新生大鼠嗅球嗅鞘细胞的纯化方法研究

目的 探讨新生大鼠嗅球嗅鞘细胞（OECs）的体外培养和纯化方法，为研究脊髓损伤后神经再生获得丰富OECs来源奠定基础。方法 用原代培养的方法分离、培养新生大鼠嗅球OECs，比较p75抗体吸附、阿糖胞苷抑制、差速贴壁三种方法的纯化效果，根据GFAP免疫细胞化学染色结果统计所得OECs的纯度，同时在相差显微镜下对不同培养时期的OECs的形态进行观察。结果 体外培养的新生大鼠嗅球OECs主要为双极或三级细胞，其突起细长。未经纯化的OECs则成纤维细胞生长迅速而占优势，三种纯化方法均能使接种14d后的OECs纯度均值大于75％。p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法的纯化率均值略高于差速贴壁法。结论 新生大鼠嗅球OECS的原代培养中细胞纯化是必要的；在脊髓损伤再生研究中，较之p75抗体吸附法和阿糖胞苷抑制法，差速贴壁法是一种简单、经济、实用的OECs纯化方法。     

胎鼠嗅球分离培养出神经干细胞的研究

目的研究胎鼠嗅球中分离培养产生神经千细胞(NSCs)的情况。方法取孕16～18d的孕鼠。取胎鼠的嗅球,用含10％FCS的培养基培养传代分离出的细胞。免疫细胞化学方法鉴定培养和传代出的细胞,对染色阳性的细胞计数检测纯度。结果P^75染色阳性证明分离培养的细胞为嗅鞘细胞(OECs)；来源于嗅球的细胞培养出的神经球行NeS血染色阳性证明为NSCs；传代OECs纯度为95%-98％。结论胎鼠嗅球中可分离培养出NSCs,OECs可稳定传代。可以作为移植用的种子细胞。     

成年大鼠嗅球成鞘细胞的分离培养及形态学研究

目的：探讨大鼠嗅球成鞘细胞(olfactory ensheathing cells OECs)的分离培养方法并观察其形态。方法：采用差时贴壁和阿糖胞苷(Ara—c)抑制相结合的方法培养嗅鞘细胞,并在不同阶段进行观察和行NGFRp75和GFAP免疫组化染色鉴定。结果：成功培养出高纯度的嗅鞘细胞,胞体呈梭形、多突起形及油煎蛋形3种类型,突起细长编织成网状。结论：差时贴壁和Ara—c抑制相结合的纯化培养方法是一种简单而又有实效的嗅鞘细胞培养方法。     

成年大鼠嗅球嗅鞘细胞的分离、培养、纯化与生物学特性的研究

目的探讨成年大鼠嗅球嗅鞘细胞（OECs）的分离、培养和纯化方法,并观察其形态学变化及免疫细胞化学特性。方法采用原代培养技术,从成年大鼠的嗅球分离培养OECs,用差速贴壁＋Thy1.1抗体及补体等方法纯化培养OECs,并用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）扩增OECs,倒置相差显微镜下观察OECs的形态变化特点及生长情况,采用GFAP、NGFRp75、S100等抗体行免疫细胞化学染色,根据NGFRp75免疫细胞化学染色结果统计培养的OECs的纯度,并计算OECs的增殖率。结果体外培养的成年大鼠OECs主要为双极或三极细胞,其突起细长。差速贴壁＋Thy1.1抗体及补体纯化法的纯化效率高于其他两种。免疫细胞化学染色显示,培养的成年大鼠OECs呈现GFAP、NGFRp75、S100蛋白染色阳性。bFGF能明显促进OECs的增殖（P〈0.01）,对OECs的形态、纯度没有明显影响。结论差速贴壁＋Thy1.1抗体及补体纯化法是一种高效率的纯化培养OECs的方法,bFGF能明显促进OECs的增殖。     

嗅球成鞘细胞的培养纯化及与功能相关的形态学研究

目的 培养纯化嗅球成鞘细胞(Olfactory ensheathing cells，OECs)并对其进行免疫细胞化学研究，探讨其相关功能。方法 分离嗅球嗅神经纤维层获得嗅球成鞘细胞，采用免疫溶解法对培养的嗅球成鞘细胞进行纯化，并利用免疫细胞化学方法和电镜技术进行形态学观察。结果 通过纯化可以使培养的OECs纯度达95％以上，免疫细胞化学显示OECs表达P75NGFr、GAP43、N—CAM和GFAP；电镜结果显示OECs呈分叶状核，胞浆电子致密，胞膜有伪足样皱褶。结论 免疫溶解法可以较好的纯化OECs并保持其良好的生长状态，培养的OECs表达P75NGFr、GAP43、N-CAM可能与其促进轴突再生的功能相关。     

大鼠嗅黏膜和嗅球嗅鞘细胞体外分离培养比较

目的:比较大鼠嗅黏膜(olfactory mucosa,OM)和嗅球(olfactory bulb,OB)的嗅鞘细胞(olfactory ensheathingcells,OECs)在体外分离培养中增殖和分化以及生物学特性的差异。方法:取SD大鼠OM和OB用差速贴壁法在体外分离培养OECs,扫描电镜观察两组OECs的形态,并用S-100和p75NGFR免疫荧光抗体双标记检测两组OECs在体外增殖和分化的情况。结果:扫描电镜观察到OM OECs以双极样为主;OB OECs有双极样、三极样和扁圆形3种形态,其中以双极样为主。免疫荧光双标结果显示:OM和OB组均有较多的S-100和p75NGFR双标阳性细胞,OM OECs胞体多为梭形,突起细长;OB OECs的形态多样,有双极样、三极样和扁圆形,胞体呈长梭形、圆形或三角形。两组OECs胞体面积和细胞周长相比较差异均无统计学意义。结论:OM OECs与OB OECs一样都能在体外分离培养与增殖。OM OECs与OB OECs分化成熟后的细胞无明显差异。     

不同纯化方法体外培养人胚嗅球嗅鞘细胞

目的 采用不同纯化方法原代培养人胚嗅球嗅鞘细胞(OECs),探讨简单实用可获得高纯度人胚嗅球OECs的体外培养方法.方法 以差速贴壁法为基础结合阿糖胞苷法、无血清饥饿法和问断神经营养因子3(NT3)法纯化培养人胚嗅球OECs.观察不同纯化方法下OECs生长变化,采用免疫细胞化学染色进行纯度鉴定.结果 体外培养的人胚嗅球OECs为双极、三极细胞.细胞突起细长,并可形成细胞突起网络.差速贴壁法培养3～6 d时纯度约为88%,以后成纤维细胞增殖,OECs纯度迅速下降.无血清饥饿法培养3～6 d时OECs纯度约为90%,但细胞状态差.间断NT3法培养3～9 d时OECs纯度约为95%,且细胞状态良好.经统计学处理,第6 d后差速贴壁 间断应用NT2法优于其他方法,细胞纯度的差异有统计学意义(P<0.05).结论 差速贴壁结合同断NT3法可获得高纯度状态良好的OECs,是一种简单实用的OECs纯化培养方法 .     

嗅鞘细胞的研究现状

嗅鞘细胞(OECs)直接起源于嗅基板,分布在嗅上皮、嗅神经和嗅球的第一、二层. 体外培养时,嗅鞘细胞按其形态可分为:梭形、多突起形、油煎蛋形.嗅球浅2层细胞存在以上三种形态,其中以梭形细胞最多.嗅黏膜细胞则以梭形细胞更为多见,并具更细长的突起.     

大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分裂增殖和免疫细胞化学特性

目的:体外培养大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞(olfactoryensheathingcells,OECs),观察其形态、分裂增殖和免疫细胞化学特性,探索自体嗅黏膜嗅鞘细胞作为OECs来源的可能性。方法:采用差时贴壁的方法分离培养成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞,相差显微镜下观察细胞形态和分裂增殖;用免疫组化方法观察GFAP、NGFRp75、S鄄100、NGF、BDNF、NT鄄3的表达。结果:培养的细胞根据形态来分,可分为双极、多极和偏平状;细胞分裂时先回缩成球形,分裂成两个子球,再伸出突起,变成梭形或多极形。GFAP、NGFRp75、S鄄100、BDNF和NT鄄3表达阳性。结论:在含血清培养基上,大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞能正常分裂增殖和分泌神经营养因子。     

大鼠嗅成鞘细胞培养不同分离方法对纯度的影响

目的通过对多种分离方法的比较获得较为理想的嗅成鞘细胞的分离措施。方法应用3种不同分离方法各取12份样本,对同一条件下培养10d的细胞纯度进行p75NGFR免疫细胞化学测定及统计分析;结果(1)3种不同分离方法取材平均活细胞率:传统分离法(组)为84.52%,直接挤压法(组)为97.33%,机械过滤法(组)为83.97%,直接挤压(组)法分散后的OECs活细胞数量最多(P<0.05);(2)3种分离方法取材、培养所获得的OECs纯度:传统分离法(组)为67.58%,直接挤压法(组)为91.23%,机械过滤法(组)为63.51%;直接挤压法(组)培养细胞纯度最高(P<0.05)。结论嗅成鞘细胞最佳分离措施为直接挤压法,应用直接挤压法可收获大量嗅成鞘细胞,对OECs进一步的基础研究以及将来的临床应用奠定了基础。     

嗅鞘细胞培养上清胶质源性神经生长因子含量的测定

目的观察嗅鞘细胞培养上清胶质源性神经生长因子(GDNF)的含量随培养时间的变化关系，为选择嗅鞘细胞移植的最佳时间提供理论依据。方法采用差速贴壁纯化培养方法培养嗅球及嗅粘膜嗅鞘细胞，培养21天，3天留取标本一次，采用ELISA法对上清GDNF进行测定。结果GDNF的含量随培养时间的延长逐渐升高，但绝对含量很低。结论培养的嗅鞘细胞能分泌GDNF，细胞移植在14天以后为宜。     

新生大鼠嗅鞘细胞的原代培养及形态学观察

目的探讨新生大鼠嗅鞘细胞的原代培养及纯化方法，并对其形态学特征进行观察。方法分离培养新生大鼠嗅球中的嗅鞘细胞，联合应用差速贴壁法和阿糖胞苷抑制法进行纯化，NGFRp^75免疫组化染色鉴定细胞。结果可获得较高纯度的嗅鞘细胞，其形态主要为双极、多极和无突起的“油煎蛋”形，细胞突起细长并交织成网状。结论该方法步骤简便，可重复性好，具有较高的实用价值。     

新生大鼠嗅鞘细胞在再生丝素膜上的生长

目的 观察新生大鼠嗅鞘细胞在再生丝素膜上的生长情况，探讨再生丝素膜在嗅鞘细胞移植修复脊髓损伤中成为细胞培养基质的可能性。方法 采用静置贴壁培养法体外培养分离的新生大鼠嗅鞘细胞，免疫酶和免疫荧光方法染色鉴定，观察在再生丝素膜上嗅鞘细胞的生长，并用MTT法测定细胞生长曲线。结果 再生丝素膜对新生大鼠嗅鞘细胞的贴壁能力和形态未见明显改变，也未见明显毒性，并能支持细胞正常生长，呈现正常的生长繁殖曲线。结论 再生丝素膜对新生大鼠嗅鞘细咆具有良好的细胞相容性。     

成年大鼠嗅黏膜嗅鞘细胞的分离、培养、鉴定与纯化

目的:探讨嗅黏膜中嗅鞘细胞的培养方法.方法:取成年大鼠嗅黏膜,采用差速贴壁法获得较高纯度的嗅鞘细胞,并采用免疫荧光法进行鉴定与形态学观察.结果:通过差速贴壁法纯化,可获得纯度约为80%的嗅鞘细胞,并通过GFAP免疫荧光及P75和hoechst双重免疫荧光鉴定;相差显微镜下细胞形态以梭形、双极及三极细胞为主,有少量的多极细胞.结论:从成年大鼠嗅黏膜中成功分离培养出嗅鞘细胞,为从人鼻腔嗅黏膜中培养嗅鞘细胞提供重要的依据.     

嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑出血的实验研究

目的：嗅鞘细胞移植入大鼠脑出血模型后,观察偏瘫大鼠功能恢复以及移植细胞后30 d内的形态学变化。方法：差速贴壁法培养出高纯度的嗅鞘细胞,制作38只大鼠脑出血模型,分三组：第1组10只为空白组,第2组10只为HBSS移植组,第3组18只为嗅鞘细胞移植组;三组大鼠分别在术后3 d、7 d、14 d和30 d用forelimb placing方法进行评分,判断嗅鞘细胞移植治疗大鼠脑出血模型的作用。结果：hoechst示踪及电镜观察结果,均证实嗅鞘细胞能在大鼠体内存活;对三组大鼠进行评分,嗅鞘细胞移植组的功能恢复明显优于其他两组。结论：从成年大鼠嗅黏膜用差速贴壁法能成功培养出嗅鞘细胞,并用于细胞移植,移植细胞能存活;嗅鞘细胞移植能改善大鼠脑出血后偏瘫肢体的功能。     

新生大鼠嗅鞘细胞的体外培养和纯化

目的建立一种可行的体外培养和纯化嗅鞘细胞（OECs）的方法.方法利用显微外科技术,从新生大鼠脑中取出嗅球的嗅神经组织,去除脑膜和微血管,消化后细胞接种在含有10%的DMEM/F12（1：1）培养液中于体外进行培养,应用含血小板凝集抑制素、牛垂体提取液的DMEM/F12培养液,将这些细胞接种于p75包被的培养皿中纯化培养.用P75抗体免疫组织化学染色鉴定OECs,计算纯化度.结果OECs的外形主要以突起细长的双极和三极为主,随时间延长细胞生长排列呈现一定方向性.P75抗体免疫组化呈阳性.此方法获得的OECs纯度可达90%以上.结论本研究所建立的培养方法可行,适宜从新生大鼠中获得嗅鞘细胞.     

低氧诱导的大鼠嗅黏膜来源嗅鞘细胞自噬及其对细胞增殖能力的影响

目的: 探讨低氧诱导SD新生鼠嗅黏膜来源嗅鞘细胞(OECs)自噬的发生,分析自噬对细胞增殖能力的影响。方法: 采用酶消化法和改良的Nash差速贴壁法分离提纯培养SD新生鼠嗅黏膜来源OECs,利用免疫荧光法鉴定细胞属性和纯度。以低氧条件(氧浓度为2％)培养的SD新生鼠嗅黏膜来源OECs作为低氧处理组,以正常条件下培养的OECs作为对照组,采用自噬抑制剂3-MA处理后的OECs继续在低氧条件下培养作为3-MA低氧处理组。相差显微镜下观察各组细胞形态;Western blotting法检测对照组、4h低氧处理组和8h低氧处理组OECs中低氧诱导因子1α(HIF-1α)、自噬标志蛋白LC3Ⅰ/Ⅱ和自噬标志基因Beclin-1的蛋白表达水平;采用CCK-8法检测对照组、3-MA低氧处理组、低氧处理组和3-MA低氧处理组OECs的增殖能力。结果: 在对照组、低氧处理组和3-MA低氧处理组经分离提纯的OECs均呈梭形,表现为典型的双极、三极细胞形态,3组间无明显差异。OECs呈NGFRp75和GFAP阳性,纯度为87%;与对照组比较,低氧处理组OECs中HIF-1α表达水平升高(P<0.05),LC3Ⅰ/Ⅱ和Beclin-1表达水平升高(P<0.05);与低氧处理组比较,3-MA低氧处理组OECs增殖能力降低。结论: 低氧诱导的自噬可降低SD新生鼠嗅黏膜来源OECs的增殖能力。