV3细胞中CXCL12、CXCR4mRNA和蛋白的表达,以及CXCL12（100ng／m1）作用后CAOV3细胞中整合素B1和血管内皮生长因子C（VEGF—C）mRNA的表达。实验分为6组：对照组（未加药）,实验组1（加100ng／ml的CXCL12）,实验组2（加10ng／ml的CXCL12）,实验组3（加100ng／ml的CXCL12和10斗g／ml的CXCR4抗体）,实验组4（加100ng／ml的CXCL12和1pg／ml的CXCR4拮抗剂——AMD3100）,实验组5（加10μg／ml的CXCR4抗体或卵巢癌腹水）。采用四甲基偶氮唑蓝比色法检测CXCL12对CAOV3细胞增殖的影响。以穿膜小室为模型,采用重组细胞基底膜迁移、侵袭实验检测CXCL12和卵巢癌腹水对CAOV3细胞迁移、侵袭的影响。结果 CAOV3细胞中,CXCR4蛋白呈棕黄色强阳性表达,CXCR4mRNA的表达水平为0．70±0．10,经100ng／ml的CXCL12作用24h时CXCR4mRNA的表达水平（1．24±0．14）显著增加（t=-7．1088,P=0．0021）;CXCL12蛋白和mRNA均无表达。100ng／ml的CXCL12作用3h时整合素131mRNA表达水平即显著增加（作用前后分别为0．53±0．10、1．53±0．16,P〈0．01）,24h时VEGF—CmRNA表达水平显著增加（作用前后分别为0．52±0．09、1．11±0．15,P〈0．01）。对CAOV3细胞的增殖作用,实验组1分别与对照组和实验组2比较均明显增强（3组分别为0．428±0．051、0．325±0．045、0．328±0．039,P〈0．05）;实验组1分别与实验组3和实验组4比较均明显被抑制（后两组分别为0．356±0．031、0．373±0．029,P〈0．05）;而实验组5（0．349±0．038）与对照组比较,差异则无统计学意义（P〉0．05）。对CAOV3细胞的迁移和侵袭作用,实验组1分别与对照组和实验组2比较均明显增强[迁移细胞数分别为（523．3±25．2）、（108．0±7．2）、（211．7±24．7）个,侵袭细胞数分别为（39．3±4．0）、（4．0±1．0）、（15．7±3．1）个;P均〈0．01];实验组1分别与实验组3和实验组4比较均明显被抑制（P〈0．05）;但实验组5[即加入卵巢癌腹水组;迁移细胞数为（706．6±30．6）个,侵袭细胞数为（61．7±7．6）个]显著多于实验组1（P〈0．05）。结论 CXCL12可促进卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭,并上调整合素B1和VEGF—CmRNA的表达,此作用可被CXCR4抗体抑制,表明CXCL12在卵巢癌的生长和转移中发挥一定作用。     

DCC基因对卵巢上皮性癌细胞生长及其化疗敏感性的影响

目的研究DCC基因对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞生长及其化疗敏感性的影响。方法采用脂质体转染法将含有DCC基因的真核表达载体pcDNA3．1（＋）-DCC质粒导人卵巢癌细胞系HO8910细胞中（HO8910-DCC组）,以转染空载体pcDNA3．1（＋）质粒（HO8910-Neo组）和脂质体（空白对照组）为对照。转染24h后,经氨基糖甙类抗生素G418筛选,RT-PCR技术以及免疫组化法检测3组细胞DCC mRNA及蛋白表达情况;四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定3组细胞转染后1～7d的细胞生长情况及经梯度浓度[0．1、0．2、1．0、5．0、10．0血浆峰浓度（PPC）]化疗药物顺铂和紫杉醇处理后48h的细胞存活率,并绘制细胞生长曲线。结果转染DCC基因后,DCC基因可在HO8910细胞中稳定表达。转染后1～7d,HO8910-DCC组细胞生长速度较其他两组细胞明显减慢,除转染后第1天外,分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．01）;空白对照组和HO8910-Neo组细胞生长速度比较,差异则无统计学意义（P〉0．05）。HO8910-DCC组细胞经0．1～5．0PPC的顺铂和紫杉醇处理后,细胞存活率显著低于空白对照组和HO8910-Neo组（P〈0．01）;经10．0PPC的顺铂处理后细胞存活率也明显低于空白对照组和HO8910-Neo组（P〈0．05）;但经10．0PPC的紫杉醇处理后细胞存活率与空白对照组和HO8910-Neo组相比,差异则无统计学意义（P〉0．05）。空白对照组和HO8910-Neo组细胞经各梯度浓度药物处理后的细胞存活率间比较,差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论DCC基因可明显抑制卵巢癌细胞的生长,并增强卵巢癌细胞对化疗药物的敏感性。     

Edg4基因小分子干扰RNA载体的构建及其对卵巢上皮性癌细胞的沉默效应

目的构建针对Edg4基因的小分子干扰RNA（siRNA）载体,初步观察其对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞的沉默效应。方法利用软件分析、设计针对人Edg4 mRNA的siRNA靶序列,合成发夹样DNA序列;退火成双链,克隆至真核表达载体pRNAT—U6．1质粒上,经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实其序列无误后,用脂质体包裹并转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,用荧光显微镜初步观察其在SKOV3细胞中的转染率。采用实时荧光定量荧光定量PCR技术检测转染前后SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,生化法测定转染前后SKOV3细胞上清液中溶血磷脂酸（LPA）含量的变化,流式细胞术检测转染后SKOV3细胞的凋亡率。结果经PCR技术鉴定及DNA双向测序证实重组真核表达载体的序列无误,并将此命名为pRNAT—U6．1—siEdg4。荧光显微镜下观察,转染后SKOV3细胞内有明显绿色荧光信号,转染率为64％;实时荧光定量PCR技术检测显示,转染后SKOV3细胞的Edg4 mRNA表达水平（0．05±0．01）明显低于转染前（0．29±0．04,P〈0．05）;SKOV3细胞上清液中LPA的含量,转染后明显低于转染前[分别为（3．0±1．0）、（7．5±2．2）μmol／L;P〈0．05];流式细胞仪检测显示,转染后SKOV3细胞的凋亡率明显高于转染前（分别为53．38％、0．51％;P〈0．05）。结论本研究成功构建了针对人Edg4基因的siRNA真核表达载体,并能较高效转染SKOV3细胞,转染后能明显抑制SKOV3细胞中Edg4 mRNA的表达,诱导卵巢癌细胞凋亡。     

细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂flavopiridol对卵巢上皮性癌细胞及移植瘤干预作用

目的检测细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制剂flavopiridol对卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞及移植瘤的干预作用。方法应用流式细胞仪和脱氧核苷酸末端转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法（TUNEL）检测flavopiridol作用后卵巢癌细胞系AO的细胞凋亡率和细胞周期,应用实时荧光定量PCR技术检测flavopiridol作用前、后AO细胞中细胞周期蛋白（cyclin）D和活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）3的表达情况。建立卵巢癌裸鼠皮下及腹腔移植瘤模型,观测flavopiridol干预后裸鼠的生存情况及肿瘤体积的变化,TUNEL和免疫组化方法分别检测肿瘤组织中的细胞凋亡情况和微血管密度（MVD）。结果AO细胞在150、300、500nmol／L浓度的flavopiridol作用下,凋亡率分别为4．1％、10．7％和7．6％;G1期细胞比例显著增加,S期比例显著降低（P〈0．05）。flavopiridol作用后AO细胞cyclin D的表达量（0．25）显著下降,活性caspase-3的表达量（2．55）轻度升高,高于flavopiridol作用前的0．69（P〈0．05）、2．49（P〉0．05）。flavopiridol干预后裸鼠的累积生存率显著提高（P〈0．05）;裸鼠的平均生存时间为（141±14）d,显著高于磷酸盐缓冲液（PBS）作用后的（106±11）d,两者比较,差异有统计学意义（P〈0.05）;在flavopiridol干预后53d时抑瘤率为40％。flavopiridol干预后裸鼠的肿瘤组织中有细胞凋亡发生,MVD为（12±5）个,显著高于PBS作用后的（35±10）个,两者比较,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论flavopiridol能显著抑制卵巢癌细胞及移植瘤的生长,延长荷瘤裸鼠的生存期。     

初产妇与经产妇分娩后一周内尿动力学表现分析

目的探讨初产妇与经产妇分娩后1周内的尿动力学表现。方法按照国际尿控协会推荐的方法对36例初产妇志愿者（初产妇组）和12例经产妇志愿者（经产妇组）分娩后1周内（产后2-7d）的尿动力学变化进行检查。14例因上尿路疾病而下尿路功能正常的已婚未育妇女作为对照组。结果初产妇组与经产妇组妇女分娩后功能性膀胱容量（FBV）分别为（310±154）、（243±141）ml,正常尿意膀胱压测定容量（NDCC）分别为（215±90）、（225±115）ml,均低于对照组的（437±193）ml和（338±120）ml,分别比较,差异均有统计学意义（P〈0．05）;但初产妇组与经产妇组间FBV和NDCC比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。初产妇组与经产妇组妇女最大静态尿道压（MUP）和最大尿道闭合压（MCUP）也均显著高于对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）;但初产妇组MUP和MCUP与经产妇组比较,差异无统计学意义（P〉0．05）。功能尿道长度（FUL）初产妇组妇女为（31±6）mm,经产妇组妇女为（27±5）mm,对照组妇女为（30±3）mm,初产妇、经产妇组分别与对照组比较,差异均无统计学意义（P〉0．05）,但初产妇组FUL显著长于经产妇组,差异有统计学意义（P〈0．05）。初产妇组、经产妇组及对照组的Abrams-Griffiths（AG）值分别为-35±28、-26±26和-11±17,两产妇组分别与对照组比较,差异有统计学意义（P〈0．05）;初产妇组、经产妇组及对照组尿道阻力因子（URA）分别为（8±4）、（9±3）和（11±3）cmH20（1cmH2O：0.098kPa）,3组比较,差异均无统计学意义（P〉0．05）。初产妇组和经产妇组腹压漏尿点压（VLPP）测定各有1例漏尿发生,ⅥPP分别为50cmH2O和67cmH2O。结论初产妇和经产妇分娩后1周内均表现为膀胱容量减少,尿道静态阻力增加,但膀胱排空能力正常。     

促肾上腺皮质激素释放激素、c-Fos及间隙连接蛋白43与分娩发动的相关性

目的探讨促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、c—Fos和间隙连接蛋白43（Cx43）在足月妊娠子宫平滑肌细胞中的表达变化及其与分娩发动的相关性。方法选择2006年2—9月在中南大学湘雅二医院住院的足月临产产妇30例（临产组）,足月未临产产妇30例（未临产组）,因宫颈上皮内瘤样病变行子宫切除术患者30例（对照组）。应用放射免疫方法测定3组妇女静脉血中CRH的水平;用核酸原位杂交技术和免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接（SP）法检测3组妇女子宫平滑肌细胞中c—Fos、Cx43 mRNA及其蛋白的表达水平。结果（1）CRH水平在临产组产妇为（81．8±11．9）pmol／L,未临产组为（34．5±18．6）pmol／L,对照组为（1．3±0．7）pmol／L,临产组明显高于未临产组及对照组,未临产组明显高于对照组,差异均统计学意义（P〈0．05）。（2）c—Fos mRNA及其蛋白的阳性染色主要定位于子宫平滑肌细胞核内,少量位于细胞质内;子宫平滑肌细胞中c—Fos mRNA及其蛋白表达水平,临产组分别为5．4±1．7及5．4±1．5,未临产组分别为4．1±0．9及3．9±0．9,对照组分别为1．0±0．4及1．2±0．4,临产组明显高于未临产组及对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）;未临产组也明显高于对照组（P〈0．05）。（3）Cx43 mRNA及其蛋白的阳性染色定位于子宫平滑肌细胞质内;子宫平滑肌细胞中Cx43 mRNA及其蛋白表达水平,临产组分别为5．5±1．4及5．6±1．3,未临产组分别为4．1±0．6及4．1±0．5,对照组分别为1．5±0．6及1．1±0．6,临产组明显高于未临产组及对照组,差异有统计学意义（P〈0．05）;未临产组也明显高于对照组（P〈0．05）。（4）3组妇女的CRH水平与子宫平滑肌细胞中c—Fos mRNA及其蛋白的表达水平呈明显正相关（r5=0．61,r6=0．50;P〈0．05）;与子宫平滑肌细胞中Cx43 mRNA及其蛋白的表达水平呈明显正相关（r3=0．52,r4=0．68;P〈0．05）;子宫平滑肌细胞中c—Fos mRNA及其蛋白的表达水平与Cx43 mRNA及其蛋白的表达水平也呈明显正相关（r5=0．51,r6=0．60;P〈0．05）。结论产妇血浆中CRH水平、子宫平滑肌细胞中c—Fos和Cx43的表达与分娩发动有一定的关系,且3者间水平变化均呈明显正相关。     

表达特异性多肽的噬菌体对卵巢癌细胞生物学行为的影响

目的探讨表达特异性多肽的噬菌体对卵巢癌细胞生物学行为的影响。方法选取卵巢癌细胞株A2780、SKOV3,分别与特异性的噬菌体共同作用,通过台盼蓝拒染法、流式细胞仪、平板克隆形成实验、四甲基偶氮唑蓝比色法、Boyden小室体外侵袭实验等方法,检测卵巢癌细胞生物学行为的变化。将A2780、SKOV3细胞按实验目的分别分为3组:(1)实验组,加入可与卵巢癌细胞特异性结合的噬菌体(阳性噬菌体);(2)空白对照组,不加噬菌体;(3)阴性对照组,加入不与卵巢癌细胞结合的噬菌体(阴性噬菌体)。结果实验组、阴性对照组和空白对照组的平均活细胞比例分别为(72·1±6·2)%、(84·8±4·6)%和(93·1±2·5)%,与阴性对照组及空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0·05);实验组A2780和SKOV3细胞的凋亡率分别为20·39%和43·99%,而阴性对照组均未见凋亡峰的出现;实验组细胞的平均克隆形成率为4%,阴性对照组为15%,空白对照组为15%,实验组与阴性对照组及空白对照组分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);实验组A2780和SKOV3细胞的生长抑制率分别为11·07%和9·58%,均明显高于各自的阴性对照组(分别为2·05%和1·09%),与各自的阴性对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);实验组A2780和SKOV3细胞的侵袭指数,都低于各自的阴性对照组和空白对照组,分别与各自的阴性对照组和空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0·05)。结论筛选出的特异性噬菌体对卵巢癌细胞的生长、增殖和迁移有一定的下调作用,与噬菌体结合的卵巢癌细胞表面受体可能与肿瘤的发生和转移有关。     

Suppression of human ovarian carcinoma metastasis by the metastasis-suppressor gene, BRMS1

Metastasis-suppressor genes, by definition, suppress metastasis without affecting tumorigenicity and, hence, present attractive targets as prognostic or therapeutic markers. BRMS1 (breast cancer metastasis suppressor) has recently been identified as a metastasis-suppressor gene for human breast cancer and melanoma. Expression of BRMS1 messenger RNA (mRNA) in multitissue including normal prostate, ovarian, testis, and colon has been detected by northern blot analysis. We hypothesize that the role of BRMS1 in tumor progression may not be limited to breast cancer and melanoma. We previously found that BRMS1 mRNA levels in primary ovarian epithelial carcinomas were significantly lower than that in normal ovarian and benign tumors (P < 0.05), and statistical analysis of BRMS1 mRNA levels revealed that BRMS1 mRNA levels were significantly higher in early tumor stages (I, II) compared with advanced tumor stages (III, IV) in which lymph node or distant metastases were present (P < 0.01). Our data showed that reduced BRMS1 mRNA seems to influence ovarian carcinoma metastatic ability. Therefore, we transfected BRMS1 plasmid into highly malignant ovarian carcinoma cell line, HO-8910PM, and examined cell biologic behaviors including proliferation, adhesion, invasion, and metastasis in vitro and in vivo. BRMS1 expression did not alter the proliferation of HO-8910PM cells in vitro and primary tumor formation in vivo. But, BRMS1 expression significantly suppressed the cell adhesion to extracellular matrix components and in vitro cell invasion in BRMS1-transfected HO-8910PM cells compared to parental HO-8910PM and vector-only transfectants (HO-8910PM-vect). Furthermore, motility of BRMS1 transfectants was inhibited. lung colony formation of intravenously injected BRMS1 transfectants in nude mice was significantly reduced. Also, BRMS1 transfectants form significantly less metastatic to organs of peritoneal cavity in orthotopically implanted ovarian tumor nude models. We further discovered that BRMS1 expression did downregulate expression of an actin-bundling protein associated with cell motility -fascin, which perhaps is the mechanism underlying BRMS1 suppression of metastasis. These data suggested that in addition to its already described role in breast cancer and melanoma, BRMS1 functions as a metastasis-suppressor gene in ovarian carcinoma by modifying several metastatic-associated phenotypes, offering a new target for therapeutic intervention.     

UHRF1基因在人卵巢癌细胞株OVCAR-3中的表达及意义

目的:探讨针对UHRF1基因的小干扰RNA(siRNA)转染人卵巢癌细胞株OVCAR-3后UHRF1表达的变化及细胞的增殖和凋亡,为UHRF1基因作为新的靶点治疗卵巢癌提供依据。方法:用siRNA基因沉默技术,将体外化学合成的针对UHRF1基因的siRNA转染至OVCAR-3细胞(转染组),并以转染阴性对照siRNA序列的细胞作为阴性对照组,未经转染的细胞作为空白组;实时荧光定量PCR和Western blot分别检测转染前后细胞UHRF1 mRNA和蛋白表达水平的变化;CCK-8实验和流式细胞术分别检测沉默UHRF1基因后对细胞增殖和凋亡的影响。结果:实时荧光定量PCR结果显示,siRNA转染后UHRF1基因在卵巢癌细胞株OVCAR-3中表达显著降低(P<0.01)。Western blot结果显示,转染组、阴性对照组和空白组细胞UHRF1蛋白相对表达量分别为0.16±0.04、0.33±0.03、0.35±0.07;转染组细胞UHRF1蛋白表达水平显著低于阴性对照组和空白组(P<0.05),而阴性对照组和空白组之间无显著差异(P>0.05)。CCK-8实验结果显示,转染后48,72,96h,转染组细胞增殖率均显著低于空白组(P<0.01)。流式细胞术结果显示,转染组、阴性对照组细胞凋亡率分别为(15.83±2.22)%、(7.46±2.93)%,差异显著(P<0.01)。结论:UHRF1基因沉默后可显著抑制卵巢癌OVCAR-3细胞UHRF1的表达,并抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。     

尿激酶型纤溶酶原激活因子介导的卵巢上皮癌细胞浸润转移体外的实验研究

目地:探讨尿激酶型纤溶酶原激活因子在卵巢上皮癌浸润转移中的作用机制。方法:用RT-PCR技术从人卵巢上皮癌组织总RNA中逆转录uPA基因cDNA全长,克隆至pGEM-T Easy Vector,鉴定后与真核表达载体PCMV-HA连接,酶切及测序。用脂质体法将重组质粒DNA转染至SKOV3细胞。加压筛选并培养PCMV-HA-uPA及对照细胞。分别用RT-PCR和W estern blot方法检测转染前后SKOV3细胞uPA的表达。细胞增殖能力测定用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和集落形成实验,细胞周期测定用流式细胞仪法,细胞体外侵袭,迁移和黏附能力测定分别采用Matrigel Invasion,TranswellM igration和Adhersion Assay方法。结果:(1)uPA阳性表达能介导SKOV3细胞克隆形成,与对照组细胞的差异有统计学意义(P<0.05);(2)uPA阳性表达能介导SKOV3细胞的细胞周期中S期比例增加,与对照组细胞的差异有统计学意义(P<0.05);(3)uPA阳性表达介导SK-OV3细胞的体外侵袭,迁移和黏附能力均明显强于对照细胞株,差异有统计学意义(P=0.0002,<0.0001和0.0049)。结论:uPA通过促进肿瘤细胞侵袭,迁移和黏附能力在卵巢上皮癌浸润转移中起了重要作用。     

WWOX基因转染对卵巢上皮性癌细胞生长的影响

目的 研究抑癌基因WWOX对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞生长的影响,寻求卵巢癌基因治疗的新途径.方法 将携有WWOX基因的真核表达载体体外转染卵巢癌细胞系HO8910细胞(重组质粒组),筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染空载质粒(空质粒组)及未经转染(空白对照组)的HO8910细胞作为对照,用蛋白印迹法检测重组质粒组细胞中WWOX蛋白的表达情况.体外实验:分别用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、体外侵袭实验、琼脂克隆形成实验及流式细胞仪等分析WWOX基因对HO8910细胞生物学活性的影响.体内实验:将转染细胞接种于BALB/c裸鼠腹腔,观察裸鼠生存时间和肿瘤生长情况.结果 (1)重组质粒组细胞中WWOX蛋白能稳定表达,空质粒组及空白对照组细胞未检测到WWOX蛋白的表达.(2)MTT比色法检测显示,重组质粒组各时间点的细胞增殖能力较空质粒组及空白对照组明显下降,差异均有统计学意义(P＜0.05).(3)重组质粒组细胞的琼脂克隆形成率(19.8%)明显低于空质粒组(54.5%)及空白对照组(56.0%),差异有统计学意义(P＜0.05).(4)流式细胞仪检测显示,重组质粒组中(72.08±0.39)%的细胞被阻滞于G0/G1期,分别与空质粒组[(41.02±1.08)%]及空白对照组[(39.31±0.67)%]比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).(5)体外侵袭实验显示,重组质粒组穿膜细胞数为(89.7±3.1)个,分别与空质粒组[(91.2±1.3)个]及空白对照组[(91.4±1.3)个]比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).(6)裸鼠体内实验表明,重组质粒组裸鼠体内的成瘤能力(包括转移灶数目、转移灶重量及移植瘤最大直径、腹水量)明显低于空质粒组及空白对照组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 抑癌基因WWOX可干扰卵巢癌细胞的细胞周期并抑制其生长增殖,可为卵巢癌的基因治疗提供一种新方法.     

凋亡相关基因和半胱天冬氨酸蛋白酶-3在卵巢癌顺铂耐药细胞株中的表达

目的　探讨凋亡相关基因和半胱天冬氨酸蛋白酶 3 (caspase 3 )在卵巢癌顺铂 (DDP)耐药细胞株中的表达。方法　采用逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术、蛋白印迹法和流式细胞仪分析卵巢癌DDP敏感细胞株A2 780、COC1和DDP耐药细胞株A2 780 /DDP、COC1/DDP中凋亡相关基因bcl 2、bcl XL、bax和bcl Xs的表达 ,及不同浓度DDP(0、5、10、2 0 μmol/L)作用后上述 4种细胞中caspase 3活性及其底物多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶 (PARP)的变化。结果　bcl 2和bcl XLmRNA的表达 ,A2 780 /DDP细胞分别为 1 87± 0 2 5和 1 73± 0 15 ,明显高于A2 780细胞的 1 48± 0 14和 1 41± 0 19,差异有显著性 (P <0 0 5 ) ;bcl 2和bcl XL 蛋白的表达 ,A2 780 /DDP细胞分别为 1 99± 0 11和 1 69± 0 16,明显高于A2 780细胞的 1 5 1± 0 17和 1 2 8± 0 11,差异有显著性 (P <0 0 5 ) ;bcl 2和bcl XL在COC1/DDP细胞中的表达明显高于COC1细胞 ,差异有显著性 (P <0 0 5 ) ;bax的表达 ,A2 780 /DDP与A2 780、COC1/DDP与COC1细胞分别比较 ,差异均无显著性 (P >0 0 5 ) ;在上述 4种细胞中均未检测到bcl Xs的表达。不同浓度DDP作用后 ,A2 780 /DDP和COC1/DDP细胞中caspase 3活性明显低于A2 780和COC1细胞 (P <0 0 5 ) ;其凋亡率     

组织蛋白酶L基因与卵巢上皮性癌细胞侵袭及转移的关系

目的 构建组织蛋白酶L(CTSL)基因的真核表达质粒,通过体外实验研究CTSL基因与卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞侵袭、转移的关系.方法 采用逆转录(RT)-PCR技术从卵巢癌组织总RNA中扩增CTSL基因的cDNA全长,克隆至pMD18-T载体上;酶切、纯化CTSL基因后与pcDNA3.1载体连接,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1-CTSL.应用脂质体介导的基因转染技术将重组质粒转染卵巢癌HO8910细胞,RT-PCR技术和蛋白印迹法分别检验CTSL mRNA和蛋白的表达情况,细胞增殖能力测定分别采用四甲基偶氮唑蓝法和集落形成实验,细胞周期检测、细胞体外侵袭、转移、黏附能力测定分别采用流式细胞仪、细胞体外侵袭重建基底膜实验、穿膜小室(transwell小室)实验、体外黏附实验.结果 RT-PCR和蛋白印迹法结果证实,HO8910细胞转染pcDNA3.1-CTSL质粒后有CTSL基因和蛋白的表达.HO8910-CTSL细胞的生长速度加快,但与对照的HO8910-pcDNA3.1及HO8910细胞分别比较,差异均无统计学意义(P>0.05).HO8910-CTSL细胞的S+G2+M期细胞比例为37.9%,与HO8910-pcDNA3.1细胞及HO8910细胞(分别为32.9%、31.8%)比较虽有增加,但差异均无统计学意义(P>0.05).HO8910-CTSL细胞的侵袭、转移能力增加(分别为0.34±0.18、1.252±0.114),与HO8910-pcDNA3.1细胞(分别为0.17±0.04、0.486±0.027)及HO8910细胞(分别为0.16±0.05、0.459±0.674)分别比较,差异均有统计学意义(P<0.05);HO8910-CTSL细胞的黏附能力(0.16±0.04)与HO8910-pcDNA3.1细胞(0.19±0.04)及HO8910细胞(0.19±0.03)比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 CTSL基因真核表达质粒转染使卵巢癌细胞的体外侵袭和转移能力增加,有可能成为抗卵巢癌侵袭和转移的分子靶点.     

重组慢病毒介导的OPCML基因的体外转导及其对卵巢上皮性癌细胞的抑制作用

目的探讨重组慢病毒介导的体外转导OPCML基因的可行性及其对卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞的抑制作用。方法采用PCR技术,用基因特异性引物将OPCML基因的cDNA从CD1小鼠脑组织中扩增,并将OPCML基因克隆到慢病毒载体表达质粒pWPI GFP上,构建慢病毒载体表达质粒pWPI OPCML;将pWPI OPCML或pWPI GFP(空载体对照)质粒和包装质粒pCMVdR8.74、pMDG共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞,获得携带OPCML和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组慢病毒WPI OPCML或仅携带GFP基因的重组慢病毒WPI GFP;用重组慢病毒WPI OPCML和WPI GFP分别转导靶细胞,即人卵巢癌细胞系A2780、OCC1细胞和小鼠正常卵巢上皮细胞系CD1细胞,以未转染任何基因者为空白对照。通过细胞增殖实验、细胞聚合力实验、细胞周期分析和体内成瘤实验观察OPCML基因对卵巢癌细胞的抑制作用。结果(1)OPCML基因能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞,转导效率几乎达100%,并稳定表达;蛋白印迹法检测显示,靶细胞中OPCML和GFP蛋白均有表达。(2)细胞增殖实验显示,A2780细胞中,转导OPCML基因72h后的A2780/OPCML细胞为(7.6±1.0)×105个,明显少于未转导基因的A2780细胞或仅转导空载体的A2780/pWPI细胞[分别为(20.0±2.6)×105和(18.1±1.7)×105个;P<0.01];但OCC1和CD1细胞中,OPCML基因对细胞的增殖无明显的影响(P>0.05)。(3)细胞周期分析显示,OPCML基因对A2780细胞的细胞周期有明显的阻滞作用(转导前、后G0～G1期细胞分别为67%、75%;P<0.05),但对OCC1、CD1细胞则无明显阻滞作用(P>0.05)。(4)细胞聚合力实验显示,与空载体对照相比,OPCML基因能明显增强细胞的黏附力(P<0.05)。(5)移植瘤实验显示,将A2780/OPCML细胞注射到裸鼠皮下,4只裸鼠中仅1只裸鼠有肿瘤生长,其肿瘤重量为10mg,显著低于注射A2780、A2780/pWPI细胞的裸鼠[各4只裸鼠均有肿瘤生长,其肿瘤重量分别为(280±53)及(677±323)mg;P<0.01]。免疫组化法检测显示,肿瘤组织中OPCML蛋白有表达。结论用重组的慢病毒载体作为转基因的工具,具有高效性,同时能使目的基因达到持续稳定的表达。OPCML基因能够增加A2780细胞的黏附能力,抑制A2780细胞的增殖和体内成瘤,提示OPCML基因可能是一个新的抑癌基因。     

微小RNA-3619-5p通过靶向作用于p21基因对卵巢癌细胞生长的影响

目的:探讨微小RNA-3619-5p(miR-3619-5p)过表达对卵巢癌细胞系A2780和SKOV3中p21基因的上调作用及对卵巢癌细胞生长的影响。方法:使用Lipofectamine 3000分别向卵巢癌细胞系A2780和SKOV3瞬时转染miR-3619-5p(实验组)或者dsControl(对照组)。通过实时荧光定量聚合酶链反应(q RT-PCR)检测p21、细胞周期依赖性激酶4(CDK4)和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)mRNA的表达情况。蛋白质印迹(Western blotting)检测p21、CDK4和Cyclin D1蛋白的表达情况。流式细胞术检测对照组和实验组细胞周期分布差异和细胞凋亡情况。EdU增殖实验和集落形成实验检测细胞增殖能力。结果:与对照组相比,转染miR-3619-5p后2种细胞系中p21 mRNA均显著升高(P0.01),而CDK4和Cyclin D1 mRNA的表达均明显降低(P0.01)。Western blotting实验结果与qRT-PCR结果一致。与对照组相比,转染miR-3619-5p后,位于S期和G_2/M期的细胞比例明显下降,位于G_0/G_1期的细胞比例明显增大,细胞凋亡率明显升高。EdU增殖实验和集落形成实验均显示,与对照组相比,转染miR-3619-5p的卵巢癌细胞的增殖能力明显下降(P0.05)。结论:miR-3619-5p可通过激活卵巢癌细胞中p21蛋白的表达抑制卵巢癌细胞的生长。     

谷胱甘肽-S-转移酶P1启动子调控的胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合基因对卵巢癌顺铂耐药细胞的体外杀伤作用

目的　观察谷胱甘肽 S 转移酶P1(GSTP1)启动子调控的胞嘧啶脱氨酶和尿嘧啶磷酸核糖转移酶融合基因 (CD UPP ,即自杀基因 )表达的腺病毒载体 ,对卵巢癌顺铂耐药细胞的体外杀伤作用。方法　采用细菌内同源重组法构建腺病毒载体 ,设立卵巢癌顺铂敏感细胞株A2 780和以其诱导的耐药细胞株A2 780 /DDP ,在体外用重组腺病毒转染两组细胞并联合应用前药 5 氟胞嘧啶 (5 FC) ,观察两组卵巢癌细胞对 5 FC的敏感性。将CD UPP阳性和CK UPP阴性的A2 780 /DDP细胞按不同比例混合后给予 5 FC ,观察 5 FC对混合细胞的杀伤作用。结果　当重组腺病毒滴度为 10 0感染复数(MOI)、5 FC浓度为 2 5 0 μg/ml时 ,对顺铂耐药的A2 780 /DDP细胞的存活率为 (3 6± 1 0 ) % ,对顺铂敏感的A2 780细胞的存活率为 (76 5± 2 8) % ,两者比较 ,差异有显著性 (P <0 0 5 )。此外 ,2 0 ? UPP阳性A2 780 /DDP细胞 ,即可引起 80 3%的混合细胞死亡 ,CD UPP / 5 FC系统表现出明显的旁观者效应。结论　由腺病毒介导的含有GSTP1调控的CD UPP/ 5 FC系统 ,对卵巢癌顺铂耐药细胞具有特异性杀伤作用 ,为临床上克服卵巢癌化疗耐药 ,提供了一条安全、高效的治疗途径。