PCR直接测序法在脓肿分枝杆菌鉴定中的应用

目的探讨聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）与DNA测序技术鉴定脓肿分枝杆菌的效果。方法利用细菌16S r RNA基因通用引物PCR扩增疑似分枝杆菌的16S r RNA基因的DNA片段并进行DNA测序分析。DNA测序获得序列经生物信息学比对分析获得相关分枝杆菌的信息;针对相关分枝杆菌分别设计非同源区域特异性引物对1 500 bp的克隆DNA片段扩增验证。结果细菌16S r RNA基因通用引物扩增获得约1 500 bp的DNA片段,但DNA测序仅获得其中部分DNA序列约296 bp;部分DNA序列经生物信息学比对分析后获得四种同源性高达98%的分枝杆菌信息,并且四种分枝杆菌的特异性引物对1 500 bp的克隆产物进行扩增后仅在脓肿分枝杆菌中获得特异性PCR产物。结论疑似结核患者体内的抗酸染色阳性菌为非结核分枝杆菌中的脓肿结核分枝杆菌,并且PCR直接测序法可快速鉴定细菌的种属。     

Alu-PCR检测人肝癌细胞株PLC/PRF/5基因组中乙型肝炎病毒DNA的整合

目的 应用Alu-PCR方法检测人肝癌细胞株PLC/PRF/5 基因组中乙型肝炎病毒(HBV)DNA的整合。 方法 提取经培养扩增的人肝癌细胞株PLC/PRF/5 基因组DNA,根据Alu-PCR方法经过3轮PCR反应扩增潜在的HBV DNA和人基因组DNA整合片段。琼脂糖凝胶电泳观察PCR 扩增产物片段,切取并纯化整合阳性的电泳条带,对纯化产物进行核酸测序,得到整合片段的核苷酸序列。 结果 经琼脂糖凝胶电泳检测,用Alu-PCR方法能够从PLC/PRF/5 细胞株中扩增得到4条HBV DNA整合序列,经测序后与比对其中3条整合序列能够定位于人染色体03p21.31、05p15.33、12q13.12~q14.1。 结论 Alu-PCR可以准确测定肝细胞中HBV DNA的整合,为研究HBV DNA在肝细胞中的整合研究提供了一个简单、经济的方法。     

一种PCR结合DNA回收克隆基因方法

目的 探讨一种结合DNA片段回收扩增目的片段的方法.方法 以PCR扩增克隆β-珠蛋白MAR和survivin启动子为例,根据GenBank报道的序列设计引物,PCR扩增克隆β-珠蛋白MAR和survivin启动子.结果 PCR产物有非特异DNA片段、根据DNA片段大小采取凝胶DNA回收与预期片段相符的DNA片段,送公司测序.测序结果表明所扩增的序列和GenBank报道的序列一致.结论 用该方法可以成功克隆出目的DNA片段.     

DNA自动测序中的常见影响因素及测序反应体系的优化

目的：分析和研究DNA测序过程中影响因素及其测序反应体系的优化。方法：对DNA测序体系中模板、引物、测序产物的纯化及3种测序反应体系对测序结果的影响进行比较。 结果：采用5 μL（含1 μL TRR）、5 μL（含2 μL TRR）和10 μL（含4 μL TRR）测序反应体系对同一质粒DNA进行测序,其可判读序列都能达到720 bp以上。 结论：DNA自动测序的质量与模板的纯度、浓度、所用引物、测序反应体系及测序反应产物的纯化有直接的关系。采用5 μL（含1 μL TRR）测序反应体系在保证测序质量的同时可降低DNA测序成本。     

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化PCR产物的观察

目的 :观察采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化目的 PCR产物的效果。方法 :使用不同的 31对引物 ,4 5例标本行 PCR扩增出不同的目的 DNA片段 ,将每一份 PCR产物分为 2份 ,其中 1份直接测序 ,为对照组 ;另 1份则做非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ,以分离出的目的 DNA片段单链为模板行 2次 PCR,对 2次 PCR产物测序 ,此为实验组。结果 :实验组只有 4例不能被测序仪判读 (4 / 4 5 ) ,而对照组有 2 4例不能被测序仪判读 (2 4 / 4 5 ) ,两组比较 ,差异有统计学意义 (P <0 .0 1 )结论 :根据单链DNA片段形成构象的不同来纯化 PCR产物可达到更好的纯化效果     

高通量测定技术检测结核分枝杆菌耐利福平的研究

目的：基于焦磷酸测序(pyrosequencing)技术，建立耐利福平结核分枝杆菌快速检测方法，并探讨其临床应用价值．方法：设计一对聚合酶链反应(PCR)引物，其中一引物经生物素化修饰，PCR扩增含耐药决定区-297bp长的rpoB基因片段，借用链亲和素包被磁珠纯化单链PCR产物．设计2个正向测序引物，运用pyrosequencing技术对耐药决定区进行序列测定．通过对一系列10倍稀释的结核分枝杆菌H37Rv标准株DNA进行分析，评价所建立方法的检测特异性．     

扩增潜伏HIV-1 DNA序列实验方法的优化

目的对PCR扩增潜伏HIV-1DNA序列的实验方法进行优化。方法收集30例经高效抗逆转录病毒治疗（HAART）6~12个月的HIV-1感染者抗凝血标本,分别从外周血单个核细胞（PBMC）和高度纯化的CD4＋T细胞提取基因组DNA,巢式PCR扩增HIV-1env的C2-V5区,电泳检测扩增产物并进行DNA序列测定。结果同一患者PBMC纯化CD4＋T细胞标本扩增HIV-1env基因C2-V5区的效率（93.3%）明显高于直接从PBMC标本扩增该目的片段的效率（10.0%）。结论 PBMC纯化CD4＋T细胞后,再提取基因组DNA进行巢式PCR扩增,可提高扩增潜伏HIV-1DNA序列的效率。     

输血传播病毒样微小病毒基因检测

目的：测定慢性肝炎患者体内输血传播病毒(TTV)样微小病毒（TLMV）的全基因序列，并研究人群中TLMV感染状况。方法：采用日本学者Shunji Mishiro提供的序列选择TLMV-CBD279和CBD-231最保守区设计引物，用慢性乙型肝炎且TTV阳性患者血清制备DNA模板，进行PCR扩增；将阳性PCR产物连接至pGEMR-T质粒，碱裂解法提取质粒DNA并纯化。以T7 引物为起 始全自动荧光测序仪测序。结果：获得162bp基因序列，该序列与日本株CBD231、CBD279同源性为72%，丙型肝炎患者及健康献血员感染率最高。结论：在＊慢性乙型肝炎患者体内存在TLMV感染。     

rRNA基因间隔区碱基测序对当归进行鉴定的研究

目的 通过rRNA基因内转录间隔区的碱基序列测定。对当归进行分子水平鉴定。方法 常规提取当归种籽DNA，利用合成的特异性引物对其rRNA基因内转录间隔区进行套式PCR扩增，将扩增产物进行碱基序列测定。结果 琼脂糖凝胶电泳证实当归种籽中rRNA基因内转录间隔区PCR扩增产物存在；经测序后得到了当归种籽rRNA基因内转录间隔区的碱基序列。结论 rRNA基因内转录间隔区的碱基序列测定可做为分子水平鉴定植物性中药材的又一有效途径。     

一步法分离石蜡切片DNA的改进与鉴定

目的　改进一种以含蛋白酶K的裂解液作用于石蜡包埋处理的细胞、分离DNA粗提液用于PCR扩增的实验方案。方法　石蜡包埋组织切片经常规脱蜡处理,用蛋白酶K裂解液洗脱细胞,55　℃消化3　h后离心,吸取上清液;分光光度法检测DNA酶裂解液质量和浓度;以之为模板分别扩增人线粒体基因微卫星多态D310区、ATPase6基因区和核基因HBB、BRCA1等的DNA片段,琼脂糖凝胶电泳检测分析PCR扩增情况,并测序验证扩增产物。结果　以石蜡切片的DNA裂解粗提液为模板,扩增目的DNA片段阳性率可达100%;获得序列分析验证。结论　改进的蛋白酶K裂解液一步洗脱消化法操作简单、过程快捷、费用低廉,能快速有效地分离石蜡组织切片DNA,用于后续PCR扩增检测,具有较高效率。     

FMS样酪氨激酶3受体配基基因的克隆和序列分析

目的 获得人FLcDNA膜外序列,以构建表达人FMS样酪氨激酶3受体配基（FL）蛋白的重组本,更深入地探讨FL的生物学功能。方法 通过设计和合成引物,提取胎肝细胞总RNA进行逆转录反应,经PCR扩增目的cDNA片段,并将其重组至PUC－18T载体中,测定其DNA序列。结果 从胎肝细胞总RNA中扩增得到546bp片段,序列测定证实该片段为包括25个氨基酸残基组成的信号肽的胞外序列。结论 FL胞外区cDNA已被成功地克隆。     

球形幽门螺杆菌vacA基因的克隆及序列测定

目的：克隆球形幽门螺杆菌(HpC)vacA基因全长片段，并进行序列分析。方法：采用亚抑菌浓度的抗生素作用，使幽门螺杆菌(Hp)标准株NCTC11637发生球形变异，收集球形Hp。从HpC基因组DNA中特异扩增出vacA基因片段，扩增的目的片段经纯化回收后克隆到pMD-18T中，转化人大肠杆菌JM109。阳性重组质粒用PCR及双酶切鉴定，并进行序列测定。结果：从HpC基因组DNA中扩增出3888bp的vacA基因，构建重组质粒pMD-18T-vacA，酶切产物的大小与预期相符。测序结果显示，HpC与已公布的HpvacA基因序列的同源性达99.8％。结论：成功地对HpC vacA基因进行体外扩增及构建原核重组质粒pMD-18T-vacA，并经酶切及序列分析所验证，证明HpC含有完整的vacA基因，其可能与Hp的致病性有关。     

人CCR5 5′侧翼调控序列克隆测定及基序分析

目的：克隆人ＣＣＲ５ ５′侧翼调控序列及其基序分析。方法：设计单引物,利用单向多循环ＰＣＲ扩增及聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化人ＣＣＲ５ ５′侧翼调控序列基因组ＤＮＡ,ＰＣＲ产物作为序列分析模板。结果：得到长为１．５ｋｂ的人ＣＣＲ５ ５′侧翼调控序列基因组ＤＮＡ序列,并对该区域的基序进行了分析。结论：该方法适合于基因组ＤＮＡ,特别是逆向扩增一些读框区５′侧翼调控序列。     

间日疟原虫深圳株红内期SSUrDNA基因片段的克隆与序列分析

目的 体外扩增间日疟原虫深圳株红内期小亚单位核糖体核糖核酸编码基因(SSUrDNA)片段，研究其结构与功能。方法 设计一对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)从间日疟原虫患者血样中扩增出间日疟原虫SSUrDNA片段，以PUC19质粒T载体构建重组子导入大肠杆菌JM109；阳性克隆双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列。结果 间日疟原虫SSUrDNA扩增片段大小为341bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；序列测定插入片段为341bp，与Sal I株顺序相比，仅在第151位处缺失一个碱基C。结论 成功克隆了间日疟原虫SSUrDNA片段．该序列在间日疟原虫虫株间高度保守。     

利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒

目的:利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒,为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物,用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板,特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CAT cDNA与dATP反应,利用Taq DNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CAT cDNA的3′末端加"A"并纯化,然后应用TA克隆策略将纯化后的CAT cDNA插入至中间载体pGEM-T Easy Vector中,经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸,两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点,将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1,然后酶切鉴定。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalⅠ-BglⅡ和XhoⅠ-BamHⅠ双酶切,利用同尾酶(SalⅠ与XhoⅠ,BglⅡ与BamHⅠ)能酶切产生相同黏性末端的特性,将回收得到的CAT cDNA片段与pET15b-PEP-1相连,构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT,经PCR及酶切鉴定,并通过核苷酸序列测序证实。结果:获得pET15b-PEP-1-CAT重组子,经测序分析证实,克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致,CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CAT cDNA序列一致。结论:pET15b-PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白H is tag-PEP-1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础。     

家蝇幼虫防御素基因的克隆和序列分析

目的：克隆家蝇幼虫防御素（defensin）基因并进行序列分析。方法：根据Genbank公布的家蝇成虫defensin基因序列设计一对引物,以家蝇幼虫基因组DNA为模板,进行PCR扩增、测序,并利用软件进行序列分析。结果：克隆得到的defensin基因的长度为330bp,编码92个氨基酸,4个阳性克隆的DNA序列编码的多肽在第27位氨基酸残基不同,为K或N。结论：从家蝇幼虫基因组DNA中克隆得到了defensin基因,发现了两种相差一个氨基酸残基的defensin前体蛋白,并初步预测了两种前体蛋白的化学性质和二级结构,为该基因的重组表达奠定了基础。     

白纹伊蚊防御素基因的体外扩增及鉴定

目的 克隆白纹伊蚊的防御素基因并对其进行序列分析。方法 提取白纹伊蚊基因组DNA，根据埃及伊蚊防御素基因序列设计合成引物，PCR产物克隆到T载体中进行测序和分析。结果 从白纹伊蚊基因组DNA中扩增出了约375bP的片段，PCR产物经测序后与已发表的埃及伊蚊防御素基因比较，具有很高的同源性。结论 克隆了白纹伊蚊的防御素基因，为下一步蚊虫防御素蛋白的研究莫定了基础。     

大鼠输卵管特殊糖蛋白基因片段的扩增、克隆与序列分析

目的:大鼠输卵管特殊糖蛋白核苷酸序列的扩增、克隆及序列分析。方法:在Genebank中查找到已知的小鼠、金仓鼠、猪和人的输卵管特殊糖蛋白的基因序列并运用PrimerPremier5.0软件对这些输卵管特殊糖蛋白的基因序列进行同源性分析。依据同源性较大的保守区基因序列设计一对引物,并提取大鼠输卵管总RNA作为模板进行RTPCR,得到一条cDNA片段。将产物连接到T载体中,转化、扩增重组质粒。提取大肠杆菌中的重组质粒进行DNA测序。将DNA测序所得到的基因序列和已知的小鼠、金仓鼠、牛、羊及人的输卵管特殊糖蛋白的基因序列进行同源性分析。结果:利用RTPCR的方法扩增出一条120bp的目的基因片段,测序结果发现其和小鼠、金仓鼠、牛、羊和人的输卵管特殊糖蛋白的核苷酸序列的同源性分别为90%,90%,78%,87%。结论:本实验所获得的基因序列为目前尚未见报道的大鼠输卵管糖蛋白的基因序列的一部分。     

山东省HIV-1分离株env基因C2-V3区序列测定

①目的 了解山东省1型人类免疫缺陷病毒（HIV－1）的分子流行病学特征。②方法 应用套式聚合酶链反应扩增8例HIV－1前病毒基因组的env基因C2－V3区,扩增产物纯化后与pGEM-T载体连接,克隆于大肠杆菌中,提取阳性克隆的重组质粒进行测序,用PHYLIP软件分析核苷酸及氨基酸序列。③结果 8株HIV－1毒株V3环顶端的四肽基序均为GPGR,氨基酸变异不显著,各株间基因离散率为1.0%-5.2%,侧翼区碱基的变异频率明显高于V3区,并发现1例毒株出现双V3环现象。④结论 山东省的HIV－1分离株以B亚型HIV－1毒株为主,同时发现的双V3环变异现象,可能是HIV－1毒株逃避宿主免疫系统攻击的一种新模式。     

鼻咽癌患者血浆EB病毒DNA荧光定量PCR标准品的构建

目的: 构建检测鼻咽癌患者血浆EB病毒(人疱疹病毒4型)DNA的荧光定量PCR标准品。方法: 用EB病毒基因高度保守序列设计特异的引物和荧光探针,常规PCR法扩增目的片段,将纯化的PCR产物与PMD-18T载体进行连接,转化宿主菌DH-5α,然后用PCR初筛和测序分析证实目的片段克隆成功,提取重组质粒DNA,纯化质粒并检测260 nm吸光度,确定重组质粒拷贝浓度,并以此制备荧光定量PCR梯度浓度标准品。结果: PCR初筛及测序分析均证实EB病毒DNA重组到PMD-18T载体上。结论: 本试验成功克隆EB病毒DNA荧光定量PCR标准品。