乙型肝炎病毒X基因异质性及对其反式激活功能的影响

从慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染患者外周血中扩增X基因序列，克隆入pGEM-Teasy质粒，随机挑选克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果提示，HBV长期带者体内有HBV准种共存，X区内存在热点缺失突变区。为了进一步探讨X区突变对X蛋白反式激活功能的影响，将野生株及不同缺失突变的X基因片段克隆入pcDNA3.1(-)载体的EcoRI位点，构建重组表达质粒，并分别与报告质粒pSV-lacZ共转染HepG2细胞，提取细胞裂解液，检测SV40启动子调控下的β－半乳糖苷酶表达活性。共转染结果显示：野生株X蛋白能够反式激活SV40病毒早期启动子。提示X区不同核苷酸缺失突变和点突变均在不同程度上降低了其反式激活作用。     

G1764A/C1766T/T1768A三联突变对HBV核心启动子活性的上调作用研究

目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)荧光素酶表达载体,探讨HBV CP变异对下游基因转录活性的影响.方法 2005年5月至2008年3月于解放军302医院就诊的慢性乙型肝炎(CHB)及慢加急性肝衰竭(ACLF)患者各40例,采集血清提取HBV DNA,采用巢式PCR法扩增HBV CP片段,克隆至pGEM-T Easy载体.挑选含有CP相关变异位点的质粒,经Kpn Ⅰ/Bgl Ⅱ双酶切后,构建pGL3-CP荧光素酶真核报告质粒,并采用定点突变方法获得野生型质粒,将两者同时转染肝癌细胞系HepG2,48h后进行荧光素酶检测.结果 患者临床资料经统计分析后显示,CHB患者HBeAg阳性率和HBV DNA载量均高于ACLF患者(P<0.01),而TBIL含量则低于ACLF患者(P<0.01);对CP区热点突变频率分析后发现:G1764A/C1766T/T1768A三联突变在CHB患者中为0.0%(0/40),在ACLF患者中为12.5%(5/40,P<0.05).细胞转染结果显示:典型CP双联突变A1762T/G1764A病毒株的启动子活性为相应野生株的1.67倍,而G1764A/C1766T/T1768A三联突变病毒株的启动子活性为相应野生株的1.43～1.80倍.结论 HBeAg阳性率、TBIL水平、HBV DNA载量与乙型肝炎重症化相关,HBV CP中存在的A1762T/G1764A、G1764A/C1766T/T1768A突变有顺式激活下游基因转录活性的作用.     

HBV转录后调节序列变异位点的生物学意义初探

探讨HBV转录后调节序列位点变异与细胞因子介导的非细胞毒抗HBV机制的关系。应用定点突变技术,体外构建含有HPRE位点变异的重组质粒载体,观察位点变异对HPRE功能以及细胞因子抗HBV机制的影响。经测序证实,成功构建了含有HPRE变异位点的重组质粒载体。与野生株比较,1504nt突变株的CAT活性明显升高,差异有显著性意义;1508nt突变株则无明显变化。在IFN-γ或（和）TNF-α作用下,3种突变株的CAT活性均明显下降,在IFN-α作用下,1504nt突变株和1504+1508nt突变株的CAT表达活性明显降低,差异有显著性意义（P<0.01）;而1508nt突变株的CAT表达活性无明显变化（P>0.05）。提示HPRE1504nt位点的变异可能影响HPRE功能的发挥,而1508nt位点的变异可能逃逸了IFN-α的抑制作用。     

HBV全基因核心蛋白变异株稳定表达载体的构建及其抗原表达

通过定点突变技术将HBV质粒p3．8Ⅱ构建成核心蛋白变异株V60和L97。经序列测定和生物学活性检测后，亚克隆入EB病毒稳定表达载体。重组载体分别作内切酶酶切鉴定和序列测定证实，用脂质体介导转染HepG2细胞稳定传代，定量测定各株培养上清HBV抗原表达。结果发现，3株HBsAg含量S／N值接近，变异株HBeAg含量S／CO值低于野生株。上述3种重组载体的构建可为体外研究HBV核心蛋白热点变异与致病的关系提供基础。     

HBV基因组A1846T变异对病毒复制力及核心启动子活性的上调作用研究

目的 评价乙肝病毒(HBV)基因组核苷酸(nt)A1846T变异对病毒体外复制力及核心启动子(CP)转录活性的影响.方法 385例研究对象包括116例轻中度慢性乙肝(CHB-M)患者,123例重度慢性乙肝(CHB-S)患者和146例慢加急性肝衰竭(ACLF)患者.从患者血清中提取HBV DNA,PCR扩增HBV全长基因组,统计A1846T变异的发生率.挑选代表性A1846T变异株HBV全长序列克隆至pGEM-Teasy载体中,并通过定点突变获得野生型对照.BspQⅠ/ScaⅠ双酶切HBV基因组,转染HepG2细胞,检测病毒复制力和HBsAg表达水平;用PCR分别扩增含nt1846变异型和野生型的HBVCP区片段,构建pGL3-CP双荧光素酶真核报告表达载体,转染HepG2细胞,分析检测A1846T变异对荧光素酶表达的影响.结果 HBV A1846T变异发生率随疾病程度加重依次增高,CHB-M、CHB-S和ACLF患者的变异检出率分别为31.03％、42.27％和55.48％(P＜0.01).A1846T变异株的复制力、分泌的HBsAg水平和核心启动子活性较野生株分别提高了320％、28％和85％,常见的CP区A1762T/G1764A双联变异株分别较野生株提高了67％、9％和72％,A1846T变异对提高病毒复制力的影响更强.结论 A1846T变异可显著增加HBV复制力,提高HBsAg表达水平,增强启动子活性,顺式激活下游基因转录表达,提示该变异可能与慢性乙肝重症化发生机制相关.     

乙型肝炎病毒前-S2蛋白对硫氧还蛋白还原酶1基因表达的上调作用研究

目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白对硫氧还蛋白还原酶1(TXNRDl)启动子转录的激活作用。方法 以302院传染病研究所基因治疗研究中心自行构建的乙型肝炎病毒前-S2蛋白反式调节的基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学技术确定TXNRD1的启动子区域(TXNRD1p),PCR扩增TXNRD1p,克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建pCAT3-TXNRD1p报告载体;以该质粒转染肝癌细胞系HepG2细胞系,用ELISA法检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性;并与pcDNA3．1(-)-preS2共转染HepG2细胞系,用ELISA法检测CAT的表达活性。结果pCAT3-TXNRDlp和pcDNA3．1（-）-preS2瞬时转染的HepG2细胞的CAT表达活性是pCAT3-Basic空载体的5．7倍、pCAT3-TXNRDlp的2．2倍。结论 该TXNRD1启动子有顺式激活下游基因的活性;HBV的前-S2蛋白具有反式激活TXNRD1的作用。     

乙型肝炎病毒X蛋白反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应（PCR）扩增HBV X基因,克隆至真核表达载体pVR1012中,构建HBV X基因重组表达载体pVR102-X;以该质粒转染HepG2细胞,酶联免疫吸附法（ELISA）检测细胞X蛋白的瞬时表达,与报告质粒pSV-lacZ共转染H G2爱细胞,用试剂盒法检测β-半乳糖苷酶表达活性。结果质粒pVR102-X在HepG2细胞瞬时表达X蛋白,共转染实验中pVR102-X组β-半乳糖苷酶的表达是空质粒对照的3．2倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表,并能够反式激活SV40病毒早期启动子。     

人IP-10启动子的克隆和转录活性的检测

目的 克隆干扰素诱导蛋白10（IP-10）5’非编码区（NCR）片段，检测克隆的IP-10启动子驱动的荧光素酶报告基因在LPS激活的人脐静脉内皮细胞（HUVEC）中的转录活性。方法 提取人外周血淋巴细胞基因组DNA，以其为模板，利用巢式PCR扩增人IP-10启动子片段，测序正确后克隆入荧光素酶报告基因表达载体pGL3；将重组质粒pGL3／IP-10P导入HUVEC细胞，检测LPS刺激下荧光素酶活性。结果 正确克隆出人IP-10启动子（-2028～-1）片段，成功构建了pGL3／IP-10P报告基因表达载体；证实了LPS可诱导HUVEC细胞中IP-10的高表达。结论 成功克隆出人的IP-10启动子片段，并利用荧光素报告基因证实了在HUVEC细胞中LPS可诱导IP-10高转录表达，为深入研究LPS诱导IP-10转录表达的调控机制提供了基础。     

ABRACL基因启动子不同片段重组质粒构建及转录活性研究

目的 构建肌动蛋白结合Rho激活C末端样（ABRACL）基因启动子不同截短片段重组质粒,并检测其转录活性。方法 以含ABRACL启动子全长质粒为模板,利用PCR方法分别扩增ABRACL启动子不同截短片段;将扩增片段分别插入pGL3.0-basic载体,构建ABRACL启动子不同截短片段重组质粒;经双酶切及序列鉴定正确后,将重组质粒转染ZR75-1和A549细胞,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定ABRACL启动子不同截短片段的双荧光素酶活性;检测转录因子MYB原癌基因样2(B-MYB)对ABRACL启动子不同截短片段转录活性的影响。结果成功构建含ABRACL基因启动子不同截短片段重组质粒,双荧光素酶活性测定发现ABRACL基因启动子-400 bp片段活性较高,转录因子B-MYB可以增强ABRACL启动子-600 bp和-1000 bp片段的活性。结论 发现ABRACL基因启动子转录活性较高区域,为进一步研究ABRACL基因上游调控机制奠定基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活SV40病毒早期启动子的研究

聚合酶链反应（PCR）扩增丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NS3基因，克隆至真核表达载体pcDNA3.1(－）中，构建HCV NS3基因真核表达载体pcDNA3.1(－）-NS3;以该质粒转染肝母细胞瘤细胞系epG2细胞，免疫印迹方法（Western blotting)检测转染细胞中HCV NS3蛋白的瞬时表达；与报告质粒pCAT3-promoter共转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附方法（ELISA）检测细胞中氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性。结果显示，质粒pcDNA3.1(－）-NS3在HepG2细胞瞬时表达HCV NS3蛋白，共转染实验中pcDNA3.1(－）-NS3组的CAT表达活性是空质粒对照组的4．6倍。表明构建的表达载体能在哺乳动物细胞中表达出相应蛋白，并能够反式激活SV40病毒早期启动子。本研究为进一步克隆HCV NS3蛋白反式激活的靶基因，为深入阐明HCV NS3蛋白致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论基础。     

乙型肝炎病毒逆转录酶区基因序列准种与变异研究

以乙型肝炎病毒（HBV）多聚酶（P）和逆转录酶（RT）区及表面抗原主蛋白（HBsAg)序列异质性来探讨HBV准种群状态。用多聚酶链反应（PCR）方法,自3例慢性HBV患者血清中扩增靶基因,克隆入T载体。随机挑选13株克隆测序,发现2株克隆出现大段缺失,另11株序列之间总差异率为5．1％;RT和HBsAg氨基酸序列差异率分别为4．9％和7．5％;并发现缺失突变、终止突变等多种突变类型。结果提示,HBV慢性患者体内有HBV准种群,并存在缺陷型HBV病毒。     

乙型肝炎病毒基因组准种与变异特点的研究

探讨乙型肝炎病毒（HBV）基因组异质性及其生物学意义。以已知HBV基因序列为依据，设计特异性多聚酶链反应（PCR）引物，自2例慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV基因组序列，克隆入pGEM Teasy质粒，随机挑选克隆进行DNA测序并加以比较。测序结果发现，来源不同的5株HBV全基因组核苷酸序列的一致率为93．6％，不同克隆的4个开放读码框架长度有明显区别，氨基酸序列中存有移框、缺失、替换等多种变异类型。说明来源于同一患者的HBV基因组序列之间存在有较明显的变异现象，在患者体内构成了准种群。     

乙型肝炎病毒前C/C基因准种与变异特点的研究

以乙型肝炎病毒（HBV）前C／C基因异质性来探讨在慢性感染者体内是否存在HBV准种。以中国株HBV基因序列为依据，设计特异性多聚酶链反应（PCR）引物，自4例慢性HBV感染患者血清中扩增HBV前C／C基因序列，克隆入pGEM Teasy载体，每例患者挑选5个克隆测序以比较病毒的变异程度。测序结果发现同一患者前C／C基因碱基序列之间的同源性大于98％，但存有G83→A替换、C抗原内部缺失、移框突变等多种变异类型。结果提示，HBV长期携带者体内有HBV准种共存，推测前C／C区的多种变异可能与感染慢性化有关。     

乙型肝炎、丁型肝炎病毒联合诊断芯片制备的初步研究

目的制备联合检测乙型肝炎病毒(HBV)、丁型肝炎病毒(HDV)基因芯片并进行杂交验证。方法利用Primer Premier 5．0分别针对HBV、HDV基因保守区域设计多对PCR引物,扩增后的产物克隆至pMD18-T载体,提取阳性克隆质粒进行测序分析鉴定。用PixSys5500芯片打印仪将PCR产物打印在氨基修饰的玻片上制备成检测芯片。样品荧光标记采用限制性显示(RD)技术,标记后进行杂交验证分析。结果序列分析表明,运用PCR技术得到的多个基因片段均属于HBV、HDV特异基因。杂交结果显示,敏感性、特异性、重复性等指标均佳。结论利用PCR扩增产物作为探针制备HBV、HDV联合诊断芯片是一种快速、简便的实用方法,有着广阔的应用前景;利用RD技术标记样品可提高多种肝炎病毒混合检测的敏感性。     

携带人鞘氨醇激酶及突变体基因重组腺病毒载体的制备及表达

目的制备携带人野生型鞘氨醇激酶基因(SPK^wt)及其突变体(SPK^DN)的腺病毒载体,为研究SPK的生物学功能提供高效基因转移载体。方法将野生型和突变体SPK基因亚克隆至穿梭载体pshuttle-cmv,重组的穿梭质粒经Pme线性化后,电转化E.coli BJ-AD-1感受态,获得带有目的基因的腺病毒重组子质粒;重组子经Pac I线性化后,以脂质体介导转染293包装细胞,获得重组腺病毒载体;分别行PCR鉴定重组腺病毒是否携带目的基因,Western blot鉴定目的基因是否表达,酶活性检测判断野生型基因和突变体基因表达活性。结果重组腺病毒带有目的基因,可以感染内皮细胞并正确表达,酶活性分析表明野生型SPK基因增强SPK活性,突变体SPK基因抑制SPK活性。结论成功构建了携带SPK野生型及其突受体的重组腺病毒,为研究SPK的功能提供了物质基础。     

乙型肝炎病毒基因组中前-前-S-编码基因启动子序列的确定及转录活性的鉴定

为了解前-前-S编码区ORF上游是否具有启动子活性，选取其起始密码子ATG上游277bp的DNA序列，将其克隆至报告基因表达载体pCAT3中，构建pCAT3-前-前-S-promoter表达载体，以该质粒转染HepG2细胞，用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果发现，质粒pCAT3-前-前-S-pmrnoter能够激活CAT的表达，吸光度(A值)是pCAT3-basic的10倍，说明pCAT3-前-前-S-promoter具有启动子活性，为在HBV基因组DNA序列中界定、研究新的前-前-SORF提供了直接的实验依据。     

乙型肝炎病毒基因组中前-X-编码基因启动子序列的确定及转录活性的鉴定

利用长距离精确聚合酶链反应 (LA PCR)扩增慢性乙型肝炎患者血清来源的 5个全长的HBV基因组DNA ,在分析不同克隆之间的序列变异程度时 ,发现所获得的 5个克隆在X区之前可能还存在一个开放读码框架 (ORF) ,长度 16 8bp ,编码 5 6个氨基酸残基(aa) ,并将其暂时命名为前 X(pre X)。为了解前 X编码区上游DNA序列是否具有启动子活性 ,选取翻译起始密码子ATG上游 2 2 5bp的基因片段 ,将其克隆至报告基因表达载体pCAT3中 ,构建pCAT3 前 X promoter表达载体 ,以该质粒转染HepG2细胞 ,用ELISA法检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶 (CAT)的表达活性。结果发现 ,质粒 pCAT3 前 X promoter能够指导CAT的表达 ,吸光度 (A值 )是pCAT3的 3 5倍 ,提示pCAT3 前 X promoter中插入的DNA序列具有启动子活性 ,说明这一段基因序列中存在新的启动子区 ,为研究、界定前 X的ORF的存在提供了直接的依据。     

腺病毒表达Ribozyme在细胞内对HBV的免疫作用

了解利用腺病毒腺体表达针对乙型肝炎病毒（HBV）的核酶在细胞内对HBV表达的抑制作用。将针对HBV的多位点核酶克隆入腺病毒载体中，利用包装细胞包装出含核酶及突变核酶的重组腺病毒，将腺病毒感染2．2．15细胞（含HBV），检测感染细胞中核酶及突变核酶的表达，利用ELISA，打点杂交及激光共聚光共聚焦等方法，检测核酶对细胞内乙型肝炎病毒表达的抑制作用。结果显示核酶及突变核酶的确被克隆入腺病毒载体，并经过包装后可形成包装腺病毒，感染2．2．15细胞后可表达出目的核酶，并发挥核酶的剪切作用，其对HBV表达的抑制率最高可达87．1％。证实包装腺病毒表达的多位点核酶对HBV的复制有明确的抑制作用，支持核酶的抗病毒效果，有希望成为HBV治疗的潜在方法之一。     

接受拉米夫定治疗的慢性乙肝患者HBV反转录酶区新变异rtM204Q的表型特点分析

目的分析乙肝病毒(HBV)反转录酶(RT)区YMDD功能域新变异rtM204Q的表型特点。方法从1例接受拉米夫定(LAM)治疗的慢性乙肝患者血清中提取HBV DNA,扩增HBV全长RT区基因,PCR产物直接克隆到pGEM-Teasy载体中,随机挑选40个克隆进行DNA序列测定并分析耐药相关变异。将Xho I/Sph I双酶切后的RT片段与载体连接成含HBV 1.1倍基因组长度的重组载体。采用FuGENE HD试剂盒,将构建的含野生株和变异株的重组载体转染至人肝癌细胞系HepG2细胞。转染4h后加入不同浓度的核苷(酸)类药物[LAM终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L;阿德福韦酯(ADV)终浓度为0、0.033、0.1、0.33、1、3.3μmol/L;恩替卡韦(ETV)终浓度为0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L;替诺福韦酯(TDF)终浓度为0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L],隔天换药,连续作用4d后收集细胞上清,采用实时荧光定量PCR技术检测不同药物浓度下HBV DNA的复制水平,以分析变异株的表型特点。结果对从患者血清获得的37个克隆进行测序分析,结果显示13个(35.1%)为野生型,11个(29.7%)为rtM204Q突变型,2个(5.4%)为rtM204I突变型,10个(27.0%)为rtA181T突变型,1个(2.7%)为rtA181T+rtM204Q突变型。后4种变异株的复制力分别是野生株复制力的89.95%、46.28%、55.77%和34.44%(P<0.05)。前2种变异形式的表型耐药分析结果显示,rtM204Q对LAM的敏感性为野生株的1/75.68,而rtM204I对LAM的敏感性不及野生株的1/1000。rtM204Q和rtM204I株对ADV、ETV和TDF均敏感。结论 HBV RT区新的YQDD基序变异在一定程度上抑制病毒复制力,对LAM的敏感性降低,提示这可能是一个新的LAM耐药相关变异。