噬菌体展示技术及其在医药上的主要应用

噬菌体展示技术（phage display）是一种用于筛选和改造功能性多肽的生物技术，编码多肽的DNA片段与噬菌体表面蛋白的编码基因融合后，以融合蛋白的形式表达在噬菌体的表面，不影响噬菌体的生活周期。同时可保持目的蛋白的天然构象，且能被相应的抗体或受体所识别。随着此项技术的不断完善和发展，噬菌体展示技术已在许多领域得到广泛的运用：抗原表位筛选及疫苗研制、多肽药物的筛选、疾病检测等，并显示了良好的发展前景。本文对近几年来噬菌体展示技术的研究及应用进展作以综述。     

噬菌体展示技术及其在药物筛选中的应用

噬菌体展示文库是目前广泛应用于生物医学领域的较为重要的分子工具,近年来相关研究进展迅速,目前该技术以具有库容量大、结合特异性强等特点而成为药物筛选的实用性工具.本文以噬菌体展示技术的原理为出发点,对噬菌体载体的分子生物学、噬菌体展示文库的构建和筛选及其在药物筛选中的应用进行了综述.     

噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用

噬菌体展示技术是近年发展起来的新技术,在研究蛋白质与蛋白质之间、抗原抗体之间的相互作用、新药开发、疾病诊断、疫苗研制以及病毒研究等方面具有广泛应用。文中就噬菌体展示技术在汉坦病毒研究中的应用现状作一综述。     

噬菌体展示技术及其在病原微生物研究中的应用进展

噬菌体是能特异性地感染细菌的一类病毒,其基因数目少,结构相对简单,容易在分子水平上操控其基因。噬菌体展示技术是将外源肽或蛋白以融合蛋白形式表达并呈现在噬菌体衣壳表面的分子生物学技术。与传统的研究方法相比,噬菌体展示技术具有通量高、成本低、操作简单、耗时短等优点。本综述主要聚焦噬菌体展示技术在病原微生物抗原筛选、抗体制备和疫苗研制等方面的应用进展。     

噬菌体展示技术用于寄生虫病的研究

噬菌体展示 (phagedisplay)技术是指将蛋白分子或肽段的基因克隆到单链噬菌体的基因组中 ,并使噬菌体表面表达该异源性分子。其主要特点是将特定分子的基因型和表型统一在同一病毒颗粒中 ,即在噬菌体表面表达特定蛋白或肽 ,在噬菌体核心DNA中含有该蛋白或肽的结构基因。这种基因型和表型的统一使蛋白的基因工程改造成为可能。另外 ,该技术将扩增和选择有机地结合在一起 ,使表面表达特定蛋白或肽的噬菌体易于得到有效富集 ,并利于做进一步研究。噬菌体展示技术再生至今 ,已被广泛用于抗体文库及肽文库的构建和筛选、蛋白分子的识别和改造、…     

噬菌体展示技术的研究进展

噬菌体展示技术是将外源蛋白通过与丝状噬菌体外壳蛋白融合而表达于噬菌体颗粒表面,被展示的外源多肽可保持相对独立的空间结构和生物活性。最近有实验表明噬菌体表面展示的外源多肽模拟了天然抗原的空间结构,利用筛选肽库的方法确定抗原的线性和构象型表位是可行的。这对于发现与疾病相关的抗原表位具有一定的普遍意义,有可能在未知的情况下进行疫苗及诊断分子的设计。     

用T7噬菌体展示技术筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白

目的 用T7噬菌体筛选系统筛选HCV核心蛋白的相互作用蛋白.方法 应用T7噬菌体展示技术,以通过原核表达的方式得到HCV的核心蛋白作为靶分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选,对筛选到的克隆进行DNA序列分析及同源性搜索.结果 经鉴定得到1个阳性克隆,确定了能与HCV核心蛋白相互作用的蛋白为:Smad interacting-protein 1(SIP1).结论 T7噬菌体展示筛选系统是筛选相互作用蛋白的一种简单、快速和有效的手段,筛选到的相互作用蛋白为进一步探讨核心蛋白的致病、致癌机制提供重要依据.     

抗体噬菌体展示技术研究进展

抗体工程技术随着现代生物技术的发展而不断完善，并且是生物技术产业化的主力军，尤其在生物技术制药领域占有重要地位。噬菌体抗体展示是利用基因工程技术发展起来的一种模拟自然免疫选择系统制备抗体的新技术，与多克隆抗体和单克隆抗体相比，噬菌体抗体展示技术的筛选范围从几千扩增到几百万甚至几亿，而时间则从几个月缩短到几周，且操作简便，成本低廉。     

噬菌体肽库技术筛选肿瘤靶向短肽的研究进展

噬菌体展示技术是一项特殊的基因重组表达技术,亦是一种强大的筛选工具。1985年,Smith等成功地创立了噬菌体展示技术;1990年,Scott等在噬菌体展示技术的基础上发展并构建了噬菌体展示随机肽库。噬菌体肽库技术是一种新兴的药物发现工具［1］,通过噬菌体随机肽库筛选获得的肽可以作为分子载体运载药物,起到生物导弹的功能。筛选的肽也可以直接与药物靶点分子特异性结合,起到生物治疗的作用。近年来,噬菌体肽库技术已广泛应用于肿瘤研究,如癌症的检测和诊断、肿瘤相关抗原的筛选、肿瘤药物的研制、肿瘤细胞信号转导及肿瘤的基因治疗研究等。现就近年来噬菌体展示肽库技术在筛选肿瘤靶向短肽研究中的应用综述如下。     

天花粉蛋白结合肽的筛选及潜在靶点蛋白的同源分析

目的 通过噬菌体展示技术,筛选天花粉蛋白(TCS)的结合多肽,并通过蛋白质同源分析,研究TCS在体内可能直接作用的靶点蛋白。方法 用构建的十五肽库和购买的十二肽库分别对TCS进行4轮固相亲和筛选,并通过噬菌体ELISA检验阳性克隆与靶蛋白的亲和力,对阳性克隆进行测序,并将多肽序列与已登记蛋白序列进行同源性分析。结果 每轮筛选的回收率,及多克隆噬菌体ELISA结果显示筛选有效。通过单克隆噬菌体ELISA结果挑取阳性克隆,测序分析得到若干噬菌体展示多肽序列。经蛋白质同源性分析,TCS特异性结合多肽与蛋白激酶C（PKC）的磷酸化位点具有同源序列。结论 噬菌体展示技术是筛选中药成分靶点蛋白的有效手段,PKC可能为TCS潜在的靶点蛋白。      

噬菌体展示技术筛选卵巢癌细胞表面转移相关分子结合肽

目的：利用噬茵体7肽库筛选高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM表面转移相关分子结合肽。方法：利用噬茵体展示技术体外快速差减筛选（biopanning and rapid analysis of selective inter-activeligands,BRASIL）卵巢癌细胞株HO-8910和HO-8910PM,经过连续5轮生物淘洗,随机挑选14个噬茵体单克隆进行DNA测序,并进行ELISA、噬茵体竞争结合实验验证阳性噬茵体的亲和性。结果：噬菌体克隆Z3（短肽LRLRNTR）对高转移潜能卵巢癌细胞株HO-8910PM有较高的亲和性。结论：噬茵体展示技术筛选的短肽LRLRNTR可望为卵巢肿瘤早期诊断、转移复发及治疗提供新的方向。     

噬菌体随机展示肽库及其应用

噬菌体随机展示肽库是一类利用丝状噬菌体发展起来的多肽文库.通过噬菌体展示技术,目前人们已能借助此类文库研究包括抗原决定簇的鉴定、疾病的诊断与治疗等许多领域的诸多关键性问题.本文简介此类文库的基本作用原理及应用.     

Keratinocyte growth factor (KGF) phage model peptides can promote epidermal cell proliferation without tumorigenic effect

Background KGF significantly influences epithelial wound healing. The aim of this study was to isolate KGF phage model peptides from a phage display 7-mer peptide library to evaluate their effect on promoting epidermal cell proliferation. Methods A phage display 7-mer peptide library was screened using monoclonal anti-human KGF antibody as the target. ELISA was performed to select monoclonal phages with good binding activity. DNA sequencing was done to find the similarities of model peptides. MTT assay, immunofluorescence assay and quantitative real-time PCR analysis were employed to evaluate the effect of the phage model peptides on epidermal cells. Results 56.9% (33/58) of the isolated monoclonal phages exhibited high binding activity by ELISA. Ten of fifteen obtained phage model peptides were similar to KGF or EGF. MTT assay data showed that four (No.1-4) of the ten phage model peptides could promote epidermal cell proliferation. The expression of keratinocyte growth factor receptor (KGFR) mRNA in the KGF control group and the two phage model peptide groups (No.1 and No.2) increased. Expression of c-Fos mRNA and c-Jun mRNA in the KGF control group increased, but did not increase in the four phage model peptide groups (No.1-4). Conclusions Four phage model peptides isolated from the phage display 7-mer peptide library can safely promote epidermal cell proliferation without tumorigenic effect.     

Keratinocyte growth factor phage model peptides can promote epidermal cell proliferation without tumorigenic effect

Background Keratinocyte growth factor （KGF） significantly influences epithelial wound healing. The aim of this study was to isolate KGF phage model peptides from a phage display 7-mer peptide library to evaluate their effect on promoting epidermal cell proliferation. Methods A phage display 7-mer peptide library was screened using monoclonal anti-human KGF antibody as the target. Enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was performed to select monoclonal phages with good binding activity. DNA sequencing was done to find the similarities of model peptides. Three-（4,5-dimethylthiazol-2-yl） -2,5-diphenyl tetrazolium bromide （MTT） assay, immunofluorescence assay and quantitative real-time PCR analysis were employed to evaluate the effect of the phage model peptides on epidermal cells. Results Thirty-three out of fifty-eight （56.9%） of the isolated monoclonal phages exhibited high binding activity by ELISA. Ten of fifteen obtained phage model peptides were similar to KGF or epidermal growth factor （EGF）. MTT assay data showed that four （No. 1-4） of the ten phage model peptides could promote epidermal cell proliferation. The expression of keratinocyte growth factor receptor （KGFR） mRNA in the KGF control group and the two phage model peptide groups （No. 1 and No. 2） increased. Expression of c-Fos mRNA and c-Jun mRNA in the KGF control group increased, but did not increase in the four phage model peptide groups （No.1-4）. Conclusion Four phage model peptides isolated from the phage display 7-mer peptide library can safely promote epidermal cell proliferation without tumorigenic effect.     

基于PCR技术的现代分子生物学操作在中药鉴定中的应用

全文着重介绍了以聚合酶链式反应（PCR）技术为支撑的现代分子生物学技术,包括随机扩增多态性DNA（RAPD）技术、ISSR—PCR技术、PCR—RFLP技术、mRNA差异显示技术、基因测序技术及基因芯片技术在中药鉴定中的应用,指出现代分子生物学技术的蓬勃兴起将极大地推动中药鉴定的发展。     

抗人卵巢癌单链抗体噬菌体表面呈现文库的构建、初步筛选及鉴定

目的：构建抗人卵巢癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现库。方法：利用噬菌体表面呈现技术，构建基因库。经过panning筛选富集后，用ELISA方法检验抗原结合活性。结果：从单个噬菌体克隆中筛选到26个具有抗原结合活性的阳性克隆。结论：噬菌体表面呈现技术为构建抗人卵巢癌全套单链抗体基因噬菌体表面呈现库提供了一条更为有效的新途径。     

Transforming growth factor-β1 phage model peptides isolated from a phage display 7-mer peptide library can inhibit the activity of keloid fibroblasts

Background Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) is known to have a role in keloid formation through the activation of fibroblasts and the acceleration of collagen deposition. The objective of this current study was to isolate TGF-β1 phage model peptides from a phage display 7-mer peptide library to evaluate their therapeutic effect on inhibiting the activity of keloid fibroblasts.Methods A phage display 7-mer peptide library was screened using monoclonal anti-human TGF-β1 as the target to obtain specific phages containing ectogenous model peptides similar to TGF-β1. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was performed to select monoclonal phages with good binding activity, which underwent DNA sequencing. MTT assay and apoptosis assessment were used to evaluate the biological effects of the phage model peptides on keloid fibroblasts. Immunofluorescence assay was employed to show the binding affinity of the model peptides on phages causing keloid fibroblasts. Quantitative real-time PCR analysis was carried out to detect the expressions of nuclear factor κB (NF-κB) mRNA, connective tissue growth factor (CTGF) mRNA and TGF-β receptor Ⅱ (TβRII) mRNA in keloid fibroblasts.Results Specific phages with good results of ELISA were beneficiated. Four phage model peptides were obtained. The data of MTT showed that TGF-β1 and one phage model peptide (No. 4) could promote keloid fibroblasts proliferation,however, three phage model peptides (No. 1-3) could inhibit keloid fibroblasts proliferation. The results of apoptosis assessment showed that the three phage model peptides could slightly induce the apoptosis in keloid fibroblasts. The data of immunofluorescence assay revealed that the model peptides on phages rather than phages could bind to keloid fibroblasts. The findings of quantitative real-time PCR analysis suggested that the expressions of NF-κB mRNA and CTGF mRNA in the three phage model peptide groups decreased, while the expression of TβRII mRNA slightly increased.Conclusions Three phage model peptides isolated from a phage display 7-mer peptide library can inhibit keloid fibroblasts proliferation and induce the apoptosis in keloid fibroblasts. They can inhibit the activity of keloid fibroblasts by blocking TGF-β1 binding to its receptor and then regulating the expressions of NF-κB, CTGF and TβRII.     

应用噬菌体展示技术筛选中药的药物靶点蛋白研究进展

噬菌体展示技术是一种有效的药物靶点筛选工具,可用其筛选中药的药物靶点蛋白。其原理是将外源性蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置,使外源基因随外壳蛋白的表达而表达。药物靶点是药物在体内的作用结合位点,是药物筛选和新药研究的基础,良好的药物靶点也是发现性质优良药物的基础。利用现代生物技术为基础的高通量药物筛选技术,进行中药活性组分筛选是实现中药现代化的有效途径,并促进我国天然药物的开发和应用,为中药的研究提供一套完整的筛选和验证方案。      

人源抗狂犬病毒免疫型抗体库的构建及特异性抗体筛选与鉴定

目的:利用噬菌体展示技术,构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,筛选特异性的抗狂犬病毒糖蛋白人源单链抗体(scFv)并对其进行初步鉴定。方法:从接种狂犬疫苗的志愿者外周血中提取总RNA,RT-PCR扩增VH和VL基因,并利用重叠扩增PCR将VH和VL拼接为scFv。将纯化后的scFv克隆至噬菌体载体pComb3XSS构建人源抗狂犬病毒单链抗体库,以狂犬病毒糖蛋白(RABVG)为抗原,从抗体库中筛选抗RABVG的scFv。通过phage-ELISA验证噬菌体单链抗体的结合特异性,将阳性克隆转化E.coliTOP10F′进行表达。结果:构建了人源抗狂犬病毒抗体库,抗体库的库容为3.29×109。经过5轮筛选,获得43株与RABVG特异结合的噬菌体单链抗体,其中15个A450值较高的克隆序列分析结果显示,有3个正确的单链抗体基因。单链抗体基因转化TOP10F′构建工程菌,表达纯化后的单链抗体,经ELISA检测能够与RABVG特异性结合。结论:从构建的人源免疫型抗狂犬病毒单链抗体库筛选出的能与RABVG特异性结合的scFv,为进一步制备抗RABVG的治疗性人源化抗体奠定了基础。     

利用噬菌体肽库技术筛选卵巢特异的VEGFR3亲和肽

目的从噬菌体12肽库中筛选VEGFR3胞外区蛋白高亲和肽作为卵巢癌淋巴管上皮细胞潜在靶向载体。方法用噬菌体展示固相结合法,生物淘选与扩增。经过4个循环的筛选,利用ELISA法鉴定噬菌体单克隆的亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体融合蛋白的DNA序列,竞争法ELISA检测优势克隆与靶蛋白的特异性。结果经过4轮筛选,噬菌体出现良好的富集,选择8个阳性克隆测序,经测序5个克隆插入短肽是(WHGSLKQNLWWY),竞争性ELISA显示其与VEGFR3具有良好的亲合性,并能被VEGF-D分子抑制。结论噬菌体12肽库筛选的VEGFR3高亲和多肽(WHGSLKQNLWWY),可望成为靶向载体构建的结构基础。