β分泌酶生物学特性的研究进展

β分泌酶是一种Ⅰ型跨膜蛋白,其在脑内的主要作用是从Met596和Asp597之间以及Tyr606和Glu607之间切割β淀粉样蛋白前体蛋白（β-amyloid precursor protein,APP）形成β淀粉样蛋白（β-amyloid protein,Aβ）的N端,以启动Aβ生成。β分泌酶包括多个成员,其中因天冬氨酸蛋白酶β-位淀粉样蛋白前体蛋白裂解酶1（β-site amyloid precursor protein-cleaving enzyme 1, BACE1）在阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease,AD）的发病机制中占有重要地位而研究较多。本文主要对BACE1的基因和蛋白结构、转录和翻译调控、胞内运输和调控、代谢及其调控、底物以及与其同源的酶进行综述,为以BACE1为靶点的药物研发提供借鉴。     

血小板淀粉样前体蛋白加工过程：1种阿尔茨海默病的生物标记物

脑内淀粉样前体蛋白（APP）通过下述两种途径进行加工：由β-分泌酶和γ-分泌酶介导的淀粉样通道产生Aβ（β-淀粉样蛋白4kDa）肽或由β-淀粉样蛋白区域的α-分泌酶介导产生非淀粉样产物。在31例阿尔茨海默病（AD）患者和10例年龄相匹配的健康对照受试者中，研究22kDa片段的血小板水平，上述片段包括Aβ（β-淀粉状蛋白4kDa）肽、β-分泌酶（BACE1）、α-分泌酶（ADAMl0）和120—130kDa到110kDa肽的APP异构体比。研究发现，与正常对照者相比，AD患者的Aβ4水平升高、BACE1活性增加、ADAM10活性和APP比降低。上述研究结果提示，与脑内APP的加工相同，血小板APP也是通过淀粉样和非淀粉样通道进行加工的，并且AD患者血小板APP的加工过程与对照者相比有所改变，这也许可以作为临床试验中诊断AD、病程和监测药物疗效的生物标记物。     

β-分泌酶研究

β-分泌酶（β-siteAPPcleavingenzyme,BACE）在β位点裂解β淀粉样蛋白前体蛋白（β-amyloid precurgor protein,APP）并产生β淀粉样蛋白（Amyloid protein,Aβ）,Aβ的聚集是形成阿尔茨海默病（Alzhemier’s disease,AD）患者脑中老年斑的主要原因,引起神经元损伤和认知功能减退,在AD的发病过程中起到中心和共同通道的作用。     

姜黄素调控β-分泌酶基因表达抑制老年性痴呆大鼠Aβ蛋白生成的机制

目的：探讨姜黄素对老年性痴呆（ Alzhelmer＇s disease,AD）大鼠海马区β-淀粉样前体蛋白（β-amyloid protein precursor,β-APP）和β-分泌酶（amyloidβ secretase1,BACE1）基因表达的影响。方法：采用Aβ1-40右侧海马区注射,制备AD大鼠模型,腹腔注射姜黄素给予治疗,采用ELISA法检测血清与海马组织中Aβ的含量,免疫组织化学法检测海马区神经元中β-APP蛋白表达,RT-PCR法检测海马组织中β-APP和BACE1 mRNA表达。结果：造模后大鼠血清和脑组织海马中Aβ含量显著升高,脑组织海马区神经元中β-APP蛋白表达、β-APP mRNA和BACE1 mRNA表达明显增加。与模型组比较,姜黄素高剂量组、低剂量组β-APP蛋白表达、β-APP mRNA和BACE1 mRNA明显降低,差异均有统计学意义（ P<0.05）。结论：姜黄素可通过对BACE1 mRNA调控作用,阻断β-APP裂解进程,抑制Aβ在脑内生成与沉积,从而减少Aβ对神经元的毒性作用。     

AZD3293治疗早期阿尔茨海默病获FDA快通道审批

阿斯利康和礼来公司宣布其治疗早期阿尔茨海默病（AD）药物AZD3293的Ⅲ期临床试验已获FDA快通道审批认可。临床研究显示，该药可减少AD患者和健康志愿者脑脊液中β-淀粉样蛋白（Aβ）。该药是口服β-分泌酶（BACE）抑制剂，BACE与Aβ的产生有关，抑制BACE可预防Aβ斑块的形成，有助于减缓或阻止AD的发展。除了继续Ⅱ/Ⅲ期临床AMARANTH试验外，该公司还宣布计划开始第2个该药治疗的Ⅲ期临床DAYBREAK-ALZ试验，研究其对轻度AD患者的安全性和疗效，2016年第3季度开始入选患者。     

短干扰RNA对人β淀粉样前体蛋白裂解酶基因表达的影响

目的探讨β淀粉样前体蛋白裂解酶（β-site APP cleaving enzyme,BACE）的短干扰RNA（short interfering RNAs,siRNA）对BACE在神经母细胞瘤细胞中的表达的影响,为阿尔茨海默病（AD）的治疗提供新的手段。方法采用PCR分别扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、U6启动子和靶向BACE的特异性小干扰RNA（siBACE）,随后将相应的序列片段克隆入真核表达载体pLXSN,通过限制性内切酶和测序对该重组表达载体pLXSN／EGFP-U6-siBACE进行鉴定;制备稳定高表达BACE基因的神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株,用荧光显微镜和免疫组织化学的方法观察siRNA对BACE表达的影响。结果限制性内切酶酶切和测序结果均表明成功构建了靶向BACE的短干扰RNA的逆转录病毒载体pLXSN／EGFP-U6-siBACE;并能特异性地抑制BACE在神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株中的表达。结论成功构建了针对BACE的短干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN／EGFP-U6-siBACE,并能有效抑制哺乳动物BACE基因的表达,该研究将为利用RNA干扰技术作为治疗AD的新方法提供重要的实验基础。     

短干扰RNA特异性抑制哺乳动物β淀粉样前体蛋白裂解酶基因表达

目的：探讨β淀粉样前体蛋白裂解酶（β-site APP cleaving enzyme，BACE）的短干扰RNA（short interfering RNAs，siRNA）是否能抑制BACE在哺乳动物细胞中的表达，为阿尔茨海默病（AD）的治疗提供新的手段。方法：采用PCR分别扩增增强型绿色荧光蛋白（EGFP）、U6启动子和靶向BACE的特异性小干扰RNA（siBACE），随后将相应的序列片段克隆入真核表达载体pLXSN，通过限制性内切酶和测序对该重组表达载体pLXSN／EGFP-U6-siBACE进行鉴定；制备稳定高表达BACE基因的神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株，用荧光显微镜和免疫组织化学的方法观察siRNA对BACE表达的影响。结果：成功构建了靶向BACE的短干扰RNA的逆转录病毒载体pLXSN／EGFP-U6-siBACE，并能特异性地抑制BACE在神经母细胞瘤SK-N-SH细胞株中的表达。结论：成功构建了针对BACE的短干扰RNA的逆转录病毒表达载体pLXSN／EGFP-U6-siBACE，并能有效抑制哺乳动物BACE基因的表达，为利用RNA干扰技术作为治疗AD的新方法提供了重要的实验基础。     

灌胃对老龄大鼠海马内APP裂解酶基因表达的影响

与阿尔茨海默病（AD）相关的酶主要是指淀粉样蛋白前体（β-amyloid precursor protein,APP）裂解酶,目前所知道的包括α-分泌酶（主要为a disintegrin and metalloproteinase（ADAM）10和ADAM17）、β-分泌酶（β-secretase,主要为BACE1）和γ-分泌酶（主要为presenilin1,PS1）.本研究对灌胃大鼠海马内所有的四个指标均进行了基因表达的检测。现将结果报告如下。     

β分泌酶在β-淀粉样蛋白代谢中作用的研究进展

大量的实验研究提示β-淀粉样蛋白（Aβ）在阿尔茨海默病（AD）的发病机理中起重要作用。老年斑（SP）是AD的两大病理改变之一，主要是由Aβ在脑中逐渐沉积所致。Aβ来源于I型跨膜蛋白淀粉样前体蛋白（APP）。目前已知有三种分泌酶参与APP的分解代谢，     

糖基化终末产物促SH-SY5Y细胞β-淀粉样蛋白生成及相关机制

目的通过研究糖基化终末产物(AGEs-BSA)对培养的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y细胞)β-淀粉样蛋白(Aβ)的生成,以及淀粉样前体蛋白(APP)及相关酶—β-分泌酶(BACE1)、γ-分泌酶(PS1)的表达的影响,在体外水平探讨AGEs-BSA在阿尔茨海默病(AD)发病中的作用及其可能的机制。方法以培养的SH-SY5Y细胞为模型,将细胞随机分为4组。用MTT实验得到的AGEs-BSA最佳干预时间及浓度干预细胞,用免疫细胞化学方法及ELISA方法观察及检测各组细胞内Aβ1-40、Aβ1-42表达,用免疫印迹法检测各组细胞内APP、BACE1、PS1变化。结果 BSA组与空白对照组相比APP、BACE1、PS1、Aβ的表达无明显差异(P>0.05);AGEs-BSA组与BSA组相比APP、BACE1、PS1、Aβ的表达明显增加(P<0.05);AGEs-BSA+抗RAGE中和抗体组APP、BACE1、PS1、Aβ的表达较单纯AGEs-BSA组明显减少(P<0.05),但仍高于BSA组(P<0.05)。结论 糖基化终末产物能够促使SH-SY5Y细胞中APP的表达增加,并通过上调BACE1、PS1的活性使Aβ生成增加。通过阻断其与特异性受体RAGE的结合可以部分减少APP、BACE1、PS1及Aβ的表达和生成。     

BACE1抑制剂分子水平高通量筛选体系的建立

目的 建立体外分子水平β?鄄分泌酶（BACE1）抑制剂高通量筛选体系。方法 采用均相时间分辨荧光法（HTRF）,通过优化反应时间、酶浓度、检测仪器等实验条件,建立BACE1抑制剂高通量筛选体系,根据待测样品对BACE1活性抑制程度筛选其抑制剂。结果 采用HTRF法建立了BACE1抑制剂高通量筛选体系,其中反应时间确定为6 h、BACE1浓度为670 U/L,采用VICTOR3酶标仪测得信噪比为649.6,信背比为44.6,Z′因子为0.91,变异系数小于10%,并筛选到一系列IC₅₀小于10^-6 mol/L的化合物。结论 采用HTRF法建立的BACE1抑制剂筛选体系灵敏度高、特异性和稳定性好,可用于BACE1抑制剂的高通量筛选。     

姜黄素通过激活PPARγ和抑制BACE1减少神经细胞内β淀粉样蛋白的产生

目的:本课题旨在研究姜黄素处理体外培养的神经细胞后BACE1、PPARγ及Aβ40和Aβ42的变化,探讨其抑制β淀粉样蛋白作用的可能机制.方法:通过LipofectaminTM2000将质粒APPswe与BACE1-mychis瞬时共转染入SHSY5Y细胞,然后用姜黄素分浓度组与时间组处理细胞,通过RT-PCR测定BACE1及PPARγ的mRNA水平;通过Western Blotting检测BACE1及PPARγ的蛋白表达;通过ELISA检测Aβ40和Aβ的变化.结果:RT-PCR及Western blot结果显示转染细胞经姜黄素处理后BACE1的mRNA及蛋白表达水平显著减少,呈浓度和时间依赖性(P<0.05);而PPARγ的mRNA及蛋白表达水平增加,也呈浓度和时间依赖性(P<0.05).ELISA结果显示Aβ40和Aβ42的产生随处理浓度及时间的增加显著降低(P<0.05).结论:姜黄素可显著抑制体外培养的神经元中Aβ40和Aβ42的产生,且该作用与其激活PPARγ和抑制BACE1密切相关.     

TREM2: A Novel Potential Biomarker of Alzheimer's Disease

Alzheimer's disease (AD) is the most common type of neurodegenerative dementia worldwide[1]. Deposition of extracellular amyloid protein β (Aβ)-producing amyloid plaques and intracellular tau aggregation-comprising neurofibrillary tangles are two typical pathological features of this disease. Patients progress from mild cognitive impairment (MCI) to dementia of the Alzheimer type (DAT) typically within approximately five years[1]. There is a growing belief that AD is a heterogeneous disease affected by numerous factors, including age, genetic factors, and environmental factors. Although abundant research has been performed, effective prevention and treatment strategies for AD have yet to be developed[2]. Therefore, it is urgent to identify biomarkers of AD for early diagnosis.     

胰岛素抵抗大鼠脑组织APP代谢及其相关酶的表达及吡格列酮的干预效果

目的观察胰岛素抵抗（IR）大鼠脑组织β 淀粉样蛋白（Aβ）、淀粉样前体蛋白（APP）及其代谢相关酶的表达及吡格列酮(PIO)的干预效果。方法从45只Wistar大鼠中随机选取10只作为对照组（NC组）,35只给予10%果糖水诱发胰岛素抵抗,4周后根据胰岛素抵抗指数（IRI）,将制作成功的胰岛素抵抗模型26只大鼠随机分为IR组、PIO组。PIO组灌服吡格列酮（10?mg·kg-1·d-1）12周,IR组和NC组给予相同体积的生理盐水。免疫组化法观察大鼠海马Aβ42的表达;免疫印迹法检测大鼠脑APP、β 分泌酶( BACE1)、γ 分泌酶（PS1）的变化。结果IR组和PIO组大鼠海马Aβ42的表达明显高于NC组,与IR组相比,PIO组表达明显减低（P<0.01）;与NC组相比,IR组和PIO组大鼠脑组织APP、BACE1及PS1的表达增高,PIO组表达较IR组减少(P<0.05)。 结论胰岛素抵抗大鼠脑组织通过上调BACE1、PS1活性,使Aβ42生成增加;吡格列酮能抑制BACE1、PS1的表达,减少Aβ42生成。     

早老蛋白1功能缺失性突变导致家族性阿尔茨海默病的研究进展

阿尔茨海默病（AD）是一种衰老相关的神经退行性疾病,主要病理特征是大脑中存在异常聚集的β淀粉样蛋白（Aβ）。AD可分为家族性和散发性,其中早老蛋白1（PS1）是家族性AD最主要的风险基因,PS1突变占已知致家族性AD突变的80%以上。PS1是构成γ-分泌酶的催化亚基,后者负责加工Aβ前体蛋白（APP）生成Aβ。虽然新型PS1突变日渐被报道,但其诱发家族性AD的分子机制仍无定论。由于90%的PS1突变降低γ-分泌酶活性,学术界提出了PS1功能缺失性突变假说,认为PS1突变通过显性负效应导致PS1功能下降或缺失是诱发家族性AD的关键。近年,大量实验研究支持了该假说。首先,PS1功能缺失性突变通过干扰γ-分泌酶在APP上的切割位点促进长链Aβ生成,进而增加Aβ₄₂/Aβ₄₀比率;其次,PS1功能缺失性突变可破坏神经细胞内质网中的钙离子稳态以及通过阻断神经细胞自噬活性导致APP加工产物的异常聚集;再者,PS1功能缺失性突变可通过干扰神经元的内吞和转胞吞作用诱发神经元萎缩以及通过激活神经免疫细胞（星形胶质细胞和小胶质细胞）增强神经炎症;最后,PS1功能缺失性突变降低糖酵解和乳酸输出,破坏机体对神经元的能量供应。本文总结了PS1功能缺失性突变诱发家族性AD的分子机制,并对今后潜在的研究方向进行了探讨。     

M1受体激动剂介导的神经保护作用机制

阿尔茨海默病(AD)是老年期常见的一类慢性、进行性神经细胞退行性病变。应用毒蕈碱M1受体激动剂是治疗AD的策略之一。M1受体激动剂可通过对抗淀粉样β蛋白产生的神经毒性，减少tau蛋白的过度磷酸化，产生神经生长因子样作用，以及缩短后超极化时程等机制而产生神经保护作用。     

淀粉样前体蛋白在阿尔茨海默病分子生物学和临床医学中的研究进展

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种常见的老年性痴呆症,主要病理表现有两种,即:细胞内发生神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)、细胞外产生淀粉样沉积物(俗称老年斑,senile plaques,SP).NFTs的聚集主要是微管Tau蛋白异常高度磷酸化的生成;SP的淀粉样沉积物主要成份是β-淀粉样肽(Aβ,包括Aβ40和Aβ42),由淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)分解而来,被认为在AD的发病机制中起着十分重要的作用.近年来很多研究都集中在α、β和γ-分泌酶对APP的作用和Aβ生成的影响上,以及家族性AD(FAD)和散发性AD(SAD)的发病原因和进程的研究.本文主要综述了APP的代谢通路与淀粉样物生成对AD发病的假说;早发性和迟发性AD与APP、PS1、PS2和ApoE基因突变的关系,以及目前Aβ疫苗对AD治疗和预防作用的研究进展.     

β-Secretase inhibitor increases amyloid-β precursor protein level in rat brain cortical primary neurons induced by okadaic acid

Background Senile plaques and neurofibrillary tangles (NFTs) represent two of the major histopathological hallmarks of Alzheimer’s disease (AD). The plaques are primarily composed of aggregated amyloid β (Aβ) peptides. The processing of amyloid-β precursor protein (AβPP) in okadaic acid (OA)-induced tau phosphorylation primary neurons was studied.Methods Primary cultures of rat brain cortical neurons were treated with OA and β-secretase inhibitor. Neurons’ viability was measured. AβPP processing was examined by immunocytochemistry and Western blotting with specific antibodies against the AβPP-N-terminus (NT) and AβPP-C-terminus (CT). Results Ten nmol/L OA had a time-dependent suppression effect on primary neurons’ viability. The suppression effect was alleviated markedly by pretreatment with β-secretase inhibitor. After OA treatment, both AβPP and β-C-terminal fragment (βCTF) were significantly increased in neurons. AβPP level was increased further in neurons pretreated with β-secretase inhibitor.Conclusions In OA-induced tau phosphorylation cell model, inhibition of β-secretase may protect neurons from death induced by OA. Because of increased accumulation of AβPP in neurons after OA treatment, more AβPP turns to be cleaved by β-secretase, producing neurotoxic βCTF. As a potential effective therapeutic target, β-secretase is worth investigating further.     

产前应激加剧慢性子代应激诱导的子鼠学习记忆能力损伤

目的探讨产前应激是否进一步加剧慢性应激所致的6月龄雄性APPswe/PS1dE9子鼠学习记忆损伤及其可能机制。方法以 APPswe/PS1dE9双转基因小鼠为研究对象,实验分为产前慢性应激-子代慢性应激组( TT组)、产前慢性应激-子代正常处理组( TC组)、产前正常处理-子代慢性应激组( CT组)和产前正常处理-子代正常处理组( CC组)。应用Morris水迷宫检测子代小鼠的空间学习、记忆能力,通过HE染色观察小鼠海马CA3区神经元的病理组织形态,采用Congo red染色检查小鼠脑组织的淀粉样斑块,采用 Western blot 法检测小鼠海马组织淀粉样前体蛋白(APP)、淀粉样前体蛋白β位点分裂酶1(BACE1)和β-淀粉样蛋白1-42( Aβ42)的表达量,运用ELISA法检测血清皮质酮含量。结果与CC组相比, CT组小鼠的逃避潜伏期
　　和游泳距离延长(P<0．05),平台象限游泳时间和穿越平台次数减少(P<0．05);海马CA3区损伤的神经元数目明显增加(P<0．05),排列疏松紊乱,脱失现象明显,核固缩、浓染;脑组织淀粉样斑块数目增多;海马组织APP、BACE1和Aβ42的表达量升高( P <0．05);血清皮质酮浓度升高(P<0．05)。与CT组相比, TT组小鼠的逃避潜伏期和游泳距离进一步延长(P<0．05),平台象限游泳时间和穿越平台次数进一步减少( P <0．05);脑组织淀粉样斑块和海马CA3区损伤的神经元数目进一步增加(P<0．05);海马组织APP、BACE1和Aβ42的表达量和血清皮质酮浓度进一步升高(P<0．05)。结论产前应激进一步加剧慢性应激所致的子鼠学习记忆损伤,其机制可能与其升高小鼠血清皮质酮水平,促进APP和BACE1表达,进而增加Aβ42的生成,最终引起海马CA3区神经元损伤有关。