缺血和缺氧诱导离体SD乳鼠心肌细胞凋亡发生的实验研究

目的：通过建立一种新的离体SD乳鼠心肌细胞的缺氧模型,探讨心肌细胞缺氧、缺血损伤后的心肌细胞凋亡及其时序分布特点。方法：SD乳鼠的培养心肌细胞随机分为5组：对照组,缺氧12h组（I12h）、缺氧24h组（I24h）,缺氧48h组（I48h）以及缺氧72h组（172h）。应用TUNEL法染色和透射电镜检测心肌细胞凋亡的改变。结果：I12h组心肌细胞中见少量的TUNEL阳性细胞,随缺氧时间的延长,TUNEL阳性细胞数量逐渐增多。I12h组的心肌细胞凋亡指数（AI）与对照组相比差异有统计学意义（P〈0．01）,I48h组、I22h组心肌细胞的AI值分别可达（24．4±2．41）％和（45．4±4．22）％。透射电镜观察各分析时相点心肌细胞,凋亡心肌细胞在I24h组出现,L48h组、I72h组最多见。结论：乳鼠心肌细胞缺氧模型可导致心肌细胞凋亡,凋亡程度和心肌细胞缺氧时间有关。细胞凋亡在心肌缺血、缺氧心肌细胞死亡中起重要作用。     

caspase抑制剂对缺氧诱导的心肌细胞凋亡影响的实验研究

目的 探讨caspase抑制剂对缺氧诱导的培养乳鼠心肌细胞凋亡的作用。方法 将SD乳鼠的培养心肌细胞随机分为3组:对照组、缺氧72 h(I72 h)组,以及caspasee抑制剂组。应用TUNEL法及流式细胞仪分析心肌细胞凋亡的变化;借助caspase-3荧光分析试剂盒,荧光比色法检测心肌细胞凋亡过程中caspase-3活性的变化。结果 caspase抑制剂组凋亡指数(AI值)和细胞凋亡百分率分别为:(14.10±2.56)％,(14.93±2.47)％,与I72 h组(46.49±4.93)％、(48.43±4.18)％相比明显降低(P<0.01)。caspase-3活性检测显示:caspase抑制剂组的caspase-3活性比缺氧72 h组降低了52.85％(P<0.01)。结论caspase抑制剂能明显抑制缺氧诱导的心肌细胞凋亡,其作用机制与抑制caspase-3蛋白酶活性密切相关。     

黄芩素通过抗氧化及调节细胞内钙离子浓度抑制大鼠缺氧/复氧诱导的心肌细胞凋亡

背景:黄芩素对缺氧复氧损伤的心血管有保护作,但机制至今不清。目的:探讨中药黄芩素对心肌细胞缺氧/复氧损伤导致心肌细胞凋亡的保护作用机制。方法:体外培养大鼠乳鼠心肌细胞培养。实验分3组:正常对照组为正常培养的心肌细胞未做处理;缺氧/复氧组为应用缺氧/复氧方法诱导心肌细胞凋亡损伤;黄芩素预处理组为经黄芩素预处理30min后经缺氧/复氧诱导的心肌细胞。通过检测培养基上清液中乳酸脱氢酶活力检测细胞损伤程度及黄芩苷保护作用;应用原位末端标记细胞法标记细胞后,流式细胞检测心肌细胞凋亡率;应用免疫印迹方法检测心肌细胞凋亡蛋白Bax与抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表达水平;应用Fura-2-AM负载心肌细胞,实时检测心肌细胞内Ca2+浓度变化。结果与结论:与正常对照组相比,缺氧/复氧组上清液乳酸脱氢酶活性、心肌细胞凋亡率、Bax蛋白含量、心肌细胞Ca2+浓度均增加(P<0.05),Bcl-2蛋白含量降低(P<0.05)。与缺氧/复氧组相比,黄芩素预处理组乳酸脱氢酶含量、心肌细胞凋亡率、Bax蛋白含量及心肌细胞Ca2+浓度均降低(P<0.05),Bcl-2蛋白含量增加(P<0.05)。证实黄芩素能抑制缺氧/复氧导致的心肌细胞凋亡,其作用机制可能与抗氧化与调节心肌细胞内钙离子浓度有关     

氢气预处理对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响

目的:探讨氢气对乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的影响及其机制。方法:原代培养的SD乳鼠心肌细胞,随机分3组即对照组、缺氧/复氧组、氢气预处理组。对照组常规培养;缺氧/复氧组预先在100%N2环境中培养60min,复氧30min;氢气预处理组预先在2%H2+98%N2环境中培养60min,复氧30min。采用TUNEL法、MDA试剂盒法和MTT法分别检测乳鼠心肌细胞细胞凋亡率、丙二醛(MDA)含量和细胞活力。结果:氢气预处理能够降低乳鼠心肌细胞的凋亡率(P<0.05),减少MDA的生成(P<0.05),增强细胞活力(P<0.05)。结论:氢气预处理对心肌细胞缺氧/复氧损伤具有保护作用,可能机制是抗脂质过氧化抑制细胞凋亡提高细胞活力。     

色满卡林对培养乳鼠心肌细胞H/R损伤的保护作用研究

目的观察色满卡林(CRK)对培养的大鼠乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用并探讨其作用机制。方法采用原代培养的SD大鼠乳鼠心肌细胞,随机分为5组:正常对照组:不施加任何处理因素正常培养;H/R组:缺氧2h,复氧30min;CRK各浓度组:分别加入终浓度为2.5、5、10μmol/L的CRK后均即刻缺氧2h、复氧30min。各组细胞采用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测培养液中LDH的活性;AV-PI双标记后应用流式细胞仪检测心肌细胞的凋亡率;Western blot方法检测caspase-3蛋白的表达。结果 H/R组培养液中LDH活性、心肌细胞凋亡率较正常对照组明显升高,caspase-3蛋白表达水平上调。CRK各浓度组培养液中LDH活性和心肌细胞凋亡率较H/R组降低,caspase-3蛋白表达水平下调。结论 CRK对缺氧复氧致培养大鼠乳鼠心肌细胞的损伤具有保护作用,其机制可能为CRK维持细胞膜完整性与稳定性,下调caspase-3活性蛋白表达水平,减少心肌细胞凋亡率。     

心肌细胞缺氧损伤形式及牛磺酸的保护作用

目的 :探讨心肌缺氧损伤形式及 Tau保护作用。方法 :将培养乳鼠心肌细胞分正常对照、Tau对照、缺氧 +Tau和缺氧 4组。用流式细胞术和 DNA电泳判断细胞凋亡和坏死 ,测定培养液中 CPK和 L DH。结果 :缺氧 +Tau组CPK、L DH和坏死细胞均比缺氧组明显降低 (P<0 .0 5 ) ,但早期凋亡细胞无差别 (P>0 .0 5 )。两组各指标均比对照组明显升高 (P<0 .0 1)。 DNA电泳缺氧 15 h两组均见梯形带 ,缺氧 4 8h均呈瀑布状。结论 :缺氧引起心肌细胞凋亡和坏死。Tau可减轻细胞坏死 ,但对凋亡无抑制作用。     

Ⅰ型磷酸酶抑制亚基1对大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的 探讨Ⅰ型磷酸酶抑制亚基1(PPI1)对大鼠乳鼠心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤的保护作用及其机制.方法 用PPI1野生型和活化型突变体表达质粒分别转染乳鼠心肌细胞,并建立乳鼠心肌细胞缺氧/复氧H/R模型,测定各组心肌细胞的存活率、丙二醛(MDA)、乳酸脱氢酶(LDH)的含量、caspase-3活性及超氧化物歧化酶(SOD)活力,此外用流式细胞术测定各组心肌细胞凋亡率,Western blot分析PPI1对凋亡相关蛋白表达及PI3K/Akt信号通路的影响.结果 与正常组比较,模型组LDH、MDA含量、caspase-3活性及细胞凋亡率增高(P<0.05),细胞存活率和SOD活性降低(P<0.05);PPI1活化型突变体转染组细胞的LDH、MDA含量、caspase-3活性和细胞凋亡率则降低,细胞存活率和SOD活性升高,与缺氧/复氧组比较各实验指标差异均具有统计学意义(P<0.05).Western blot表明该组细胞P53、Bax 表达下调,pAkt表达上调.结论 PPI1活化型突变体对H/R造成的心肌细胞损伤具有保护作用,其机制与稳定心肌细胞膜、减轻氧自由基损伤及减少细胞凋亡有关.     

缺氧预适应和前胡丙素对心肌细胞的保护作用及机制

目的从细胞水平探讨缺氧预适应和前胡丙素对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤后胞内钙离子浓度与细胞凋亡的影响,从而阐明其保护心肌作用的机制。方法体外培养原代乳鼠心肌细胞,被随机分成5组:缺氧复氧损伤(HR)组、缺氧预适应(HP)组、腺苷预处理(AP)组、前胡丙素预处理(PP)组和维拉帕咪预处理(VP)组。在建立缺氧预适应和缺氧-复氧模型和用不同药物进行干预后,用全自动生化分析仪检测漏出LDH值。分别予FLUO-3/AM和Annexin-V荧光染色剂负载细胞后,利用流式细胞仪检测细胞内钙荧光强度和细胞凋亡率,并计算凋亡指数。结果同HR组比较,缺氧复氧组、AP、PP和VP组的LDH值、胞内钙荧光强度值和细胞凋亡指数明显降低(P<0.05)。而且PP组与其它干预组之间无显著差异性(P>0.05)。结论缺氧预适应、腺苷和前胡丙素预处理对缺氧复氧损伤后的心肌细胞均有保护作用,该作用可能与减轻细胞内钙超载,减少细胞凋亡有关;前胡丙素具有较强的钙拮抗作用。     

参附注射液对体外缺氧复氧心肌细胞的影响

目的 观察参附注射液对体外缺氧复氧损伤乳鼠心肌细胞凋亡率及Bcl-2、Caspase-3蛋白的影响,探讨其对缺氧复氧损伤心肌细胞保护作用机制.方法 在协和医科大学阜外心血管病医院卫生部心血管疾病再生医学重点实验室进行以下实验:取出生1～2 d SD乳鼠,采用培养乳鼠心肌细胞建立缺氧复氧损伤模型.将培养的心肌细胞随机分为四组:(1)正常对照组(Con组)37℃、5%CO<,2>孵箱中持续孵育20 h,未经缺氧复氧处理;(2)缺氧复氧组(H/R组) 给予培养的心肌细胞单纯缺氧4 h,复氧16 h;(3)低剂量参附注射液组(L-SFI组)在缺氧前30min加入终质量浓度为50μL/mL的参附注射液,余同缺氧复氧组;(4)高剂量参附注射液组(H-SFI组)在缺氧前30 min加入终质量浓度为100μL/mL的参附注射液,余同缺氧复氧组.采用异硫氰酸荧光素(FTI℃)标记的Annexin V(Annexin V-FITC)及碘化丙锭(PI)双染流式细胞仪检测细胞凋亡率.采用增强化学发光免疫印记技术(ECZ-Western blot)检测心肌细胞Bcl-2,Caspase-3蛋白水平.采用SPSS11.5统计软件进行分析,均数计量资料以均数±标准差(x±s)表示,组间比较单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义.结果 与Con组比较,H/R组细胞凋亡的各个阶段的凋亡率显著增加(P<0.01);与H/R组比较,L-SFI组和H-SFI组凋亡率明显下降(P<0.01).免疫印迹检测结果显示,与Con组比较,H/R组Bcl-2蛋白表达水平显著降低,出现Caspase-3相对分子质量17 000的裂解片断;与H/R组比较,不同浓度的参附注射液组Bcl-2蛋白的表达明显升高,伴随Caspase-3相对分子质量17 000片断的表达减少.结论 参附注射液可以减少缺氧复氧诱导的细胞凋亡,其机制可能通过上调Bcl-2蛋白表达,抑制Caspase-3蛋白的激活,发挥其抗凋亡的作用.     

芬太尼对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤的保护作用

目的 采用乳鼠心肌细胞缺氧复氧模型,观察芬太尼与缺氧预适应对心肌细胞缺氧复氧损伤的影响,探讨芬太尼能否直接作用于心肌细胞并模拟缺氧预透应(APC)样心肌保护作用,试图在细胞水平上为临床应用大剂量芬太尼减轻心肌缺血再灌注损伤提供理论依据.方法 以常规方法 制备与培养心肌细胞,分为4组:正常对照组(C组)不经任何处理;单纯缺氧复氧组(A/R组)、缺氧预适应组(AP组)及芬太尼组(F组)均经历2小时缺氧及1小时复氧.缺氧前,AP组预先经历20分钟缺氧及20分钟复氧;F组给予终浓度为50 ng/ml的芬太尼.分别以四甲基偶氮唑盐(MTT)快速比色法检测细胞存活情况、流式细胞仪检测细胞凋亡率及透射电子显微镜观察细胞超微结构改变.结果 F组和AP组OD值均显著高于A/R组,细胞凋亡率显著低于A/R组;F组OD值与细胞凋亡率与AP组比较差异无显著性意义;电镜显示A/R组细胞超微结构改变呈典型的凋亡细胞形态学改变,AP组及F组细胞形态大致正常,凋亡细胞少见.结论 芬太尼对乳鼠心肌细胞缺氧复氧损伤有保护作用,且其保护效应与APC的心肌保护作用相似.     

流式细胞术检测HIE后脑皮质细胞凋亡

目的：探讨脑皮质细胞凋亡在新生猪缺氧缺血性脑病（ＨＩＥ）发生与发展。方法：应用流式细胞术（ＦＣＭ）、ＤＮＡ凝胶电泳对新生猪ＨＩＥ脑皮质细胞凋亡进行定量分析。结果：缺氧缺血后７２小时新生猪左额顶大脑皮质细胞凋亡率较对照组明显增加（ｎ＝１５,１２;ｍａｉｎ±ｓ％＝２６１８±１６３５,３２３±２９３;Ｐ＜００００１）;ＤＮＡ凝胶电泳显示明显“ＤＮＡＬａｄｄｅｒ”。结论：脑皮质细胞凋亡在患ＨＩＥ新生动物的迟发性神经细胞损伤中占有重要地位。     

60^Coγ射线照射对心肌细胞蛋白表达的影响

目的研究60^Coγ射线照射对体外培养的大鼠心肌细胞蛋白表达的影响。方法体外培养新生大鼠心肌细胞,分为未照射组（OGy组）、5Gy、10Gy、20Gy照射组,分别用60^Coγ射线0Gy、5Gy、10Gy、20Gy单剂量照射心肌,在照射后48h：（1）用蛋白检测试剂盒检测各组心肌细胞中的总蛋白含量;（2）用流式细胞仪检测检测各组细胞的细胞周期变化;（3）用带绿色荧光蛋白基因的腺病毒（AdGFP）感染各组心肌细胞,感染后48h用流式细胞仪检测各组心肌细胞中所含的绿色荧光蛋白的平均荧光强度（MFI）,间接比较各组心肌细胞中绿色荧光蛋白的生成量。结果照射后48h,各照射组心肌细胞中的总蛋白含量较未照射组减低,照射组心肌细胞的绿色荧光强度明显弱于未照射组（P〈0．01）,抑制程度与照射剂量呈正相关。结论60^Coγ射线单剂量照射抑制体外培养的心肌细胞的蛋白合成。     

P物质对体外培养大鼠心肌细胞β1-肾上腺素能受体表达下调作用的研究

目的 观察P物质(SP)对体外培养新生大鼠心肌细胞β1-肾上腺素能受体(β1-AR)表达的影响.方法 选择出生1～3 d的SD大鼠.分离、培养心肌细胞,将细胞培养至72 h待用.用6孔培养板将细胞随机分为对照组与10-7mol/L SP组,每组3孔;采用免疫细胞化学技术测定心肌细胞中β1-AR的表达.另取15孔培养板将细胞随机分为对照组(不加药物干预)与SP组(分别给予10-9、10-8、10-7、10-6mol/L SP干预),每组3孔;采用流式细胞术测定心肌细胞膜表面β1-AR的表达.结果 免疫细胞化学结果显示,SP组心肌细胞β1-AR阳性单位和平均吸光度(A)值均低于对照组(阳性单位:179.61±48.18比205.79±117.42,A值:128.26±22.72比157.35±33.11,P均<0.05).流式细胞术结果显示,不同浓度SP组β1-AR表达均低于对照组.除10-9mol/L SP组(158.87±3.12)外,10-8、10-7、10-6mol/L SP组与对照组比较差异有统计学意义(151.85士4.63,135.00±6.84,121.41±5.22比161.35±3.09,P均<0.05),且呈剂量依赖性.结论 SP可以抑制体外培养大鼠心肌细胞β1-R的表达.     

雌激素对血清饥饿诱导成骨细胞凋亡的影响

目的探讨雌激素对血清饥饿诱导体外培养大鼠成骨细胞凋亡的影响。方法新生SD大鼠颅骨第2、3代成骨细胞随机分为对照组、血清饥饿组和血清饥饿＋雌激素组，每组细胞分别培养24h、48h、72h、5d、7d、14d后行TUNEL染色观察凋亡细胞的形态特征：流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。结果对照组细胞核未见明显异常；血清饥饿组可见细胞核内有紫兰色颗粒的凋亡细胞；血清饥饿＋雌激素组凋亡细胞明显减少；与对照组比较，血清饥饿组细胞凋亡率升高，血清饥饿＋雌激素组细胞凋亡率降低（P〈0．05）。结论雌激素能抑制血清饥饿诱导的大鼠成骨细胞凋亡。     

Caspase-3特异性抑制剂对缺血再灌注损伤诱导的大鼠心肌细胞凋亡的作用

目的：探讨caspase-3特异性抑制剂在大鼠缺血再灌注损伤诱导心肌细胞凋亡中的作用。方法：SD大鼠36只,随机分为3组：对照组、I／R3b组和抑制剂组。应用TUNEI,法及流式细胞仪分析心肌细胞凋亡的变化,借助caspase-3荧光分析试剂盒,荧光比色法,检测心肌细胞凋亡过程中caspase-3活性的变化。结果：TUNEL及流式细胞仪分析显示caspase-3抑制剂组的AI值和细胞凋亡百分率分别为（4．48±0．98）％,（6．42±1．00）％;与I／R3h组[（18．33％±1．71）％,（29．88±3．74％）]相比明显降低并有显著差异（P〈0．01）。caspase-3活性检测显示caspase-3抑制剂组的caspase-3活性明显降低,比I／R3h组降低了45．67％（P〈0．01）。结论：caspase-3抑制剂能明显抑制心肌缺血再灌注后的心肌细胞凋亡。caspase-3抑制剂能明显抑制心肌缺血再灌注后的心肌caspase-3蛋白酶活性。     

壮筋续骨汤含药血清体外培养大鼠成骨细胞的增殖

背景：壮筋续骨汤具有促进胫骨骨折愈合的作用。目的：观察壮筋续骨汤含药血清对体外培养大鼠成骨细胞增殖的影响。方法：大鼠灌胃给予壮筋续骨汤后制备含药血清。取第2代生长状况良好出生48h内的SD大鼠成骨细胞,对照组和壮筋续骨汤组分别加入5%,10%,20%的正常SD大鼠血清和含药血清培养72h。结果与结论：MTT法检测发现壮筋续骨汤含药血清对成骨细胞的增殖有明显的促进作用,以10%壮筋续骨汤组作用最明显（P〈0.05）。流式细胞仪检测各组细胞DNA合成期（S期）的比例,发现壮筋续骨汤组处于S期的细胞比例明显大于对照组（P〈0.05）。说明壮筋续骨汤含药血清能促进成骨细胞DNA的合成,使更多的细胞进入S期,促进体外培养的成骨细胞增殖。     

酸性成纤维细胞生长因子促血管内皮细胞增殖的实验研究

目的：探讨酸性成纤维细胞因子（aFGF）对体外培养的大鼠主动脉内皮细胞生长的影响。方法：通过组织块培养法获取主动脉内皮细胞。将aFGF(10ng/ml）加入内皮细胞的培养液中作为实验组，不加aFGF的作为对照组。分别在24、48和72小时行细胞计数。结果：从大鼠主动脉成功地获取了内皮细胞。3天内，实验组和对照组的主动脉内皮细胞都有不同程度地增殖，24小时内两组无明显区别，48小时和72小时两组相比有非常明显的统计学差别（P＜0．01）。结论：aFGF有非常明显的促进血管内皮细胞生长的作用，可能对缺血性心脏病的促血管形成治疗有较大的帮助。     

EVn-50对人宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究EVn-50体外对人宫颈癌Hela细胞增殖及凋亡的影响。方法:体外培养Hela细胞,台盼蓝拒染法检测细胞活力;AO/EB染色荧光显微镜观察EVn-50诱导Hela细胞凋亡形态学改变;DNA凝胶电泳确证EVn-50诱导Hela细胞凋亡作用;PI染色流式细胞仪检测EVn-50诱导Hela细胞凋亡率。结果:EVn-50体外对人宫颈癌Hela细胞的增殖具有显著抑制作用,呈浓度依赖性。EVn-50可诱导Hela细胞凋亡,AO/EB染色可见典型凋亡小体;DNA凝胶电泳在EVn-50浓度100μg/mL作用48h出现典型"梯形"DNA条带;PI染色流式法显示EVn-50在10、100μg/mL作用Hela细胞48h后,凋亡率分别为(8.80±0.16)%及(20.93±0.62)%,呈浓度依赖性。结论:EVn-50具有抑制人宫颈癌Hela细胞增殖并诱导细胞凋亡作用。     

柴胡皂甙d上调HL-60细胞糖皮质激素受体mRNA并诱导细胞凋亡

目的　观察柴胡皂甙d(SSd)对HL 6 0细胞糖皮质激素受体 (GR)mRNA表达的调节作用以及对细胞凋亡的影响。方法　选用从柴胡中提取的单体成分SSd ,以3 H 胸腺嘧啶掺入法观察SSd对细胞生长的抑制作用 ,DNA凝胶电泳及流式细胞术分析细胞凋亡 ,用Northernblot分析GRmRNA的改变。结果　经SSd作用后 ,HL 6 0细胞3 H 胸腺嘧啶掺入率明显降低 ,呈时间和剂量依赖关系 ,10 μg/mlSSd处理 48小时作用最明显 ,6 0小时时出现典型的DNA片段梯形带 ,流式细胞仪分析细胞阻滞于G1期并出现凋亡峰 ;GRmRNA表达增加。结论　SSd可上调HL 6 0细胞GRmRNA表达并诱导细胞凋亡。