鼠源TTV病毒海口株的基因组分析及real-time PCR检测方法的建立

目的:对海南省海口市褐家鼠体内发现的鼠源torque teno virus(RoTTV)地方流行株RoTTV3-HMU1进行全基因组扩增测序及遗传进化分析,并建立一种基于SYBR GreenⅠ荧光染料检测RoTTV3病毒的real-time PCR检测方法。方法:基于高通量宏病毒组测序分析结果设计特异性扩增引物,采用PCR方法进行全基因组序列拼接。并根据RoTTV3保守序列通过生物信息学分析设计特异性引物,以构建的含ddrp基因的重组质粒为标准品,优化实验条件,建立RoTTV的real-time PCR检测方法。结果:成功拼接获得一株海南省海口市褐家鼠携带的RoTTV的基因组序列,遗传进化分析表明该病毒属于RoTTV3基因型。本实验建立RoTTV3 real-time PCR检测方法,标准曲线在1×10~2～1×10~8拷贝/μL浓度时呈现良好线性关系,其扩增系数为1.000,溶解曲线只出现1特异性峰,检测灵敏度达到10~2个拷贝。结论:本实验首次获得海口地区RoTTV基因组序列,并对其进行遗传进化分析,对RoTTV的起源及进化研究具有重要的意义。本实验建立的RoTTV3 real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性好,为RoTTV3的流行病学调查奠定技术基础。     

一种基于real-time PCR技术的TTV检测方法的建立及应用

目的：本研究旨在开发一种具有更高灵敏度和特异性的TTV检测技术,为揭示TTV在多种疾病过程中的作用提供重要的技术支持。方法：为了更精确、灵敏的检测TTV,本研究分析了目前公布的所有亚型的TTV基因序列,在此基础上建立了一种基于UTR区域的real-time PCR检测方法,并与文献报道应用较为广泛的PCR检测方法进行了对比。结果：本研究建立的方法在1×107～1×101 copies/μL标准品浓度范围内具有良好的线性关系,相关系数为1.000,斜率为-3.446,检测下限为1×101 copies/μL。重复性试验结果显示,组内变异系数为7.22%,表明本方法重复性、稳定性较强。针对30份临床样本,使用本研究建立的real-time PCR检测方法及目前被多个研究所使用的4套引物进行对比。结果表明,本研究所建立的方法灵敏度显著高于文献中报道的4种方法（P<0.01）;Sanger测序结果表明,本方法检测出的30份阳性样本均为TTV,检测特异性为100%。结论：本研究采用基于TaqMan探针的real-time PCR检测方法,检测灵敏性高、覆盖基因型范围广,尤其对于TTV病毒载...     

犬瘟热病毒RT-LAMP检测方法的建立和初步应用

目的利用环介导等温扩增(LAMP)技术建立一种检测犬瘟热病毒感染的新方法。方法根据GenBank中NP基因序列,设计4条LAMP特异性引物,对反应条件、特异性、可视化效果和应用效果进行研究。结果在60℃等温的条件下、1 h内可完成RT-LAMP扩增过程;特异性和可视效果良好;对63份临床标本进行检测,阳性检出率为71.4%(45/63),检出率高于RT-PCR的63.5%(40/63)。结论建立的RT-LAMP检测方法,显示了较高的特异性和敏感性,而且兼具高效、快捷、可视化的优势,为临床检测犬瘟热病毒感染提供了一种快速简便的新途径。     

小鼠诺如病毒荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的建立小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)实时荧光定量PCR检测方法,为建立MNV规范化检测方法提供依据。方法根据NCBI公布的60个MNV病毒株核酸序列设计特异性引物,构建标准阳性质控品,建立MNV实时荧光定量PCR方法,并进行特异性、灵敏度、重复性及稳定性评价。用该方法对766只送检小鼠的盲肠内容物样品进行检测,初步了解北京地区实验小鼠MNV感染状况。结果成功建立MNV实时荧光定量PCR检测方法,该方法特异性好,与同种属人类诺如病毒(Hu No Vs)、猫杯状病毒(FCV)均无交叉反应,检测灵敏度可达101copies/μL。批内及批间CT值变异系数均小于2%。应用该方法在766份小鼠盲肠内容物样品中检出301份MNV核酸阳性样品,阳性率39.3%。结论建立的MNV实时荧光定量PCR检测方法特异性好,灵敏度高,重复性好,可以用于MNV的快速定量检测。     

鹅源星状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立一种可快速诊断鹅源星状病毒的荧光定量PCR方法 .方法 分析比对NCBI下载的鹅源星状病毒全基因组序列,在其ORF1a保守区设计一对特异性引物及TaqMan探针,优化反应条件,建立标准曲线,并验证其特异性,敏感性和稳定性.结果 该方法 最低检测线限为1.50×102copies/μL,批内和批间检测变异系数分...     

RT—PCR—ELISA方法检测甲肝减毒活疫苗病毒滴度的初步研究

目的应用核酸扩增产物测定的固相杂交酶联显色法(RT-PCR-ELISA)检测甲肝减毒活疫苗病毒滴度。方法应用RT-PCR-ELISA，将标记有生物素的寡核苷酸引物所扩增的疫苗病毒基因产物，与微孔反应板上的特异性探针进行快速杂交，通过辣根过氧化物酶标记的链亲和素进行酶联显色，读取吸光度(A值)，判断结果。应用此法检测了11批甲肝活疫苗滴度，并与常规细胞培养法(CCID50）比较。结果本方法与细胞培养法的敏感性相仿，具有简便、快速、特异的优点。结论RTPCR—EUSA法有望代替常规细胞培养法应用于甲肝减毒活疫苗病毒滴度的检测。     

仙台病毒RT-PCR检测方法的建立与应用

目的建立仙台病毒的RT—PCR方法并应用于常规检测。方法根据仙台病毒（gi：9627219）F蛋白的基因序列，设计Ff和Fr引物，以仙台病毒总RNA逆转录的cDNA为模板扩增出约609bp预期条带；将建立的RT—PCR方法应用于人工感染小鼠和送检细胞样品检测。结果八份感染小鼠样品中全部扩增出约609bp目的条带，16份肿瘤细胞样品有12份扩增出609bp目的条带。结论建立的仙台病毒RT—PCR方法是一种灵敏、快速、特异的方法，能够用于常规检测。     

鸡胚致死孤儿病毒和鸡减蛋综合症病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立鸡胚致死孤儿病毒(CELO)和鸡减蛋综合症病毒(EDS)的多重PCR检测方法并进行初步应用.方法 参照GenBank提供的基因序列,设计了2对特异性引物分别扩增CELO长纤突蛋白和EDS六邻体蛋白的基因序列,建立检测CELO和EDS的多重PCR方法,考察该方法的特异性和敏感性,并使用该方法检测流感疫苗主种子批病毒是否存在外源性禽腺病毒的污染.结果 该多重PCR方法成功扩增得到了两条特异性目的条带,并经测序验证.该方法特异性好,灵敏度显示核酸最低检测量可达10^-4μg/mL.使用该方法检测12批次流感疫苗主种子批病毒,外源性禽腺病毒的检测结果均为阴性.结论 成功建立鸡胚致死孤儿病毒和鸡减蛋综合症病毒的多重PCR检测方法,灵敏度高,特异性好.在流感疫苗主种子批病毒的外源性禽腺病毒的检测中具有很高的使用价值和应用前景.     

扎伊尔型、苏丹型埃博拉病毒TaqMan探针实时定量PCR核酸检测方法的建立

目的建立针对扎伊尔型(ZEBOV)及苏丹型埃博拉病毒(SEBOV)特异、灵敏和快速的Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法。方法选用世界卫生组织(WHO)参比实验室所使用的引物和探针序列,建立针对扎伊尔型及苏丹型埃博拉病毒的NP基因序列保守区的Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法,验证检测方法的灵敏性、特异性和稳定性,并与常规PCR检测方法进行比较。结果所建立的实时定量PCR方法可用于ZEBOV及SEBOV的特异性检测,较传统PCR方法反应快捷、灵敏,分别可达:ZEBOV 34拷贝/反应、SEBOV 24拷贝/反应;具有良好的特异性、稳定性和可重复性。结论建立了ZEBOV及SEBOV Taq Man探针实时定量PCR核酸检测方法,该方法可有望用于埃博拉病毒(EBOV)的实验室、临床及现场核酸检测。     

鸡胚致死孤儿病毒（CELO）和鸡减蛋综合症病毒（EDS） 多重PCR检测方法的建立及初步应用

【摘要】目的 建立鸡胚致死孤儿病毒（CELO）和鸡减蛋综合症病毒（EDS）的多重PCR检测方法并进行初步应用。方法 参照GenBank提供的基因序列,设计了2对特异性引物分别扩增CELO长纤突蛋白和EDS六邻体蛋白的基因序列,建立检测CELO和EDS的多重PCR方法,考察该方法的特异性和敏感性,并使用该方法检测流感疫苗主种子批病毒是否存在外源性禽腺病毒的污染。结果 该多重PCR方法成功扩增得到了两条特异性目的条带,并经测序验证。该方法特异性好,灵敏度显示核酸最低检测量可达10-4ug/ml。使用该方法检测12批次流感疫苗主种子批病毒,外源性禽腺病毒的检测结果均为阴性。结论 成功建立鸡胚致死孤儿病毒和鸡减蛋综合症病毒的多重PCR检测方法,灵敏度高,特异性好。在流感疫苗主种子批病毒的外源性禽腺病毒的检测中具有很高的使用价值和应用前景。     

聚合酶链反应技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒

目的建立聚合酶链反应(PCR)技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的方法。方法提取感染REV-T和脾坏死病毒(SNV)的SPF鸡胚成纤维细胞DNA为模板,利用前病毒长末端重复序列(LTR)区引物进行扩增。采集肿瘤病鸡,以及人工感染REV 28 d后鸡肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胸腺、法氏囊等器官,进行扩增。同时将采集的脏器组织,进行HE染色和免疫组化试验(IHC)。结果REV-T感染的组织未检测出电泳条带,而SNV感染的细胞中检测到了一条300bp特异而清晰的电泳条带,而且SNV感染的鸡组织中,PCR方法检测到了特异的条带。通过HE染色和免疫组化技术观察到了肿瘤组织,肿瘤细胞的形态、分布。结论PCR检测REV更快捷,特异更好。     

逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术，结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV），采用MHV－3，MHV－A59病毒株感染DBT细胞，37℃培养，待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物，进行RT－PCR扩增，结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA，同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。     

RT—PCR方法在小鼠肝炎病毒检测中的应用

用４株小鼠肝炎病毒（ＭＨＶ１、ＭＨＶ３、Ａ５９和ＪＨＭ）的混合液定量人工感染ＳＣＩＤ小鼠、ＢＡＬＢ／ｃ裸小鼠、ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,接种病毒后１、２、５、８ｄ分别取小鼠的全血、肝,用组织总ＲＮＡ抽提试剂盒提取总ＲＮＡ,用一步法ＲＴ－ＰＣＲ方法检测小鼠肝炎病毒。结果显示：接种后１ｄ,ＳＣＩＤ小鼠和ＢＡＬＢ／ｃ裸小鼠即保检测到小鼠肝炎病毒,而ＢＡＬＢ／ｃ裸小鼠即可检测到小鼠肝炎病毒,而ＢＡＬＢ／ｃ小鼠至接     

套式聚合酶链反应检测丙肝病毒核酸

对７０例血清谷丙转氨酶（ＡＬＴ）异常、疑是丙型肝炎（ＨＣＶ）患者血清标本，用ＨＣＶ基因５＇非编码区引物作套式聚合酶链反应（套式ＰＣＲ），扩增产物为２６０ｂｐ，结果显示５２例丙型肝炎病毒核酸（ＨＣＶ－ＲＮＡ）阳性，１８例阴性，阳性率为７４．２％。１０例助血员血样ＨＣＶ－ＲＮＡ均为阴性。经Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析，阳性ＰＣＲ产物为ＨＣＶ－ＲＮＡ所特异。作者认为，采用高保守区核苷酸序列引物作套式ＰＣＲ检测ＨＣＶ－ＲＮＡ，可提高实验的敏感性和特异性。     

空肠弯曲菌套式PCR快速检测方法的建立与初步应用

目的建立套式PCR快速检测实验动物空肠弯曲菌的方法。方法根据GenBank数据库的空肠弯曲菌flaA基因设计2对引物，对空肠弯曲菌抽提DNA作PCR扩增及克隆测序。同时，对其他病原菌抽提核酸扩增，并对120份临床样品进行检测。结果空肠弯曲菌经2对引物分别扩增出1719bp和640bp片段，与预期大小一致。套式PCR检测的最低限度为10CFU。整个检测过程可在8h内完成。而其他病原菌未出现特异性扩增条带。采用套式PCR对121份临床样品进行检测，检出31份阳性，与传统的细菌分离方法完全一致。结论本研究建立的套式PCR方法具有很好的特异性和敏感性，可用于实验动物空肠弯曲菌的快速检测。     

应用PCR法检测小鼠沙门氏菌

本文根据沙门氏菌保守基因序列合成一对寡桩苷酸引物,建立一种聚合酶链反应检测小鼠沙门氏菌的方法。通过对14株沙门氏苗和8株非沙门氏菌的检测,发现只有沙门氏菌才能扩增出495bp的特异性条带,检测灵敏度可达50条沙门氏菌水平。该法检测小鼠粪便中沙门氏菌的阳性率高于培养法,且整个实验过程仅需6～8h。可见,该法是一种特异、敏感、简便、快速的沙门氏菌检测方法,对实验动物质量控制将发挥积极的作用。     

竞争PCR用于乙肝病毒DNA定量检测初探

目的　评估竞争PCR这种检测方法的临床有效性。方法　用竞争PCR和荧光定量PCR两种方法对同一组患者血清HBVDNA进行了定量检测。竞争PCR是通过聚合酶链反应过程中竞争子和目的乙肝病毒DNA竞争同一反应管内的同一引物 ,通过凝胶成像比较目的乙肝病毒DNA和已知量竞争子的亮度 ,推测出目的DNA的含量。再将其结果与荧光定量PCR的结果相比较。结果　竞争PCR与荧光定量PCR检测的结果一致。结论　运用竞争PCR的方法对乙肝病毒DNA进行定量检测结果精确、成本较低 ,简便快速、易于操作 ,可推广使用。     

应用竞争聚合酶链反应检测乙型肝炎病毒DNA

目的探讨竞争聚合酶链反应(C-PCR)在乙型肝炎病毒(HBV)临床检测中的意义。方法根据中国人群最常见的HBV病毒adr亚型基因组序列合成一对HBV特异的引物,并制备内对照DNA,将适量的内对照DNA加入到常规HBV DNA PCR检测反应体系中,使其与HBV靶序列共扩增。结果在20μl C-PCR反应体系中,加入约100～500拷贝内对照DNA能够有效的获得共扩增信号;在120个临床血清标本的C-PCR扩增中识别出5个不能有效扩增的标本。结论C-PCR能够有效地指示临床标本HBV DNA体外扩增的假阴性。     

RT—PCR方法在小鼠肝炎病毒检测中的初步应用

采用4株小鼠肝炎病毒,MHV1、MHV3、A59和JHM的混合液人工感染SCID小鼠,接种病毒后1、2、5d分别取小鼠的全血、肝、肺、脑、脾和血清,用组织总RNA抽提试剂盒提取各组织的总RNA,然后用RTPCR方法检测小鼠肝炎病毒,并对各反应产物进行平均光密度测定。结果显示,接种后24h即可检测出血液中的小鼠肝炎病毒,病毒在小鼠体内各脏器出现的先后顺序为血、肝、脾、肺、脑,主要在肝脏进行复制。     

巢式聚合酶链反应检测脑脊液中单纯疱疹病毒的DNA

应用巢式（ｎｅｓｔｅｄ）聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测患者脑脊液中单纯疱疹病毒（ＨＳＶ）ＤＮＡ，２５份经鞘内ＩｇＧ抗体确诊的“单纯疱疹病毒性脑炎（ＨＳＥ）”患者的ＣＳＦ标本中２３份ＰＣＲ阳性；１０５份ＩｇＧ阴性的“散发性脑炎”患者ＣＳＦ中１５份ＰＣＲ阳性，其中７份阳性标本为发病１周内所取，２份取于发病当日。提示ＰＣＲ更适于ＨＳＥ的早期诊断。