蛋白激酶CK2ɑ特异性siRNA增强喉癌细胞Hep-2对顺铂敏感性的研究

目的 探讨RNA干扰技术抑制蛋白激酶CK2ɑ表达后,喉癌细胞Hep-2对顺铂敏感性的变化. 方法 构建蛋白激酶CK2ɑ特异性siRNA表达质粒psiRNA-hH1neo-CK2ɑ和非特异性表达质粒psiRNA-hH1neo-cont,脂质体转染法转染Hep-2细胞.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot技术检测转染后Hep-2细胞蛋白激酶CK2ɑ mRNA和蛋白表达.设立正常对照组、顺铂(5μg/ml)组、psiRNA-hH1neo-CK2ɑ组和psiRNA-hH1neo-CK2ɑ+顺铂(5μg/ml)组,应用MTT法检测转染后Hep-2细胞对顺铂敏感性的变化. 结果 psiRNA-hH1neo-CK2ɑ特异性地抑制了Hep-2细胞中蛋白激酶CK2ɑmRNA和蛋白的表达(P＜0.05).顺铂组(5μg/ml)及psiRNA-hH1neo-CK2ɑ组Hep-2细胞的增殖能力分别为正常对照组的(55.32±4.68)%和(49.68±5.33)%(P＜0.05),但均高于二者联合组(26.12±5.51)%(P＜0.05),转染psiRNA-hH1neo-CK2ɑ后,Hep-2细胞对顺铂敏感性增加了2.12倍. 结论 RNA干扰技术抑制蛋白激酶CK2ɑ表达能增加喉癌细胞Hep-2对顺铂的敏感性.     

蛋白激酶CK2ɑ特异性siRNA对喉癌细胞凋亡的影响

背景 RNA干扰是一种很有潜力的敲除目的基因的工具,凋亡和肿瘤的关系已成为肿瘤研究的焦点,本研究的目的是探讨蛋白激酶CK2ɑ特异性RNA干扰对喉癌细胞凋亡的影响。 方法 构建蛋白激酶CK2ɑ特异性siRNA表达质粒psiRNA-hH1neo-CK2ɑ及非特异表达质粒psiRNA-hH1neo-cont,分别用脂质体转染法转染人喉癌Hep－2细胞。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和Western印迹法分别检测转染细胞蛋白激酶CK2ɑ mRNA和蛋白表达,Annexin V-FITC/PI双染色法检测转染细胞凋亡率的变化,透射电镜观转染细胞形态学变化。 结果 转染psiRNA-hH1neo-CK2ɑ质粒后,Hep－2细胞蛋白激酶CK2ɑ mRNA和蛋白表达均较其它组明显下降（P＜0.05）。psiRNA-hH1neo-CK2ɑ转染细胞组凋亡率明显高于未转染细胞组和psiRNA-hH1neo-cont转染细胞组（25.66％±0.83％比3.66％±0.43％、5.18％±0.22％,均P＜0.05)。和未转染细胞组和psiRNA-hH1neo-cont转染细胞组比较,psiRNA-hH1neo-CK2ɑ转染组细胞出现典型的凋亡征象,如核固缩、染色质凝集靠近核膜和凋亡小体形成。 结论 蛋白激酶CK2ɑ特异性siRNA表达载体可以抑制蛋白激酶CK2ɑ的表达,诱导喉癌细胞凋亡,蛋白激酶CK2ɑ可能是一个有潜力的喉癌治疗靶点。     

蛋白激酶CK2a特异性siRNA增强喉癌细胞Hep-2对顺铂敏感性的研究

目的探讨RNA干扰技术抑制蛋白激酶CK2α表达后,喉癌细胞Hep-2对顺铂敏感性的变化。方法构建蛋白激酶CK2α特异性siRNA表达质粒psiRNA—hH1neo—CK2α和非特异性表达质粒psiRNA—hH1neo—cont,脂质体转染法转染Hep-2细胞。采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）、Western blot技术检测转染后Hep-2细胞蛋白激酶CK2α mRNA和蛋白表达。设立正常对照组、顺铂（5μg/ml）组、psiRNA—hH1neo—CK2α组和psiRNA—hH1neo—CK2α＋顺铂（5μg/ml）组,应用MTT法检测转染后Hep-2细胞对顺铂敏感性的变化。结果psiRNA—hH1neo—CK2α特异性地抑制了Hep-2细胞中蛋白激酶CK2α mRNA和蛋白的表达（P〈0．05）。顺铂组（5μg/ml）及psiRNA—hH1neo—CK2α组Hep-2细胞的增殖能力分别为正常对照组的（55．32±4．68）％和（49．68±5．33）％（P〈0．05）,但均高于二者联合组（26．12±5．51）％（P〈0．05）,转染psiRNA—hH1neo—CK2α后,Hep-2细胞对顺铂敏感性增加了2．12倍。结论RNA干扰技术抑制蛋白激酶CK2α表达能增加喉癌细胞Hep-2对顺铂的敏感性。     

siRNA沉默eIF4E诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡及其机制

目的:观察真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)基因的靶向小干扰RNA(siRNA)对喉癌Hep-2细胞中eIF4E基因表达的影响,探讨其诱导喉癌细胞凋亡的作用机制。方法:采用脂质体LipofectamineTM2000将siRNA-eIF4E转染入人喉癌Hep-2细胞(siRNA-eIF4E组),同时设空白对照组和空质粒组。MTT法检测siRNA对Hep-2细胞增殖的抑制作用,罗丹明染色检测转染后细胞内线粒体膜电位的变化,TUNEL染色法检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blotting法检测凋亡相关基因转录和蛋白表达水平的变化。结果:与空白对照组及空质粒组比较,siRNA-eIF4E组Hep-2细胞中eIF4E基因转录和表达水平明显下调(P<0.01),Hep-2细胞生存率下降(P<0.05),细胞线粒体膜电位降低(P<0.05),细胞凋亡率增加(P<0.05),凋亡相关基因Bim、Bid及Caspase-3表达上调(P<0.05)。结论:siRNA-eIF4E在体外可抑制人喉癌Hep-2细胞增殖,其机制可能是通过激活线粒体凋亡途径诱导Hep-2细胞凋亡。     

重组质粒pCDNA3.1(+)/Ngb对局灶性脑缺血大鼠脑保护作用的研究

目的 研究重组神经球蛋白表达质粒pCDNA3.1( )/Ngb对缺血中的脑保护作用.方法 54只雄性大鼠按随机数字表法分为生理盐水组、空质粒组和重组神经球蛋白组,每组18只分别于皮质区两部位注射生理盐水、质粒pCDNA3.1( )和重组质粒pCDNA3.1( )/Ngb,并于注射后24 h采用改良线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血24 h模型.采用TTC染色、原位细胞凋亡检测、间接免疫荧光法和Western blot检测各组大鼠脑梗死面积,神经细胞凋亡状况和bcl-2蛋白表达变化.结果 经重组质粒pCDNA3.1( )/Ngb处理的大鼠,其脑梗死面积和注射处缺血半暗带凋亡细胞数较其他两组显著减少(P＜0.01),注射处缺血半暗带bcl-2阳性细胞面积百分比显著增高(P＜0.01),bcl-2蛋白的表达上升约40%～50%.结论 质粒pCDNA3.1( )介导大鼠神经球蛋白基因转入脑内可通过上调bcl-2蛋白表达抑制局灶性脑缺血神经细胞凋亡,起到局灶性脑缺血脑保护作用.     

Ⅱ型谷氨酰胺转氨酶对骨肉瘤MG-63细胞凋亡的抑制作用及其机制

目的：研究骨肉瘤MG-63细胞中Ⅱ型谷氨酰胺转氨酶（TG2）的抗凋亡作用,探讨其抑制肿瘤细胞凋亡的机制。方法：设计针对TG2的siRNA,建立骨肉瘤MG-63细胞体外缺氧培养模型,分为常氧组（细胞在常氧下培养）、单纯缺氧组（细胞在缺氧培养箱里培养）、对照siRNA缺氧组（转染对照siRNA后在缺氧培养箱里培养）和TG2 siRNA缺氧组（转染TG2 siRNA后在缺氧培养箱里培养）。观察各组骨肉瘤MG-63细胞在缺氧培养不同时间(6、12、24、48和72 h) 后Bax和Cyt C的表达及细胞凋亡率。微量滴定法检测TG2活性,RT-PCR法检测TG2和Bax mRNA表达水平,免疫组织化学法检测TG2和Bax蛋白在细胞内的分布,Western blotting法检测TG2、Bax和Cyt C蛋白表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：与常氧组比较,单纯缺氧组和对照siRNA缺氧组细胞TG2活性、TG2 mRNA和蛋白表达水平明显增强(P<0.01),并随缺氧时间延长逐渐升高（P<0.01）;Bax mRNA表达水平变化不明显(P>0.05),但Bax蛋白表达水平明显下降(P<0.01),细胞胞浆和线粒体内Cyt C蛋白水平及细胞凋亡率无明显变化（P>0.05）。与单纯缺氧组和对照siRNA缺氧组比较,TG2 siRNA缺氧组细胞各时间点TG2 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Bax mRNA表达水平无明显变化（P>0.05）,Bax蛋白表达明显增加(P<0.01),胞浆内Cyt C蛋白水平明显增加(P<0.01),线粒体内Cyt C蛋白水平明显降低（P<0.01）,细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。结论： TG2通过与Bax形成混合物而消耗Bax,阻止Cyt C释放至胞浆,从而抑制肿瘤细胞凋亡。     

Bcl-2基因转染对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞氧糖剥夺损伤的保护作用

目的研究bcl-2基因转染对体外培养大鼠大脑皮层神经细胞氧糖剥夺损伤的保护作用,为基因转染治疗脑血管病寻找实验依据。方法体外培养新生大鼠大脑皮层神经细胞,应用脂质体转染法将bcl-2基因转染入神经细胞,建立氧糖剥夺模型,实验分为正常对照组、氧糖剥夺组和bcl-2转染组(转染bcl-2基因24h后,进行氧糖剥夺),采用Western blot法、MTT法、流式细胞仪分别检测各组细胞的bcl-2蛋白表达、细胞活力及凋亡率。结果 SD大鼠大脑皮层神经细胞可纯化体外培养,纯度达到90%以上。成功建立了大鼠神经细胞体外氧糖剥夺模型,成功进行了质粒pc-DNA3.1-hbcl-2的转化、扩增及基因转染。对照组神经细胞bcl-2少量表达,氧糖剥夺组bcl-2蛋白微弱表达,转染组细胞bcl-2蛋白高表达,各组间差异均有统计学意义(均P<0.01)。MTT法检测结果显示,对照组细胞的吸光度值(A)为(0.851±0.034);氧糖剥夺组的A值为(0.648±0.030),与对照组相比明显降低(P<0.01);转染组的A值为(0.787±0.004),低于对照组(P<0.05),但明显高于氧糖剥夺组(P<0.05)。对照组神经细胞凋亡率为4.6%;氧糖剥夺损伤后细胞凋亡率明显增加,为19.6%;转染组细胞凋亡率与氧糖剥夺组相比有明显下降,为9.6%,差异有统计学意义(均P<0.01)。结论脂质体介导的bcl-2基因转染对氧糖剥夺损伤的大鼠大脑皮层神经细胞有明显保护作用。     

高脂饮食大鼠肾组织中细胞凋亡及Bcl-2和Bax的表达

目的 观察Bcl-2和Bax高脂饮食大鼠肾组织中Bcl2和Bax表达及细胞凋亡,探讨脂质肾毒性损伤的机制.方法 将10只雄性SD大鼠随机均分为对照组和高脂饮食组,喂养6周,检测血清学指标;用HE染色观察肾脏组织学改变;采用TUNEL法榆测细胞凋亡情况;免疫组化方法检测Bcl-2和Bax表达.结果 高脂饮食组血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平明显高于对照组,而高密度脂蚩白胆固醇(HDL-C)水平明显下降(P＜0.05);高脂饮食组肾组织凋亡细胞数高于对照组(高倍镜视野15.45±5.07vs 3.57±1.38,P＜0.05),且肾小管的凋亡细胞明显多于肾小球;高脂饮食组Bax平均光密度高于对照组(0.276 3±0.091 2vs0.150 6±0.333 4,P＜0.05),Bcl-2平均光密度低于对照组(0.245 0±0.021 6vs0.294 1±0.020 4,P＜0.05).结论 高脂饮食可导致大鼠肾组织中凋亡细胞增多,且Bcl-2、Bax的表达及Bcl-2/Bax影响着肾脏组织细胞凋亡的发生.     

靶向bcl-2基因转录shRNA重组质粒的构建和筛选

目的构建能高效抑制肝星状细胞(HSCs)bcl-2表达的小发夹RNA(shRNA)重组质粒。方法利用RNA干扰技术,设计有小发夹结构的3条DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至转录载体psiRNA-hH1neo上构建重组质粒,予以酶切和测序鉴定。重组质粒转染HSC-T6细胞株,运用实时荧光定量PCR和Western blotting进行筛选鉴定。结果酶切及测序鉴定表明,成功构建重组质粒shRNA1、shRNA2和shRNA3。实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果显示,shRNA1和shRNA2转染后显著抑制HSC-T6中bcl-2mRNA和蛋白表达(P<0.05),其中siRNA1的bcl-2表达抑制效率>80%。结论构建的重组质粒shRNA1能有效抑制HSCs中bcl-2的表达。实验为进一步探索肝纤维化基因治疗的新途径奠定了基础。     

川芎嗪对缺血/再灌注损伤大鼠肾脏细胞凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响

目的: 观察川芎嗪对急性缺血/再灌注(I/R)损伤大鼠肾脏细胞凋亡及凋亡相关蛋白的影响,探讨川芎嗪对急性肾I/R损伤保护作用的可能机制. 方法: 将40只Wistar大鼠夹闭双侧肾动脉45 min再灌注24 h,制备成急性肾I/R损伤动物模型,随机分为假手术对照组、I/R组、川芎嗪治疗组和川芎嗪预防组,采用原位末端标记法检测细胞凋亡指数,免疫组化法测定Bcl-2,Bax表达,电镜观察肾组织细胞超微结构. 结果: I/R组较假手术对照组肾小管细胞凋亡指数明显增多(28.8±4.6 vs 1.9±0.5, P＜0.01),Bax表达显著增强(162.6±17.1 vs 182.7±12.8, P＜0.01),Bcl-2/Bax显著降低(1.1±0.1 vs 1.0±0.1, P＜0.01);川芎嗪预防组较I/R组肾小管凋亡细胞数明显减少(13.6±2.9 vs 28.8±4.6, P＜0.05),Bax表达明显减弱(179.1±12.7 vs 162.6±17.1, P＜0.05),Bcl-2表达明显增强(166.6±15.1 vs 178.7±13.0, P＜0.05),Bcl-2/Bax显著增高(0.9±0.1 vs 1.1±0.1, P＜0.05). 结论: 川芎嗪对急性肾I/R损伤具有保护作用,其作用机制可能是通过调节凋亡相关基因Bcl-2和Bax介导的I/R损伤肾脏细胞凋亡而实现.     

靶向FAK的siRNA对喉癌细胞增殖及侵袭能力的抑制作用

目的 运用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术阻断喉癌Hep-2细胞株中FAK基因的表达,探讨FAK基因沉默后对Hep-2细胞株产生的影响.方法 针对FAK基因,构建2条干扰重组质粒FAK-pGenesil-CH1和FAK-pGen-esil-CH2,1条阴性对照重组质粒FAK-pGenesil-HK;在脂质体的介导下转染喉癌Hep-2细胞株,用RT-PCR和Westem blot分析FAK mRNA及蛋白的表达;MTT法、流式细胞技术及体外侵袭实验测定十扰重组质粒对Hep-2细胞株的增殖、侵袭能力的影响.结果 重组质粒能有效地阻断Hep-2细胞株中FAK基因在mRNA和蛋白水平上的表达(P<0.05);重组质粒转染Hep-2细胞后,细胞增殖抑制率分别为58.34%、52.78%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);干扰组G0~G1期细胞增多,S期细胞数量明显减少(P<0.05);FAK-pGenesil-CH1、FAK-pGenesil-CH2作用Hep-2细胞株48 h后,Hep-2细胞穿过Matrigel膜的个数分别为(56.0±6.7)、(51.0±5,1),与阴性对照组(152.0 ±9.4)、正常对照组(139.0 ±8.1)比较有统计学差异(P<0.05).结论 干扰重组质粒能有效地抑制转染Hep-2细胞株的FAK mRNA及蛋白的表达,并能抑制Hep-2细胞株的增殖及侵袭能力.     

下调泛素样含PHD和环指域1基因的表达对喉癌Hep-2细胞增殖侵袭能力的影响

目的 探讨下调泛素样含PHD和环指域1(ubiquitin-like protein containing PHD and RING finger domains 1,UHRF1)基因在喉癌Hep-2细胞中的表达后对其增殖,凋亡,侵袭迁移能力的影响.方法 实验分为空白组,阴性对照组和干扰组.利用UHRFl-siRNA干扰UHRF1在喉癌Hep-2细胞中的表达,采用qRT-PCR、Western blot检测UHRF1的表达变化.采用MTT法、流式细胞术、Transwell实验检测下调UHRF1表达后Hep-2细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的变化.Western blot检测下调UHRF1表达后Hep-2细胞内Bax、Bcl-2、MMP-2、MMP-9蛋白表达的变化情况.结果 与空白组和阴性对照组相比干扰组下调UHRF1的表达后可明显抑制喉癌Hep-2细胞的增殖能力(P ＜0.001).空白组,阴性对照组,干扰组凋亡率分别为(5.47±2.77)％,(3.95±0.66)％,(18.95±1.10)％,干扰组凋亡率明显提高(P ＜0.001).空白组,阴性对照,干扰组每视野侵袭细胞数分别为(213.7 ±13.1),(221.3±10.3),(97.7±7.5),干扰组侵袭细胞数明显降低(P＜0.001).空白组,阴性对照,干扰组每视野迁移细胞数分别为(230.7±5.5),(222.7±11.2),(111.7±7.6),干扰组迁移细胞数明显降低(P ＜0.001).干扰组细胞Bax蛋白表达上调(P ＜0.001),Bcl-2蛋白表达下调(P ＜0.001),MMP-2蛋白、MMP-9蛋白表达下调(P ＜0.001).结论 在喉癌Hep-2细胞中下调UHRF1的表达后可明显抑制细胞的增殖,促进细胞凋亡,抑制细胞的侵袭迁移能力.     

siRNA对肺癌细胞株bcl-2基因表达的抑制

目的研究小干扰RNA(siRNA)对bcl-2基因表达的抑制作用。方法利用Ambion公司提供的设计软件和试剂盒,设计合成以bcl-2基因为靶标的siRNA,通过脂质体将合成的siRNA转入A549和NCIH460细胞株,以未转染细胞和转染bcl2的反义药物G3139为对照,经MTT法检测siRNA对细胞生长的抑制,RTPCR检测bcl2mRNA水平,流式细胞仪检测细胞周期的改变和bcl-2蛋白表达,反应siRNA对bcl-2表达的抑制效应。结果siRNA组与对照组细胞存活率各时间点均有显著差异(P<0.05);与反义组在24、48h也有显著差异(P<0.05),而72h无差异(P>0.05)。转染12h后,siRNA组bcl-2mRNA与对照组和反义组有显著差异(P<0.05)。转染48h后,siRNA组bcl2蛋白阳性率明显低于对照组和反义组,siRNA组和反义组细胞阻滞于S期。结论体外转录合成的siRNA可抑制A549和NCIH46细胞bcl2基因的表达,效率可达50%以上。     

siRNA沉默VEGF-C 基因对宫颈癌HeLa细胞的生物学特性影响

目的通过RNA干扰技术抑制宫颈癌细胞VEGF-C表达,探讨干扰后VEGF-C、NF-κB、bcl-2基因的表达。方法根据人VEGF-C mRNA编码序列,设计RNA干扰的靶点,并用脂质体转染人宫颈癌HeLa细胞,通过RT-PCR法观察转染后肿瘤细胞VEGF-C、NF-κB、bcl-2基因的变化。结果转染siRNA 24h、48h可以使HeLa细胞VEGF-C mRNA含量降低,在24h降低80.63%±0.24%(P<0.001);在48h降低38.9%±0.85%(P<0.01);NF-κB mRNA含量也分别降低,在24h降低37.55±2.76%(P<0.05);在48h降低30.5%±3.82%(P=0.056);bcl-2mRNA含量同时分别降低,在24h降低76.95%±1.91%,(P<0.01);在48h降低64.11%±2.96%,(P<0.05))。结论脂质体介导的VEGF-C siRNA转染HeLa细胞后,可以有效抑制VEGF-C的表达;可能通过下调转录因子NF-κB,抑制抗凋亡基因bcl-2的表达。     

靶向survivin基因siRNA对喉癌细胞增殖、凋亡的影响

目的观察靶向survivin基因的siRNA对喉癌细胞Hep-2增殖和凋亡的影响,为喉癌的基因治疗提供有效靶点及技术。方法使用阳离子脂质体LipofectamineTM2000将靶向survivin基因的siRNA转染至喉癌细胞株Hep-2;MTT[3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐]法检测对喉癌细胞Hep-2增殖的影响;RT-PCR检测喉癌细胞Hep-2survivin基因mRNA表达的变化;Western Blot检测survivin基因蛋白表达;流式细胞技术检测喉癌细胞Hep-2凋亡情况。结果各浓度survivin-siRNA转染组细胞增殖抑制率和凋亡率均明显高于对照组（〈0.05）,survivinmRNA和蛋白表达有不同程度减弱,并且有明显的浓度依赖性,随着浓度的上升表达率下降。结论利用RNA干扰技术沉默survivin基因表达可以显著抑制喉癌细胞Hep-2细胞增殖,并在一定程度上诱导其自发凋亡,不同浓度survivin-siRNA转染能下调survivinmRNA和蛋白表达,靶向survivin基因的RNA干扰技术在喉癌的基因治疗中具有一定价值。     

Spermidine/spermine N1-acetyltransferase 2 increases sensitivity of renal carcinoma Caki-1 cells to chemotherapy by inhibiting HIF-1α

目的 探讨转染精脒/精胺N1乙酰基转移酶2(spermidine/spermine N1 -acetyltransferase 2,SSAT2)在低氧条件下对肾癌Caki-1细胞增殖、凋亡和阿霉素敏感性的影响及机制.方法 经X-treme GENE HP介导将真核表达质粒pcDNA3.1 (D)/V5-His-SSAT2转入肾癌Caki-1细胞,细胞在1％氧浓度下培养,Western blot法检测SSAT2蛋白和低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha,HIF-1α)蛋白表达；流式细胞仪检测细胞的凋亡率、死亡率；MTT法检测细胞的增殖,以及不同浓度阿霉素对细胞的抑制率.结果 SSAT2成功转入肾癌Caki-1细胞,与空白细胞组及空载体组比较,转染SSAT2组HIF-1α蛋白表达明显下调(P＜0.01),细胞增殖受到明显抑制(P＜0.01),细胞凋亡率和死亡率均增加(P＜0.05).阿霉素浓度为2μg/ml时,转染组细胞抑制率可达(67.5±3.7)％,对空白细胞和空载体细胞的抑制率为(54.7±8.4)％、(56.8±7.7)％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 转染SSAT2可以通过下调HIF-1α蛋白表达,减少肾癌细胞的增殖,增加肾癌Caki-1细胞的凋亡率、坏死率和对阿霉素的敏感性,针对SSAT2的基因治疗可能成为逆转肾癌耐药的方法之一.     

siRNA沉默eIF4E诱导人喉癌Hep-2细胞凋亡及其机制

目的：观察真核细胞翻译起始因子4E(eIF4E)基因的靶向小干扰RNA(siRNA)对喉癌Hep-2细胞中eIF4E基因表达的影响,探讨其诱导喉癌细胞凋亡的作用机制。方法：采用脂质体LipofectamineTM 2000将siRNA-eIF4E转染入人喉癌Hep-2细胞（siRNA-eIF4E组）,同时设空白对照组和空质粒组。MTT法检测siRNA对Hep-2细胞增殖的抑制作用,罗丹明染色检测转染后细胞内线粒体膜电位的变化,TUNEL染色法检测细胞凋亡,RT-PCR和Western blotting法检测凋亡相关基因转录和蛋白表达水平的变化。结果：与空白对照组及空质粒组比较, siRNA-eIF4E组Hep-2细胞中eIF4E基因转录和表达水平明显下调（P<0.01）,Hep-2细胞生存率下降（P<0.05）,细胞线粒体膜电位降低（P<0.05）,细胞凋亡率增加（P<0.05）,凋亡相关基因Bim、Bid及Caspase-3表达上调（P<0.05）。结论：siRNA-eIF4E在体外可抑制人喉癌Hep-2细胞增殖,其机制可能是通过激活线粒体凋亡途径诱导Hep-2细胞凋亡。     

母牛分枝菌菌苗对哮喘豚鼠肺组织嗜酸粒细胞凋亡及Fas、bcl-2蛋白表达的影响

目的:研究母牛分枝杆菌菌苗对哮喘豚鼠肺组织嗜酸粒细胞凋亡及Fas、bcl-2蛋白表达的影响.方法:30只豚鼠随机分为生理盐水组、哮喘组及母分枝杆菌菌苗组.应用卵白蛋白(OVA)建立哮喘模型,母牛分枝杆菌菌苗组每只豚鼠在OVA致敏前10天肌注22.5μg母牛分枝杆菌菌苗.最后一次激发后,TUNEL法检测肺组织嗜酸粒细胞凋亡,免疫组化法检测肺组织Fas、bcl-2蛋白的表达.结果:母牛分枝杆菌菌苗组豚鼠肺组织嗜酸粒细胞凋亡指数(23.8±5.4)%显著高于哮喘组(4.6±0.7)%(P＜0.01);肺组织Fas蛋白表达(OD值)(0.202±0.013)显著高于哮喘组(0.051±0.025)(P＜0.01);肺组织bcl-2蛋白表达(OD值)(0.054±0.032)显著低于哮喘组(0.181±0.041)(P＜0.01).结论:母牛分枝杆菌菌苗通过上调Fas蛋白、下调bcl-2蛋白在哮喘豚鼠肺组织的表达而诱导哮喘豚鼠肺组织嗜酸粒细胞凋亡.     

邻苯二甲酸酯对软骨细胞凋亡及超微结构的影响

目的:通过研究塑化剂邻苯二甲酸酯对软骨细胞凋亡因子bcl-2和Bax蛋白表达及超微结构的影响,探讨邻苯二甲酸酯在致软骨细胞凋亡中的作用机制。方法:用软骨细胞体外培养的方法,原代培养乳鼠关节软骨细胞,传第3代后加药,按染邻苯二甲酸酯剂量不同分为0/L(对照)、10-10/L、10-8/L、10-6/L组,染邻苯二甲酸酯培养7 d后,透射电镜下观察软骨细胞的超微结构改变,采用western-blot方法检测各实验组中软骨细胞bcl-2和Bax蛋白的表达。结果:透射电镜下对照组和10-10/L组的软骨细胞呈球形,粗面内质网发达,线粒体膜性结构完整;10-8/L、10-6/L组的细胞内可见脂滴明显增多,胞质内出现大量空泡类物质,细胞内膜结构不清,部分细胞出现核固缩。10-8/L、10-6/L组的软骨细胞bcl-2的蛋白表达(0.620±0.041和0.530±0.035)较对照组表达(0.805±0.032)显著降低(P<0.01);而Bax的表达(0.966±0.038和1.280±0.154)较对照组表达(0.602±0.045)显著增加(P<0.01)。10-10/L组软骨细胞中bcl-2的表达(0.878±0.055)和Bax的表达(0.650±0.039)与对照组相比均无统计学差异(P>0.05)。此外,10-8/L、10-6/L组相比,bcl-2和Bax的表达也有显著差异(P<0.01)。结论:10-8/L、10-6/L浓度的邻苯二甲酸酯可对软骨细胞超微结构造成损伤,其通过减少抑凋亡因子bcl-2的表达和增加促凋亡因子Bax的表达,从而产生促进软骨细胞凋亡的作用。