周期型马来丝虫副肌球蛋白基因克隆、序列分析及编码产物B细胞表位预测

目的：克隆周期型马来丝虫副肌球蛋白（BmPmy）基因，进行序列测定、分析及编码产物的B细胞表位预测。方法：从周期型马来丝虫虫体中抽提总RNA，以mRNA为模板，RT-PCR法体外扩增BmPmy基因，扩增产物经初步鉴定后将其克隆人pGEM—T载体，转化E．coliDH5a，筛选阳性克隆，进行双酶切及PCR扩增鉴定，获得阳性重组质粒pGEM—TBmPmy，经测序验证，并进行同源性比较。应用5种参数和方法对其编码产物进行B细胞表位预测。结果：RT-PCR扩增出一条约2640bp的特异性条带，重组质粒双酶切的PCR结果与预期相符，DNA序列分析与基因库已知的基因序列同源性为99％。经表位预测分析，BmPmy的B细胞表位可能在54～66位、144～152位、770～780位和834～845位氨基酸区域。结论：成功构建了BmPmy重组质粒pGEM—T克隆载体，为进一步研究该基因的功能提供了条件。     

马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、序列分析及编码产物B细胞表位预测

根据GenBank中马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(BmG3PD基因)序列设计引物, 以马来丝虫mRNA为模板, RT-PCR扩增BmG3PD基因, 将其克隆入pGEM-T载体, 转化大肠埃希菌（E. coli）DH5α, 筛选阳性克隆。经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及PCR鉴定, 获得阳性重组质粒pGEM-BmG3PD, 经序列分析及同源性比较, 以及对其编码产物进行B细胞表位预测, 结果表明PCR扩增的特异性条带为1 020 bp, 与预期相符, 与GenBank已知基因序列同源性为99%。编码产物B细胞表位预测, 氨基酸区域可能在22～36、242～255、303～318和326～336位。     

间日疟原虫乳酸脱氢酶编码区全长基因的克隆、序列分析及线性B细胞表位预测

目的克隆中国间日疟原虫乳酸脱氢酶(PvLDH)编码区全长基因,并对其进行生物信息学分析。方法自间日疟原虫抽提RNA,根据已知的PvLDH基因设计特异性引物,采用RT-PCR扩增PvLDH编码基因,将其克隆至pMD18-T载体,经PCR和双酶切鉴定后进行序列测定,利用生物信息学在线工具对序列进行分析并做B细胞表位预测。结果 PCR产物电泳结果显示所克隆的基因为951bp,基因测序结果与GenBank报道的基因序列有一个碱基差异,但编码氨基酸无差异。在线分析预测出12个B细胞表位,与恶性疟原虫乳酸脱氢酶预测表位对比分析,发现一个PvLDH特异性表位。结论成功克隆了我国间日疟原虫乳酸脱氢酶编码区全长基因,并预测出1个PvLDH特异性线性B细胞表位。     

B细胞表位预测的研究进展

表位,又称抗原决定簇,是指免疫应答中被特异的效应 分子或T、B淋巴细胞识别的抗原分子的特定结构位点。B细 胞表位是指抗原中可被B细胞抗原受体(BCR)或抗体特异 性识别并相互结合的线性片段或空间构象型结构。B细胞表 位的预测对免疫原性多肽和新型疫苗分子的设计都有很大 的帮助,并有利于诊断试剂的开发以及临床疾病的诊断。     

人体疟原虫乳酸脱氢酶基因多态性及B细胞表位预测

目的　分析4种人体疟原虫乳酸脱氢酶（Plasmodium lactate dehydrogenase, pLDH）基因多态性并预测pLDH 肽链B细胞抗原表位。方法　收集传染病报告信息管理系统中登记的云南省疟疾病例血样和流行病学等信息。采用巢式PCR技术扩增4种人体疟原虫pLDH基因并测序,应用MEGA 7.0.26和DnaSP 5.10软件分析4种人体疟原虫pLDH基因DNA序列多态性,并采用免疫表位数据库（IEDB）预测pLDH 肽链B细胞抗原表位。结果　分别从153份间日疟、29份恶性疟、17份卵形疟和11份三日疟患者血样中获得间日疟原虫LDH（PvLDH）、恶性疟原虫LDH（PfLDH）、卵形疟原虫LDH（PoLDH）、三日疟原虫LDH（PmLDH）基因测序序列,分别定义15、2、4、2种单倍型,核苷酸多样性指数（π）为0.104。PoLDH基因种内分化程度较高,π为0.012;PvLDH、PfLDH和PmLDH基因π值均 < 0.001。4种人体疟原虫pLDH肽链可预测到4～5个/链的B细胞抗原活性区,活性得分约0.430;其中活性区短肽“86⁃PGKSDKEWNRD⁃96”为4种人体疟原虫共有的B细胞抗原表位,“266⁃GQYGHS(T)⁃271”仅出现在PvLDH和PoLDH肽链,PvLDH、PfLDH肽链特有的B细胞抗原表位分别是“212⁃EEVEGIFDR⁃220”和“208⁃LISDAE⁃213”。结论　PoLDH基因多态性可能来自微弱的负向纯化选择,PvLDH、PfLDH、PmLDH基因则可能维持了相对保守状态。pLDH肽链近C端可能存在可区分间日疟、恶性疟原虫感染的B细胞抗原表位“212⁃EEVEGIFDR⁃220”和“208⁃LISDAE⁃213”。     

周期型马来丝虫CPI基因真核表达载体的构建和免疫学研究

目的构建周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂(BmCPI)基因真核表达载体pcDNA3.1-BmCPI,并观察其在小鼠体内的免疫应答反应。方法以周期型马来丝虫总RNA为模板,逆转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因片段。与pGEM-T Easy克隆载体连接,筛选出阳性克隆,经PCR和双酶切鉴定后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1,构建pcDNA3.1-BmCPI表达载体。将48只小鼠随机分为4组,每组12只,分别为健康对照组、空质粒组、pcDNA3.1-BmCPI组和pcDNA3.1-BmCPI/CpG组,分别注射PBS 100μl、空质粒pcDNA3.1 100μg、重组质粒pcDNA3.1-BmCPI100μg和重组质粒pcDNA3.1-BmCPI 100μg+佐剂CpG 30μg,采用左后腿胫前肌注射免疫。每2周1次,共3次,于末次免疫后第4周,用RT-PCR方法检测小鼠注射部位肌肉组织内目的基因转录情况。于末次免疫后第4和第6周,用噻唑蓝(MTT)法检测小鼠T淋巴细胞刺激增殖水平。于末次免疫后第2、4和6周,用ELISA法检测小鼠血清γ干扰素(IFN-γ)和白介素-4(IL-4)水平。结果成功构建了...     

肺炎链球菌StkP蛋白B细胞及T细胞抗原表位的生物信息学分析

目的 运用生物信息学方法对肺炎链球菌StkP基因编码蛋白的理化性质、结构等进行分析,并预测其潜在的B细胞以及T细胞抗原表位。方法 通过NCBI数据库获取StkP蛋白氨基酸序列的相关信息;运用ProtParam软件分析StkP蛋白的理化性质;采用ProScale软件预测StkP蛋白的亲水性、柔韧性、表面可及性、β-转角;使用SOMPA和SWISS-MODEL在线服务器分析StkP蛋白的二级结构并构建其三级结构;分别采用ABCpred及IEDB软件综合预测其B细胞表位,采用SYFPEITHI软件分析确定其T细胞表位。结果 StkP蛋白由659个氨基酸组成,理论pI值8.61,原子组成为C₃₁₉₇H₅₂₃₄N₈₇₂O₉₉₇S₁₄,不稳定指数为40.13,归类为不稳定蛋白,平均亲水系数(GRAVY):-0.294,属于亲水性蛋白;StkP蛋白的二级结构中α螺旋占33.08%,延伸链占19.58%,β-转角占7.74%,无规卷曲占39.61%。ABCpred及IEDB软件预测StkP蛋白...     

梅毒螺旋体TprF蛋白B细胞表位的预测与鉴定

目的 预测和鉴定梅毒螺旋体(Tp) 膜蛋白TprF氨基端保守区(TprF^N)的优势B细胞表位,为深入研究梅毒多价表位疫苗提供依据。方法 从GenBank获取TprF^N的氨基酸序列,采用Mobyle、ABCpred和IEDB在线软件综合分析预测TprF^N的B细胞表位并人工合成多肽;表达重组蛋白TprF^N并经Western blot鉴定后免疫兔,获取血清并测定抗体效价;以TprF^N免疫兔血清、梅毒患者血清(设正常人血清和正常兔血清为阴性对照),间接ELISA测定预测的7条人工合成的B细胞表位多肽的免疫反应性和特异性。结果 软件综合预测TprF^N的P1 (43-62AA)、P2(57-71AA)、P3(81-88AA)、P4(89-103AA)、P5(125-138AA)、P6(231-251AA)、P7(268-279AA)可能为B细胞表位;表达一可溶性蛋白,WB鉴定为目的 蛋白,其免疫抗体效价为1∶12 800以上;ELISA结果显示,预测表位P1、P3与TprF^N免疫兔血清及梅毒患者血清均呈阳性反应,而与对照血清均不反应。结论 P1、P3为TprF潜在的优势B细胞表位。     

日本血吸虫病诊断分子B细胞表位的预测与鉴定

目的应用生物信息学技术对日本血吸虫病常用诊断分子进行B细胞表位的预测,筛选出具有潜在诊断价值的表位分子,采用基因工程方法制备目的表位的融合蛋白并进行抗原性鉴定.方法将日本血吸虫膜蛋白22 kDa(Sj22)、膜蛋白23 kDa(Sj23)、信号蛋白14-3-3(Sj14-3-3)、谷胱甘肽S转移酶(Sj26)分子的全基因序列输入BioSun软件的工作区,经多参数比较筛选可能的B细胞表位,克隆、表达预测表位,用表达的融合蛋白作为抗原与血吸虫病人血清反应,以筛选和鉴定具有抗原性的表位.结果经预测分析,Sj22的B细胞表位可能在56～62位和127～133位氨基酸区域,Sj23的B细胞表位可能在149～156位和160～167位氨基酸区域,Sj14-3-3的B细胞表位可能在118～225位和130～137位氨基酸区域,Sj26的B细胞表位可能在143～149位和191～197位氨基酸区域.克隆、表达并纯化这8个表位的融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot检测抗原性,筛选出分别来自于Sj22、Sj14-3-3、Sj26的3条具有较强抗原性的表位片段.结论生物信息学技术结合分子生物学方法可用于筛选具有潜在诊断价值的表位.     

肠道病毒71型VP1外壳蛋白二级结构及B细胞表位预测

目的预测肠道病毒71型（EV71）外壳蛋白VP1二级结构和B细胞表位,为制备EV71疫苗的研究提供理论基础。方法应用GOR4、HNN、SOPMA、nnPredict等方法预测EV71 VP1二级结构,并结合亲水性、柔韧性、表面可能性和吴氏抗原指数法综合预测潜在的B细胞表位。结果EV71 VP1二级结构以无规卷曲和β-片层为主,含有少量的α-螺旋,少见β-转角;EV71 VP1潜在的B细胞表位很可能位于第67-71位氨基酸残基。结论联合多种生物信息学方法成功预测了EV71 VP1二级结构和B细胞表位;此为制备EV71疫苗的研究提供了理论基础。     

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶基因原核和真核表达质粒的构建

目的构建我国流行的周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶（BmCP）基因原核和真核表达质粒，为进一步研究奠定基础。方法从周期型马来丝虫虫体中提取总RNA，反转录成cDNA，设计合成引物，以eDNA为模板，通过PCR从eDNA中扩增出目的基因，扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pMD18-T载体，进行双酶切及PCR扩增鉴定，获得阳性重组质粒，进行测序分析和同源性比较。阳性克隆的质粒亚克隆至真核表达质粒peDNA3．1（＋），转化感受态大肠埃希菌（E-coli）DH5α，筛选阳性克隆，用PCR和双酶切鉴定阳性重组子。结果RT—PCR扩增出1条约1201bp的特异性条带，重组质粒双酶切和以质粒为模板的PCR结果与预期相符．DNA序列分析与GenBank已知的基因序列同源性为99％。构建了真核重组表达质粒peDNA3．1-BmCP。结论成功构建了周期型BmCP原核和真核重组表达质粒，为进一步研究该基因的功能提供了条件。     

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂和3-磷酸甘油醛脱氢酶复合基因真核表达载体的构建及免疫研究

目的 构建周期型马来丝虫(Bm)半胱氨酸蛋白酶抑制剂(CPI)和3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)重组复合基因真核表达质粒,观察其在小鼠体内的细胞免疫应答效应.方法 将重组质粒pGEM-T/BmCPI和pGEM-T/BmG APDH以及真核重组表达载体分别进行双酶切,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1 (+)-BmCPI/BmGAPDH.将纯化的pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH和含非甲基化胞嘧啶和鸟嘌呤的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)免疫BALB/c小鼠,并设PBS对照组及空质粒对照组,共免疫3次,每次间隔2周.采用RT-PCR方法检测肌肉组织内的目的基因,采用四甲基偶氮唑盐( MTT)法和ELISA法分别检测免疫小鼠T淋巴细胞刺激增殖指数和血清中IFN-γ、IL-4水平.统计学分析采用t检验.结果 pcDNA3.1 (+)-BmCPI/BmGAPDH复合基因真核表达载体免疫小鼠后,从小鼠肌肉组织内扩增出目的基因.免疫6周后,pcDNA3.1(+)-BmCPI/CpG组和pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH/CpG组T淋巴细胞刺激增殖指数分别为1.466±0.635和1.610±0.112,显著高于PBS组的1.004±0.019和pcDNA3.1(+)-CpG组的1.078±0.129(t=64.438、45.318、42.749、34.314,均P＜0.05).免疫4周后,pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH/CpG组IFN-γ、IL-4水平均高于pcDNA3.1(+)-CpG组(t=288.053、76.453,均P＜0.05),其中IFN-γ水平与pcDNA3.1(+)-BmCPI/CpG组相比也有明显提高(t=129.642,P＜0.05).结论 pcDNA3.1(+)-BmCPI/BmGAPDH重组复合基因真核表达载体能在小鼠体内表达,并可有效诱导特异性细胞免疫应答.     

周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氢酶/半胱氨酸蛋白酶抑制剂复合基因真核重组质粒的构建与表达

目的 构建周期型马来丝虫3-磷酸甘油醛脱氰酶/半胱氨酸蛋白酶抑制剂(GAPDH/CPI)复合基因真核重组表达质粒,为研制复合多价疫苗奠定基础.方法 依据GenBank中BmGAPDH及BmCPI基因序列设计引物,以周期型马来丝虫总RNA为模板,RT-PCR扩增目的 编码基因.PCR产物经TA克降后,克隆至载体pGEM-T Easy中.取阳性重组质粒pGEM-T/BmGAPDH和pGEM-T/BmCPI以及真核重组表达载体分别双酶切,将酶切后的载体和目的 片段进行连接,构建真核重组表达质粒pcDNA3.1(+)/BmGAPDH/BmCPI.将复合基因重组质粒瞬时转染人HeLa细胞后,进行RT-PCR验证,将表达产物用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分析和鉴定.结果 分别克隆了pGEM-T/BmGAPDH和pGEM-T/BmCPI重组质粒,经酶切鉴定分别得到877、621 bp特异性片段,与预期值吻合.成功构建了复合基因重组真核表达载体pcDNA3.1(+)/BmGAPDH/BmCPI,酶切鉴定所产生的片段大小与预期吻合.复合基因真核重组表达质粒转染HeLa细胞后得到高水平表达,SDS-PAGE分析显示重组蛋白相对分子质量(Mr)约为54×103.结论 成功构建了周期型马来丝虫GAPDH/CPI复合基因重组表达质粒,并在哺乳动物细胞内得到正确表达.

Abstract：

Objective To construct the eukaryotic expression plasmid containing glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and cysteine protease inhibitor ( CPI ) gene from periodic Brugia malayi (Bm) and to lay foundation for studying multivalent vaccines. Methods Total RNA was extracted from periodic Bin. The BmGAPDH and BmCPI genes were amplified by RT-PCR. The PCR product was cloned and then subeloned into eukaryotic recombinant plasmid vector pcDNA3.1 (+). pcDNA3.1 (+)/BmGAPDH/BmCPI was constructed. The recombinant plasmids were screened and identified by digestion with restriction enzyme and PCR amplification, and were transformed into HeLa cell subsequently. The transient expression of BmGAPDH and BmCPI were examined by RT-PCR. The expressed protein was identified by sodium dodeeylsulphate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE). Results Two specific bands of around 877 bp of BmGAPDH and 621 bp of BmCPI were amplified, consistent with the expected value. The same bands were obtained by double restriction enzyme digestion of recombinant plasmids or PCR using recombinant plasmid as template. BmGAPDH and BmCPI mRNA were highly expressed in transfeeted HeLa cell. The relative molecular mass (Mr) of the recombinant protein was about 54 × 103. Conclusion The recombinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1 (+)/BmGAPDH/BmCPI has been constructed successfully and the protein is expressed correctly in mammalian cell.     

致肾盂肾炎大肠杆菌粘附素papG基因克隆及序列分析

目的　克隆F13型致肾盂肾炎大肠杆菌 (UPEC) 132株的粘附素基因papG并作序列分析。 方法　根据Ⅰ型papG(papGJ96 )和Ⅱ型 papG(papGIA2 )基因序列设计 3条引物 ,PG2和PG3分别为下游 3’端引物 ,PG1为两型papG上游 5’端共用引物 ,并在各引物 5’端加入限制性内切酶位点。以UPEC132染色体DNA为模板进行PCR扩增 ,将扩增产物克隆入质粒载体 ,筛选阳性重组质粒作序列分析。结果　UPEC132株以Ⅰ型 papG引物扩增时为阴性结果 ,以Ⅱ型 papG引物扩增时可获得约 110 0bp的DNA片段。扩增产物经克隆获得阳性重组质粒 pGC39和pGC10 3,对其序列分析显示 papG132编码337个氨基酸 ,与 papGJ96的同源性仅为 4 5 % ,而与 papGIA2的同源性为 98.6 %。与papGIA2比较 ,papG132核苷酸序列 +3位缺失 1个三联体密码 ,并在特异性受体结合域 +49位、+16 0位和PapD蛋白亚单位作用区 +2 72位、+314位存在错义突变 ,此外还存在 7处同义突变。结论UPEC132株的P菌毛不同于相同血清型的UPECJ96株 ,前者为F13型papA与Ⅱ型papG组合 ,后者为F13型 papA与Ⅰ型papG组合。Ⅱ型PapG粘附力较强 ,具有重要的临床意义。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位编码基因的克隆与序列分析

目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)尿素酶B亚单位的编码基因(ureB)的克隆和序列分析，为H．pylori基因工程疫苗的研究奠定基础。方法应用PCR方法获得国内分离H．pylori菌株MEI，HP27和国际标准参考株H．pylori的ureB基因，通过定向克隆的方法分别插入克隆载体pNEB193中，用质粒酶切电泳和特异PCR方法鉴定重组质粒。克隆基因经测序后进行核苷酸和氨基酸的同源性比较。结果 重组质粒经双酶切后得到1．71kb的ureB基因片段，特异PCR可扩增出ureB基因片段，证实H．pylori ureB基因的重组克隆质粒构建成功。经测序，国内分离H．pylori MEL-HP27的ureB基因全长1710bp( Genbank收录号：AY295085)，编码由569个氨基酸残基组成的肽链，ureB基因序列与GenBank公布的H．pylori相应基因同源性高达96．08％～98．30％，氨基酸序列同源性在98．77％．99．82％之间。结论 成功克隆了MEL-HP27菌株的ureB基因，其核苷酸序列与国际参考株NCTC11637的同源性为97．67％。