分化型胚胎软骨发育基因1特异性小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景：分化型胚胎软骨基因1可调控肿瘤生长、凋亡、衰老相关因子，与肿瘤的发生发展有着重要的联系。 目的：构建针对人分化型胚胎软骨基因1的小干扰RNA表达载体。 方法：从NCBI中查找人分化型胚胎软骨基因1基因全长mRNA序列，利用Katahdin提供的在线小干扰 RNA模板序列设计软件，设计针对分化型胚胎软骨基因1的2条shRNA 的 DNA 模板单链，合成靶向分化型胚胎软骨基因1基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸，退火后与酶切后的pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒连接，在JM-109菌株中扩增，并进行质粒DNA琼脂糖凝胶电泳分析、紫外分光光度计检测、菌落PCR以及测序鉴定。 结果与结论：将含有分化型胚胎软骨基因1目标序列25 bp 的双链 DNA插入片段，连接到pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒形成重组质粒。质粒DNA琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高，可用于后续实验。菌落PCR结果表明产物大小约为170 bp，与预期相符。测序结果表明pGreenPuro™ shRNA Cloning and Expression Lentivector质粒已经插入人分化型胚胎软骨基因1的干扰合成片段，无碱基突变。成功构建了靶向分化型胚胎软骨基因1-小干扰 RNA表达载体。     

靶向胆囊癌血管内皮生长因子基因短发夹样RNA表达质粒的构建与筛选

背景：已有研究通过RNA干扰技术,抑制结肠癌、前列腺癌和视网膜母细胞瘤细胞的血管内皮细胞生长因子基因的表达。尚未见关于RNA干扰血管内皮生长因子抑制胆囊癌肿瘤的相关研究。 目的：创新性构建编码胆囊癌血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA 质粒表达载体,筛选出沉默血管内皮生长因子基因效果最明显的短发夹样RNA表达质粒。 设计、时间及地点：基因工程观察实验,于2008/2009在中南大学湘雅医院卫生部肝胆肠外科研究中心实验室完成。 材料：人胆囊癌细胞株GBC-SD购于同济大学肿瘤研究所。 方法：设计4对针对血管内皮生长因子基因不同位点的短发夹样RNA片段, 构建携带此短发夹样RNA片段的表达质粒(短发夹样RNA1~4)并行酶切鉴定分析。然后通过脂质体将重组质粒转染到胆囊癌细胞株GBC-SD中,48 h后测定转染率。 主要观察指标：重组质粒酶切鉴定结果。转染效率。采用及荧光PCR检测血管内皮生长因子mRNA表达。 结果：成功构建了靶向血管内皮生长因子基因的短发夹样RNA 质粒表达载体, 其中抑制效果最为明显的短发夹样RNA 质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2 质粒。重组质粒经酶切鉴定证实构建成功。质粒在GBC-SD细胞中的转染率约为58.6%。短发夹样RNA抑制血管内皮生长因子基因的mRNA表达,短发夹样RNA2抑制率最高,可达86%。 结论：成功构建并筛选出的靶向血管内皮生长因子的短发夹样RNA表达质粒,其对胆囊癌GBC-SD细胞内的血管内皮生长因子表达具有明显抑制作用。短发夹样RNA2表达质粒抑制作用最明显。     

pcDNA3/BDNF真核表达载体的构建☆

背景：脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)作用广泛,但属于生物大分子,不能通过血脑屏障。基因治疗是目前解决脑源性神经营养因子给药途径最有希望的方案。 目的：拟构建大鼠脑源性神经营养因子基因真核表达载体。 方法：采用反转录聚合酶链式反应技术从SD大鼠脑组织提取总RNA,扩增脑源性神经营养因子基因cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,分别取10 g质粒pcDNA3和纯化的目的基因分别进行EcoR Ⅰ、xho Ⅰ双酶切。将目的基因片段和pcDNA3载体连接,转入感受态DH5α细胞中,经酶切鉴定后送上海博亚生物技术有限公司测序。 结果与结论：RT-PCR产物为749 bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/BDNF酶切后产生 749 bp和5 446 bp的片段,DNA测序证实749 bp片段的碱基序列与大鼠脑源性神经营养因子基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/BDNF重组质粒。     

细菌内重组法快速构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体

背景：腺病毒载体具有在哺乳动物及其多种细胞基因转移和蛋白表达的高效性,目前以细菌内重组法构建病毒载体成为常用方法。 目的：观察以细菌内重组法构建血管内皮生长因子165重组腺病毒载体的可行性。 设计、时间及地点：基因转染病毒载体的单一样本实验,于2007-10/2008-02在中山大学分子生物实验室完成。 材料：合成血管内皮生长因子165基因的引物合成和序列测定由上海生工公司提供。pDNR-1r质粒(已含有绿色荧光蛋白基因)、pInt.AV.spaT质粒、pInt.B.B质粒均购自广州拓普基因技术公司。 方法：通过动态模板PCR 基因合成法合成的血管内皮生长因子165基因克隆入pMD18-T载体获得pMD18-T-VEGF165。将pMD18-T-VEGF165和pDNR经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,构建pDNR-VEGF165载体,酶切鉴定后,pDNR-VEGF165与pInt.AV1.spat共转化BNN菌株的感受态细胞,构建pInt.AV1.spat.VEGF165腺病毒表达载体,将线性化的pInt.AV1.SpaT-VEGF165和pInt.B.B转染293细胞。 主要观察指标：以DNA 测序、酶切及聚合酶链反应法鉴定重组质粒和病毒,并测定重组腺病毒的感染效率。 结果：重组质粒用EcoR Ⅰ酶切后,切成2条片段,大小约为1 kb和6.9 kb,实际的酶切分析结果与理论分析相符,证明转化子中的重组质粒为Cre-LoxP系统介导的含有血管内皮生长因子165基因的重组质粒。荧光显微镜下,8 h后即可见部分细胞发出荧光,24 h发荧光的细胞数及强度达到高峰,转染率超过80%。线性化的pInt.AV1.SpaT-VEGF165和pInt.B.B共转染293细胞,12~14 d后会出现细胞病变效应。分别提取病变293细胞、正常293细胞的DNA,PCR后,1%琼脂糖凝胶电泳,病变的293细胞在约500 bp处出现条带。 结论：以细菌内重组法获得了含有成熟血管内皮生长因子165基因的重组腺病毒。     

miR-221基因干扰慢病毒载体的构建及其有效靶序列的筛选与表达检测

目的 构建携带人miR-221 基因的miRNA 干扰慢病毒载体并寻找其有效靶序列,为胶质瘤的研究提供一种新的方法.方法 合成含干扰序列的双链DNA oligo 直接连入酶切后的RNA 干扰载体上.将产物转入细菌感受态细胞,对长出的克隆进行PCR 鉴定,阳性克隆即为目的 基因RNA 干扰慢病毒载体质粒.再将目的 基因与目的 载体分别进行双酶切,纯化酶切产物后进行定向连接,其产物转入细菌感受态细胞,再对PCR 鉴定阳性的克隆进行测序和分析比对,比对正确即为融合蛋白过表达质粒载体,然后将两种质粒共转染入293T 细胞,用western bolt 法检测其有效敲减靶序列.结果 重组质粒经测序鉴定证明各转录模板完整、正确插入到相应质粒中,共转染后发现编号为PscSI576 的靶点干扰效果最好.结论 本实验成功构建了人miR-221 基因的RNA 干扰慢病毒载体,并找到了有效的干扰靶序列.     

脯氨酰羟化酶RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

背景：慢病毒载体可稳定介导基因沉默且具有较高的转染效率。 目的：构建并鉴定脯氨酰羟化酶 RNA干扰慢病毒载体。 方法：针对脯氨酰羟化酶2基因序列设计RNA干扰靶序列,合成靶序列的寡聚DNA,退火形成双链DNA,与经Age Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pGCSIL-GFP连接、转化大肠杆菌感受态细胞,产生重组RNA干扰慢病毒表达载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。 结果与结论：PCR和DNA测序证实合成的含脯氨酰羟化酶短发卡RNA慢病毒载体寡核苷酸链正确插入pGCSIL-GFP载体。说明实验成功构建脯氨酰羟化酶基因RNA干扰慢病毒载体。     

肿瘤血管抑制肽alphastatin基因克隆及序列分析

目的克隆获得编码具有生物学活性的肿瘤血管抑制肽alphastatin基因。方法采用非对称引物／模板法，依据基因库提供的alphastatin基因序列，设计合成alphastatin基因的引物／模板链，利用聚合酶链反应（PCR）法，从DNA中扩增出人肿瘤血管抑制肽alphastatin基因片段；将获得的基因片段插入质粒载体pGEM．TEasy中，转化到大肠杆菌DH5ct后挑选阳性克隆，利用限制性内切酶酶切鉴定重组质粒。结果经质粒DNA酶切分析及序列测定，获得了人肿瘤血管抑制肽alphastatin基因片段序列。结论首次体外克隆获得了人肿瘤血管抑制肽alphastatin基因，为肿瘤血管抑制肽alphastatin的基因治疗奠定了基础。     

靶向人端粒酶逆转录酶小片段干涉RNA表达载体的构建和表达

目的构建靶向人端粒酶逆转录酶（hTERT）的小片段RNA（siRNA）表达载体，为研究RNA干涉（RNAi）在哺乳动物细胞内抑制靶基因表达奠定基础。方法根据siRNA靶点设计的原则运用相关软件设计靶序列并合成其表达框，连接人质粒载体pRNAT-H1．1／Neo，转染293T细胞，荧光定量RT．PCR和Western blot法检测转染后293T细胞中hTERT表达。结果重组质粒经测序鉴定证明hTERTsiRNA转录模板完整、正确插入到pRNAT．H1．1／Neo质粒中，并筛选出一个抑制hTERT表达效率最高的序列，其hTERT表达仅达22．90％。结论利用基因重组和荧光定量PCR等技术能成功构建并筛选出一个抑制效率最好的靶向hTERT的siRNA表达载体，为以hTERT为靶点的肿瘤基因治疗的后续研究奠定基础。     

甲胎蛋白特异性小干扰RNA重组腺病毒载体的构建

背景：RNA干扰技术的应用，关键在于能够采用1个有效的基因转移系统将小干扰RNA转入至靶细胞，目前广泛应用的是构建小干扰RNA表达载体。 目的：利用AdMax腺病毒载体系统构建表达人甲胎蛋白-小干扰RNA的腺病毒载体。 设计、时间及地点：开放性实验，于2007-03/10在山东大学附属济南市中心医院中心实验室完成。 材料：穿梭质粒pDC316-EGFP-U6为本元正阳基因技术公司产品；AdMax KitD试剂盒与低代数HEK293细胞为Microbix Biosystems Inc.（Canada）公司产品。 方法：选择针对甲胎蛋白 mRNA的特异性小干扰RNA靶序列，设计合成为相应的双链DNA，并将其与酶切线性化的pDC316-EGFP-U6载体片段连接，构建好的穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-AFP-siRNA和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞，同源重组产生重组腺病毒。 主要观察指标：对重组腺病毒进行聚合酶链反应鉴定及扩增、纯化、滴度测定。 结果：构建的穿梭质粒载体经聚合酶链反应鉴定和测序分析，证实与设计一致。重组腺病毒Ad-AFP-siRNA经聚合酶链反应和绿色荧光蛋白表达检测证实构建成功，测定滴度为1.4×109 nfu/L。 结论：实验成功构建了Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA重组腺病毒。     

大鼠delta阿片受体短发卡RNA干扰真核表达载体的构建和鉴定

背景：长期应用阿片受体治疗疼痛会导致药物耐受或成瘾,可能与delta阿片受体密度上调有关。 目的：设计及构建大鼠delta阿片受体短发卡RNA真核表达载体并鉴定。 方法：根据大鼠delta阿片受体mRNA序列设计并体外合成短发卡RNA寡核苷酸片段,退火形成双链,克隆到线性化质粒pGenesil-1,然后进行酶切和测序鉴定。 结果与结论：酶切证明delta阿片受体-短发卡RNA已经插入到质粒载体pGenesil-1里,测序结果证明均为插入正确的克隆质粒,而且质量均符合设计标准,证实靶向大鼠delta阿片受体基因的短发卡RNA真核表达载体构建成功。