大鼠骨髓内皮祖细胞的体外扩增培养

目的探讨建立体外培养内皮祖细胞（EPC）的方法。方法通过密度梯度分离法从大鼠骨髓中分离单个核细胞,培养7 d后,行Dil-acLDL和FITC-UEA-1双荧光染色,并行流式细胞检测及细胞迁移实验。结果细胞培养7 d后,可见梭形细胞呈优势生长,Dil-acLDL与FITC-UEA-1荧光标记的双阳性细胞占细胞总数的比例为82.7%±5.1,培养第10天开始出现铺路石样细胞集落,培养后第7、14天CD34阳性细胞所占的比例分别为（32.3±3.2）%、（39.2±4.4）%（t=5.18,P〈0.01）,FLK-1阳性细胞所占的比例分别为（28.7±3.2）%、（44.5±3.8）%（t=5.32,P〈0.01）。培养7 d后迁移至膜下层的EPC数为（10.4±1.9）个,培养14 d后迁移至膜下层的EPC数为（11.8±2.5）个（t=0.83,P〉0.05）。结论分离大鼠骨髓单个核细胞,用选择性内皮生长体系培养EPC,再通过细胞免疫及细胞功能检测所分离的细胞,是一种较为良好的分离与鉴定EPC的方法。     

神经干细胞诱导分化成多巴胺能神经元的时间效应

目的 探讨培养于诱导分化液中不同时间的大鼠神经干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元的效应.方法 大鼠神经干细胞球在含有细胞因子IL-1、IL-11、GDNF和LIF的诱导分化液中分别培养2、4、6、8的10 d后,流式细胞仪检测其体外诱导分化成多巴胺能神经元的分化率.结果 在诱导分化液中大鼠神经干细胞球呈贴壁生长,球形结构开始塌陷,球内细胞从球体中央逐渐向四周分化扩展出较多形态各异的细胞,多数细胞有1、2个长突起或有多个短突起.免疫组织化学显示分化的细胞中含有TH阳性细胞,流式细胞仪检测诱导分化2、4、6、8和10 d的神经球分化成TH阳性细胞比率分别为(3.2%±0.9%)、(6.8%±1.6%)、(16.7%±2.6%)、(14.8%±1.8%)和(12.2%±2.5%).结论 大鼠神经干细胞体外诱导分化成多巴胺能神经元存在着分化的时间效应,诱导分化6d的神经干细胞分化成多巴胺能神经元的比率最高.     

大鼠骨髓细胞体外诱导分化神经细胞的演变规律

【目的】摸索从全骨髓诱导培养分化神经细胞的方法，并从神经巢蛋白(nestin)和神经核蛋白(NeuN)两种标记物上观察其分化的演变规律。【方法】抽取sD大鼠骨髓做全骨髓细胞培养，采用免疫细胞化学和荧光激活细胞计数仪(FACS)追踪由骨髓到神经元样细胞不同阶段nestin和NeuN的表达趋势，给予定性、定量分析。【结果】免疫细胞化学检测，细胞培养5d时对上述抗体呈弱阳性，逐渐增强，培养第15天细胞呈典型nestin强阳性反应，而NeuN强阳性反应在25～30d达到高峰，发育成为神经元样细胞。FACS同步追踪显示了nestin和NeuN在培养第5天时即有表达，前者3．4％，后者2．5％。随着骨髓细胞的分化，在15d时nestin阳性细胞为22．7％，达到高峰，随后下降。NeuN于30d达到高峰为41．2％，而此时nestin阳性细胞为5．9％。【结论】从神经干细胞和神经细胞特征性标记物演变探知骨髓细胞的分化发育规律；骨髓细胞可分化为神经细胞；骨髓源性神经前体细胞早期亦有nestin和NeuN的表达。     

小鼠间充质祖细胞向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的:体外培养C57小鼠密质骨碎片来源的间充质祖细胞(Mesenchymal progenitor cells,MPC),探讨MPC体外向神经元样细胞定向诱导分化的可行性.方法:取C57小鼠后肢长骨,剪成骨碎片,经Ⅱ型胶原酶消化后体外培养MPC,流式细胞术检测鉴定其免疫学表型.取生长良好的第三代MPC,神经元原代培养上清液定向诱导,对诱导后的MPC,以神经元特异性标志物神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase,NSE)及神经丝蛋白(Neurofilament protein,NF)为对照,应用免疫细胞化学染色法,检测神经元标志物的表达.结果:成功培养原代MPC,传代后生长良好,流式细胞术检测CD29、CD44组阳性率与其同型对照组相比有明显差异(P＜0.05).经神经元原代培养上清液诱导后,MPC可表达神经元特异性标志物NSE及NF.结论:从小鼠密质骨碎片分离培养出的间充质祖细胞获得率高,并可诱导分化为神经元样细胞.     

纹状体组织块诱导胚胎干细胞定向分化的实验研究

目的：探讨由胚胎干细胞向多巴胺能神经元方向分化的最佳诱导条件。方法：本实验采用纹状体组织炔与胚胎干细胞联合培养的方法，通过形态学观察和酪氨酸羟化酶(TH)免疫细胞化学染色对分化细胞进行鉴定。结果：14％左右的胚胎干细胞诱导分化为多巴胺能神经元，而且分化神经元具有投射神经元的典型特征。结论：纹状体组织炔不仅能诱导胚胎干细胞向多巴胺能神经元方向分化，还可影响轴突和／或树突的投射方向和分支模式。     

新生大鼠大脑皮质O-2A祖细胞的体外诱导分化

目的 :探索新生大鼠大脑皮质O -2A祖细胞的体外分离纯化的培养条件 ,并观察其在体外增殖、分化的规律 ;鉴定体外培养的O -2A祖细胞、2型星形胶质细胞及少突胶质细胞。方法 :根据 1型星形胶质细胞、O -2A祖细胞的生长时间差异及细胞的粘附特性不同 ,采用振荡法和差速贴壁法 ,并结合使用生长因子 (PDGF ,bFGF )刺激O -2A祖细胞增殖 ,从而分离纯化、扩增O -2A祖细胞 ;观察O -2A祖细胞在有血清 (D/F + 2 0 %FCS)和无血清 (CDM )培养条件下的分化情况。免疫细胞化学法鉴定O -2A祖细胞(A2B5 )和分化成熟的 2型星形胶质细胞 (GFAP ,A2B5 )及少突胶质细胞 (CNPase)。结果 :①分离纯化的O -2A祖细胞胞体呈椭圆形 ,具有典型的双极或三极突起 ;经免疫细胞化学染色鉴定 ,A2B5抗体标记阳性 ,细胞纯度达 95 % ;②应用有血清的培养基诱导O -2A祖细胞定向分化为 2型星形胶质细胞 ,2型星形胶质细胞的胞体较大 ,突起多而细长 ,GFAP和A2B5抗体标记均为阳性 ;③应用无血清的化学条件培养基诱导O -2A祖细胞定向分化为少突胶质细胞 ,少突胶质细胞的胞体小 ,突起短而细 ,相互交织呈“蜘蛛网”样 ,CNPase抗体标记阳性。结论 :①采用振荡法和差速贴壁法 ,并结合使用生长因子 ,建立了分离纯化O -2A祖细胞的方法 ;②分离纯化的O -2A     

胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展

自1981年英国的Evans等和美国的Martini21相继从小鼠囊胚的内细胞团分离建立胚胎干细胞系以来，胚胎干细胞体外诱导分化的研究就一直是各国学者感兴趣的课题。目前，已从胚胎干细胞体外诱导出卵黄囊、血岛、神经细胞、心肌细胞、血管和内皮等结构及细胞。利用胚胎干细胞体外诱导分化的成果可望发展出治疗多种疾病的新方法，将在人体早期发育、基因功能、药物开发、细胞治疗和组织器官替代治疗中发挥重要作用，并成为组织器官移植的新资源。[第一段]     

胚胎干细胞体外诱导分化的研究进展

自1981年英国的Evans等[1]和美国的Martin[2]相继从小鼠囊胚的内细胞团分离建立胚胎干细胞系以来,胚胎干细胞体外诱导分化的研究就一直是各国学者感兴趣的课题。目前,已从胚胎干细胞体外诱导出卵黄囊、血岛、神经细胞、心     

人循环内皮祖细胞的分离培养和诱导分化

目的研究人循环内皮祖细胞（EPCs）分离、培养、分化及鉴定。方法采用Ficoll密度梯度离心法从人外周血中分离单个核细胞,接种于含血管内皮生长因子（VEGF）及优质胎牛血清的M199培养液中,对其进行体外诱导分化培养,以免疫组化、细胞荧光化学法及流式细胞检测法鉴定贴壁细胞的内皮细胞特异性标志。结果人外周血单个核细胞（MNCs）经体外培养,表达内皮细胞的特异性抗原,包括VWF、CD31和CD34,并显示出能内吞乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）,结合UE小1等内皮细胞特性,提示这些细胞具有内皮细胞的表面蛋白特性和具有内皮细胞功能。结论人外周血中存在具有分化增殖能力的EPCs,在一定培养条件下可分化为血管内皮细胞。     

GDNF和IL-1β体外诱导中脑神经干细胞分化的实验研究

目的探索胶质源性神经营养因子（GDNF）和白细胞介素1β（IL-1β）在体外诱导小鼠胚胎中脑神经干细胞（M-NSCs）分化成多巴胺能神经元的培养方法,为M-NSCs移植治疗帕金森病（PD）提供实验依据。方法在有血清条件下体外培养鼠胚M-NSCs,予以GDNF和IL-1β作诱导分化。TH免疫细胞化学鉴定,流式细胞术检测TH阳性神经元的百分率。结果实验组促进M-NSCs分化为TH阳性神经元的比例：A组为13.53%,B组为9.66%,C组为16.22%,D组（对照组）仅3.46%,有显著性差异（P〈0.01）。结论 GDNF和IL-1β可明显促进M-NSCs分化成多巴胺能神经元。     

EMILIN3基因促进人骨髓间充质干细胞增殖及向软骨细胞分化

目的 探讨EMILIN3基因对人骨髓间充质干细胞(human marrow mesenchymal stem cells,hMSCs)增殖及向软骨细胞分化的影响.方法 构建EMILIN3腺病毒表达载体,细胞分成hMSCs、hMSCs+对照腺病毒、hMSCs+ EMILIN3腺病毒3组,MTT法检测细胞的增殖情况,Real-time PCR法检测上述细胞向软骨细胞诱导后CollagenⅡ、Aggrecan、SOX9mRNA的表达.结果 hMSCs+EMILIN3腺病毒组细胞增殖能力明显快于hMSCs+对照腺病毒组和hMSCs组(P＜0.05),hMSCs+对照腺病毒组与hMSCs组增殖能力相比有所降低,但差异无统计学意义(P＞0.05).hMSCs+ EMILIN3 腺病毒组细胞中CollagenⅡ、Aggrecan、SOX9 mRNA的相对表达量与hMSCs+对照腺病毒组、hMSCs组相比明显增加(P＜0.05,P＜0.01).hMSCs+对照病毒组与hMSCs组相比有所增加,但没有明显的趋势(P＞0.05).结论 EMILIN3促进hMSCs增殖,并且可以增加hMSCs向软骨细胞诱导分化.     

DCs和NSPCs共培养促进NSPCs增殖及其机制的初步研究

目的观察体外Transwell共培养系统中树突状细胞(dendritic cells,DCs)对神经干/前体细胞(neural stem/progenitor cells,NSPCs)增殖的影响,初步探讨神经营养因子-3(neurotrophin-3,NT-3)在DCs调控NSPCs中的作用机制。方法根据是否采用Transwell小室将DCs和NSPCs共培养分为分隔培养(DCs/NSPCs组)和混合培养(DCs+NSPCs组),ELISA法测定DCs组、NSPCs组、DCs+NSPCs组、DCs/NSPCs组共培养48 h上清中的NT-3的含量。为观察NT-3在DCs调控NSPCs中的作用及可能的机制,成球法检测NSPCs组、NSPCs/DCs+K252a组、NSPCs+DCs组、NSPCs+NT-3组的NSPCs增殖,免疫细胞荧光法和Western blot法检测各组NSPCs表面酪氨酸激酶受体C(TrkC)的表达。结果 ELISA实验结果显示,Transwell共培养48 h上清NT-3的含量,NSPCs/DCs组较DCs组和NSPCs组明显升高(P<0.05)。镜下观察、测量结果显示NSPCs/DCs组和NSPCs+NT-3组神经球数量增多,平均直径明显增大(P<0.05)。免疫细胞荧光和Western blot检测结果表明,NSPCs+DCs组和NSPCs+NT-3组中NSPCs的TrkC表达较NSPCs组和NSPCs/DCs+K252a组高(P<0.05)。结论体外DCs与NSPCs共培养,促进NSPCs增殖、NT-3的分泌及TrkC的表达,NT-3可能是通过TrkC受体参与NSPCs增殖的调控。     

骨髓源性EPCs对脊髓源性NSCs增殖分化的影响

目的：观察骨髓源性内皮祖细胞( EPCs)对脊髓源性神经干细胞( NSCs)增殖分化的影响。方法通过密度梯度离心法获取骨髓血单个核细胞,以 EBM-2进行诱导培养EPCs并进行免疫细胞化学染色鉴定,成熟的方法获取及鉴定SD大鼠的脊髓NSCs,1×105/ml第3代NSCs置于Tran-swell小室下层与1×105/ml上层原代EPCs进行体外1∶1共培养,以单纯第3代的NSCs培养为对照,培养7 d,双盲法分别计数各组在相差显微镜下神经球形成的数目,并用目镜测微尺测量神经球的平均直径,通过5%血清诱导培养NSCs 7 d后,行β-微管蛋白-Ⅲ免疫荧光染色,Hoechst细胞核染色后在显微镜下计算神经元/细胞总数得出百分率。结果骨髓源性EPCs与脊髓源性NSCs共培养组神经球平均数目为(22．27±3．85)个,平均直径为(61．70±7．21)μm,诱导培养后分化为神经元的平均百分率为(46．10±3．70)%,与对照组比较差异均有统计学意义( P<0．01)。结论骨髓源性EPCs能促进脊髓源性NSCs增殖及其向神经元分化。     

低频磁刺激对人神经干细胞生长和分化的影响

目的:探讨体外不同条件的磁刺激对神经干细胞细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡和细胞分化等方面的影响。方法:对离体人胚神经干细胞进行磁刺激处理,采用频率0.5 Hz,脉冲刺激波宽为72 μs,刺激强度为阈上刺激1.44 T,每天1次,连续刺激3 d。按刺激次数分为A组(30个脉冲刺激/次)、B组(60个脉冲刺激/次)、C组(90个脉冲刺激/次)、D组(对照组,不进行磁刺激处理);用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测磁刺激对神经干细胞增殖的作用;用流式细胞术检测磁刺激对神经干细胞的细胞周期、细胞凋亡和细胞分化的作用。结果:A、B、C组神经干细胞在接受磁刺激后24~48 h的D值较D组明显增高(P<0.05),提示磁刺激对神经干细胞有轻度促增殖作用;A、B、C组G0/G1期细胞比例稍低于D组,而相应的G2/M比例较高,但无统计学差异;A、B、C组β-tuberlin阳性细胞比例较D组高,神经元比例由21.70%上升至34.17%( P<0.05)。结论:磁刺激在轻度促进细胞增殖的条件下,可诱导神经干细胞向神经元方向分化,有利于神经功能重建。     

体外直接诱导人胚胎干细胞向神经细胞分化的研究

目的探讨体外直接诱导HSF6人胚胎干细胞(humanem bryonic stem cells,hESCs)分化为神经细胞的方法。方法采用直接的方法,在1%血清培养条件下,顺序添加bFGF、RA和Forskolin,诱导HSF6人ESCs分化为神经细胞。结果细胞发生神经样形态学改变,免疫荧光细胞化学分析结果显示,分化细胞表达神经干细胞特异性标志分子——巢蛋白(nestin),以及神经元标志分子——β微管蛋白Ⅲ(neuron-specific class Ⅲ beta-tubulin,TuJ1)。实验组nestin阳性细胞数占(95.2±3.03)%,明显高于未添加诱导因子组的(31.6±4.93)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本研究直接诱导hESCs分化为神经细胞,减少了常规经胚胎体(embryoid body,EB)的诱导方法而产生其它胚层细胞的机会,为进一步探索hESCs源性神经细胞的功能,以及为细胞替代治疗提供高纯度的hESCs源性神经细胞奠定了基础。     

富血小板血浆对体外培养人脂肪来源干细胞增殖及成脂分化的作用

目的观察富血小板血浆对体外培养的人脂肪来源干细胞增殖与成脂能力的影响。方法用酶消化法获取人脂肪来源干细胞,二次离心法制备自体富血小板血浆,将细胞分为实验组与对照组,实验组以含5%、10%、20%自体富血小板血浆的条件培养液干预,对照组不进行富血小板血浆干预。观察细胞形态学,以XTT比色法测定细胞增殖状况,油红O染色检测细胞成脂活性。结果富血小板血浆实验组较对照组细胞形态饱满、密度增大;XTT比色法显示实验组细胞增殖明显(P<0.01);实验组油红O染色阳性率较对照组增高明显(P<0.01)。结论富血小板血浆对体外培养的人脂肪来源干细胞增殖与成脂分化活性具有显著的促进作用。     

猪造血微环境体外模型对人HSC分化作用的实验研究

目的 研究猪造血微环境对人造血干细胞(HSC)向红系分化的影响.方法 分别抽取健康志愿者骨髓6ml、实验用猪骨髓10ml,分离骨髓间充质干细胞(MSCs),接种DMEM/F12培养基,形成单层贴壁的成纤维样细胞后,作为人、猪造血微环境体外模型.按5×104/ml分别将人脐血CD34 细胞接种于人、猪造血微环境体外模型,以不含MSCs的培养系统为阴性对照,按3U/ml分别加入重组人EPO(rhEPO).于接种10 d后,取悬浮细胞,用流式细胞仪检测人CD71,以CD71阳性细胞率作为CD34 细胞向红系分化的分化率.结果 人MSCs支持下的人CD34 细胞在扩增的同时,(86.15±0.69)%细胞向红系分化;猪MSCs支持下的(82.46±1.46)%人CD34 细胞向红系分化,阴性对照(44.62±1.20)%人CD34 细胞向红系分化(P＜0.01).结论 与阴性对照相比,人/猪造血微环境体外模型均能显著促进人CD34 细胞向红系分化.     

体外培养海马神经干细胞的分化及超微结构观察

目的：研究胎鼠海马神经干细胞（NPCs）体外培养方法、了解其分化及超微结构特点．方法：分离胎鼠海马NPCs,应用机械分离法将海马组织制成单细胞悬液,用含有bFGF和EGF的无血清培养基培养,传代后用含血清培养基促分化,免疫细胞化学方法对NPCs及其分化后的子代神经细胞进行鉴定,并在电镜下观察分化后细胞的形态结构特征．结果：海马NPCs在无血清培养基中悬浮成球,贴壁后,细胞逐渐从细胞球向周围迁移分化．体外培养胎鼠海马NPCs表达巢蛋白（nestin）,在体外可诱导分化产生分别表达Tuj-1和GFAP的神经细胞．电镜观察到分化后的神经细胞及突起相互间排列、具有各种细胞器结构,可见细胞间紧密连接,完整的突触结构．结论：采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的大鼠胚胎NPCs．     

EDS对新生SD大鼠海马神经干细胞增殖分化的作用

目的观察在不同剂量蜕皮甾酮（ecdysterone,EDS）作用下,体外培养的神经干细胞（neural stem cells,NSCs）增殖、分化情况。方法原代培养新生SD大鼠海马NSCs,经EDS处理后,传代细胞克隆形成率、四甲基偶氮唑盐比色法观察神经干细胞增殖能力的变化,免疫荧光细胞染色技术、流式细胞术检测神经干细胞分化情况。结果与对照组相比,中低剂量组（50、100、200mg／L）,对大鼠海马NSCs增殖能力无显著影响,而高剂量的EDS（400mg／L及800mg／L）干预组则明显抑制了NSCs的增殖。在分化条件下,EDS200mg／L干预组显著提高NSCs向神经元分化的比例,其余各组无统计学差异。结论EDS能够调节体外培养的大鼠海马NSCs的增殖和分化水平,在合适的剂量下明显提高了神经元的分化比例。     

内皮祖细胞条件培养基对间充质干细胞增殖和成骨分化的影响及其机制

目的:探讨小鼠骨髓来源的内皮祖细胞(EPCs)条件培养基(CM) 对同源间充质干细胞(MSCs)增殖和成骨分化功能的影响,并阐明其作用机制。方法:小鼠骨髓细胞经差速贴壁法结合专用培养基分别培养扩增MSCs和EPCs,采用流式细胞术(FCM)检测MSCs和EPCs表面标记物,以成骨、成脂和成软骨诱导分化对MSCs进行功能鉴定,以成血管对EPCs进行功能鉴定。将MSCs分为0% EPCs-CM组(对照组,采用LG-DMEM培养)、50% EPCs-CM组(采用50% EPCs-CM+50% LG-DMEM培养)和100% EPCs-CM 组(采用100% EPCs-CM培养)。采用MTT比色法检测各组MSCs的增殖活性;采用茜素红染色检测各组MSCs的成骨分化能力。结果:FCM法检测,第3代MSCs高表达Sca-1、CD29, 低表达CD45、CD11b;经诱导可向成骨、成软骨和成脂方向分化。第3代EPCs 高表达CD34、CD133和VEGFR2;在铺有基质胶的96孔培养板中可形成血管样结构。与对照组比较,50% EPCs-CM组和100% EPCs-CM组MSCs增殖活性明显增加,且呈浓度依赖性(P<0.05)。茜草色素红染色法检测,培养21 d后50%和100% EPCs-CM组MSCs的钙结节数量和钙盐沉积均高于对照组(P<0.05)。结论:利用差速贴壁法可同时分离MSCs和EPCs,EPCs-CM能促进MSCs 的增殖和成骨分化。