DNA数目可变串联重复序列用于结核分枝杆菌分型研究

目的采用数目可变串联重复序列(VNTR)分型方法对安徽省的52株结核分枝杆菌进行分子分型研究,探讨该方法用于结核分枝杆菌分型的作用.方法设计引物,采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术对结核分枝杆菌13个VNTR位点进行检测,并通过BioNumerics 3.0软件进行DNA指纹图谱多态性分析.结果 52株结核分枝杆菌可分4个类别,其中88.5%菌株属于一个型,其他3个型所占比例很小,分别为5.8%、3.8%和1.9%.结论来自安徽的结核分枝杆菌存在主要的流行型,VNTR分型技术简便、快速,是较好的结核分枝杆菌分型方法.     

甘肃省临床分离结核分枝杆菌MLVA分型初步研究

目的随机选取2005-2007年间甘肃省肺科医院临床分离结核分枝杆菌菌株,通过多位点可变数目串联重复序列(Multiple locus variable numbers of tandemrepeats analysis,MLVA)分型,了解甘肃结核分枝杆菌流行菌株基因型情况。方法选择标化的15个VNTR位点,对临床分离菌株DNA进行检测,DNA指纹图谱使用Bio Numerics4.5软件进行统计分析,得出聚类分析结果。结果 228株结核分枝杆菌被分为4大基因群,7个大基因类型,分别包含13(5.7%)、3(1.3%)、7(3.1%)、1(0.4%)、171(75%)、31(13.6%)、2(0.9%)个株菌;在株水平基因分型上,93(40.8%)株为单菌株基因型;其余菌株基因型分别包含2-10株结核分枝杆菌,共构成132个基因簇。结论甘肃结核分枝杆菌菌株存在丰富的基因多态性,ML-VA方法具有较高的基因分型能力,可以满足结核分枝杆菌株水平DNA分型的需要。甘肃省结核分枝杆菌流行株主要为北京家族基因型菌株。     

四川省鼠疫耶尔森菌多位点可变数目串联重复序列基因分型及流行病学研究

目的 使用多位点可变数目串联重复序列分析方法对四川省鼠疫耶尔森菌进行基因分型研究,为四川省鼠疫防控提供科学依据.方法 选用14+12分级分型方案对四川省历年分离的132株鼠疫菌进行PCR扩增并计算重复拷贝数,通过Bio Numerics对各位点重复数进行聚类分析.结果 四川省青海田鼠鼠疫自然疫源地菌株可被分为5个群9个...     

多位点可变数量串联重复序列分析在北京家族结核分枝杆菌基因分型中的应用及位点筛选

目的对于北京家族菌株占绝大多数的感染人群,评价多位点可变数量串联重复序列（variable number tandem repeats,VNTR）分析（multiple loci VNTR analysis,MLVA）中不同位点组合在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,MTB）基因分型研究中的应用。并以IS6110限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）为参照,筛选有效位点。方法分别采用IS6110-RFLP、间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）及MLVA不同位点组合对北京海淀区收集的MTB临床分离株进行基因分型研究,比较3种方法及MLVA不同位点组合的分型效果。结果 45株MTB分离株中86.7%为北京家族菌株,Spoligotyping和结核分枝杆菌散在分布重复单位（mycobacterial interpersed repetitive units,MIRU）-12系列的HGI（Hunter-Gaston Index）值分别为0.4313和0.8700,将45株MTB菌株分为10个和23个基因型。VNTR-9系列和IS6110-RFLP的分型结果一致,HGI值较高,为0.9980,将45株MTB菌株分为43个基因型。结论北京家族结核分枝杆菌在北京海淀区呈高水平流行。对于北京地区北京家族菌株占绝大多数的感染人群,VNTR-9系列MLVA是较为简便和高分辨率的分型方法 ,其分辨率能够达到MTB基因分型＂金标准＂IS6110-RFLP水平。     

新疆结核分枝杆菌临床分离株VNTR基因型的初步研究

目的研究新疆结核分枝杆菌可变数目串联重复序列（variable number tandem repeats,VNTR）基因分型,初步了解其基因型多态性状况及主要流行株。方法在新疆维吾尔自治区胸科医院收集一个连续时间段的结核分枝杆菌临床分离菌株,采用多位点可变数目串联重复序列分析（the Multiple Loci VNTR Analysis, MLVA）方法进行基因分型研究。基因聚类分析采用BioNumerics 5.0数据库软件。结果共收集到结核分枝杆菌临床分离菌株175株,运用MLVA 175株菌可分为8个基因群（分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ）119种基因型,其中Ⅰ群所占比例最大,达69.14%,经与Spoligotyping结果综合分析,I群即是北京家族,Ⅱ群为CAS家族。结论新疆结核分枝杆菌临床菌株存在明显的VNTR基因多态性,主要流行菌株为VNTR Ⅰ群（北京基因型）,首次发现新疆临床菌株中存在CAS家族。     

以数目可变的串联重复序列和结核分枝杆菌散在分布重复单位为基础的基因分型方法在结核分枝杆菌流行病学研究中的应用

结核病是一种严重影响人类健康的传染病。全球有近1／3人口感染了结核分枝杆菌，主要分布在发展中国家。如果不能及时和有效地控制结核病传播，在今后20年内，发展中国家将会有2亿人罹患结核病。在我国，三分之一人口已感染结核分枝杆菌，受感染人数超过4亿，其中约有10％发生结核病。如果不采取有效的措施，在未来十年内预计有3000万人发生结核病。当前结核病控制面临的主要困难有：贫困人口的结核病发病率高、发现率低、耐药结核菌感染增多，而伴随着城市化过程的人口流动，     

多位点可变数目串联重复序列分析方法在布鲁杆菌病监测中的应用

目的 建立多位点可变数目串联重复序列分析方法(MLVA),并评价其在布鲁杆菌菌株鉴定及流行病溯源中的价值.方法 使用MLVA方法,对16株羊种菌、22株牛种菌、21株猪种菌和10株犬种菌株进行分析,使用BioNumerics(Version 5.0),对16个位点进行聚类分析,聚类方式用平均连锁聚类法(UPGMA).计算每个位点的差异指数,菌株的基因型通过MLVA2010数据库确定.结果 使用MLVA方法,通过Bruce06、Bruce08、Bruce11、Bruce12、Bruce42、Bruce43、Bruce45、Bruce55共8个位点可以区分布鲁杆菌的种;通过Bruce04、Bruce07、Bruce09、Bruce 16、Bruce30共5个位点可以对菌株进行溯源,确定菌株流行病学相关性.结论 MLVA技术是一种分辨率高且易于在省级疾病防控系统监测实验室使用的标准化分型技术,可以加强布病监测能力.     

30株牛源分枝杆菌分离株基因分型鉴定

目的 采用基因分型方法对30株分离自西北三省的牛源分枝杆菌分离株进行鉴定.方法 从西北三省的规模化奶牛场采集结核菌素(PPD)阳性奶牛的咽拭子和鼻拭子,经分离培养后,采用16S rRNA、MPT64以及多位点PCR进行菌株分型鉴定,利用数目可变串联重复序列分析(variable-number of tandem rep...     

220株结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型研究

目的了解结核分枝杆菌北京临床分离株的基因分型种类和特征,为结核病防治研究提供基础科学依据。评价两种分型方法在北京地区结核病分子流行病学中的应用。方法收集北京市结核分枝杆菌临床分离株,应用间隔区寡核苷酸分型(Spoligotyping)及多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)二种分型方法进行基因分型,结果聚类分析采用BioNu-merics(Version5.0)软件。结果共在北京地区收集到220株结核分枝杆菌临床分离株。采用Spoligotyping分型方法,220株菌可分为2个基因群,即北京家族(Beijing family)和非北京家族(non-Beijing family),20种基因型。其中北京家族含有202株菌,占91.82%。北京家族菌株中,典型北京家族菌株占95.05%(192/202),非典型北京家族占4.95%(10/202)。北京家族菌株的耐药率为22.55%(22/98),非北京家族菌株的耐药率为16.67%(1/6),两者间的差异无统计学意义(fisher analysis,P=0.5835>0.05)。采用MLVA分型方法,202株菌可分成5个基因群59种基因型,主要为Beijing family、China2和China3,分别占91.37%、2.73%和4.55%。结论北京地区结核分枝杆菌具有明显的基因多态性,其主要流行型为北京家族。北京家族菌株与耐药性无明显相关性。     

山东省局部地区结核分枝杆菌散在分布重复单位基因分型技术的应用

目的对结核分枝杆菌散在分布重复单位（mycobacterial interspersed repetitive units，MIRU）基因分型技术在山东省局部地区的应用进行评价。方法2004年2月至2006年6月，对山东省12个县级结核病防治所实验室分离培养的826株结核分枝杆菌，应用MIRU基因分型技术进行分型。结果826株结核分枝杆菌分为201种基因型，123个独特型，78个簇，最大簇基因型为223325173533。成簇的菌株中相对应的患者有流行病学接触史者18例。MIRU基因分型法分辨率为0．90，位点26显示相对较高多态性。该基因分型法的重复性为100％。完成1株菌株基因分型需要成本人民币约50元。结论MIRU基因分型技术的重复性好，快速、简单、经济，不需要昂贵的设备。不足之处是223325173533基因型菌株在山东是社会传播的优势菌群，占分离结核分枝杆菌的30．89％，需要通过二线分型方法IS6110限制性片段长度多态性基因分型技术或增加新的多态性较高的可变数目串联重复序列位点进一步提高分辨率。     

安徽省391株结核分枝杆菌临床分离株MLVA基因分型研究

目的 初步探讨安徽省结核分枝杆菌多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)的分型及分布特征。方法 选取安徽省结核分枝杆菌391株临床分离菌株,常规培养、收集菌体,提取基因组DNA,采用聚合酶反应（PCR）对15个VNTR位点进行检测分析,基因分型聚类分析采用BioNumerics 5.0软件。结果 经基因聚类分析,可分4个基因群(Ⅰ群、Ⅱ群、Ⅲ群和Ⅳ群),分别为Ⅰ群占3.32%（13/391）,Ⅱ群占3.07%（12/391）,Ⅲ群所占89.00%（348/391）,Ⅳ群占4.60%（18/391）;共含183个基因型,其中149株为独特类型,余242株分为34簇,其中最大的一簇包含64株（基因型为424343357333544）;研究显示明显的基因多态性,Mtub21和MIRU26位点显示较高多态性（h）,分别为0.591和0.527;ETR-B、ETR-C、ETR-D和MIRU23显示较低多态性,h分别为0.125、0.08、0.124和0.137;基因群分布与药敏间的差异无统计学意义(χ²值分别为0.22、0.00、0.01、0.07,P值均>0.05)。结论 初步证实安徽省结核分枝杆菌菌株存在明显的基因多态性,以Ⅲ型菌株为主,应加强对此型菌株流行的监控。     

结核病分子流行病学研究方法进展和探讨

结核病分子流行病学在结核病的控制方面有着良好的应用前景,发达国家已将其列入常规检查,在我国也有很好的应用前景和更大的应用空间.目前的基因分型的主流方法仍然是采用数目可变串联重复序列(VNTR)和间隔区寡核苷酸分型共同应用的模式.间隔区寡核苷酸分型是继IS6110限制性片段长度多态性(RFLP)之后应用于结核分枝杆菌基因分型最广泛的方法之一,目前被作为鉴定北京基因型菌株的标准方法.VNTR方法操作简便、快速,成本低廉,重复性好,便于不同实验室间相互比较;VNTR方法选用的位点在不同国家和地区会有不同,VNTR位点分辨率的高低也需要深入研究.IS6110-RFLP方法虽然已经不再大规模地使用,但是一直作为鉴定其他基因分型方法的正确率和准确度的金标准.随着分子生物学技术的进步,基因分型技术出现新的发展趋势.如长片段多态性(LSP)和单核苷酸多态性(SNP)方法是近几年出现的频率越来越高的分型方法.目前LSP和SNP方法的分辨率虽然不高,但在研究系统发育中确有很好的应用.系统发育学的研究一开始是采用VNTR-15和VNTR-24的方法,后来发现存在不确定性且误差较大,随着对LSP和SNP特性的了解更加全面,认为LSP和SNP是研究系统发育学的最好的方法.随着分子生物学技术的不断进步,结核病分子流行病学的研究将会为结核病的预防和控制提供更多支持和指导.     

江苏省67株结核分支杆菌MLVA分型分析

目的初步探讨江苏省结核分支杆菌的数目可变串联重复序列(VNTR)的分布特征。方法采用多位点串联重复序列(MLVA)分型方法,对从江苏省病人分离的结核分支杆菌的VNTR进行PCR扩增,2%琼脂糖凝胶电泳,通过BioNumerics3.0软件分析其VNTR的多态性和聚类分析。结果共选取了15个VNTR位点,对67株结核分支杆菌进行了检测分析,结果显示明显的基因多态性,可分8个基因型(Ⅰ～Ⅶ型),其中较多的一型菌株占32.6%,其他型别菌株数量较接近,没有特别明显的优势型别。结论江苏省结核分支杆菌具有明显的多态性,MLVA分型技术具有稳定、简单、可重复的优点,可用于结核分支杆菌的流行病学调查。     

5个VNTR位点用于我国三省65株结核分支杆菌菌株基因分型的研究

目的初步探讨我国结核分支杆菌的数目可变串联重复位点 (VariableNumberofTandemRepeat ,VNTR)的分布特征及其在基因分型中的应用。方法　选取结核分支杆菌基因组中的 5个VNTR位点 ,采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术 ,并应用BioNumerics(Version3.0 )软件进行处理 ,分析结核分支杆菌DNA中VNTR分布多态性。结果　检测分析的 6 5株结核分支杆菌具有明显的多态性 ,共分成 12个不同的型别 ,其中大部分菌株属于一个型 ,占 6 4 .6 % ,其他菌株呈散在分布。结论　我国结核分支杆菌的VNTR具有明显的多态性。VNTR分型技术具有简便、快速、特异、重复性好等优点 ,可广泛用于结核病的分子流行病学研究。     

Spoligotyping和MLVA用于71株浙江省结核分枝杆菌临床分离株基因分型的初步研究

目的初步探讨寡核苷酸分型(Spoligotyping)和多位点数目可变串联重复序列分析(MLVA)用于浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株的分型,以初步了解浙江省结核分枝杆菌的基因型特征。方法随机选取浙江省结核分枝杆菌临床分离菌株,常规培养,收集菌体,提取基因组DNA。采用聚合酶链反应(PCR)扩增整个DR区进行Spoligotyping分型,同时分别扩增15个VNTR位点进行MLVA分型。聚类分析采用BioNumerics软件。统计学分析采用卡方检验。结果对70株菌进行了基因分型,Spoligotyping结果显示,可分为2个基因群,即北京家族(Beijingfamily)和非北京家族(Non-Beijingfamily),分别占70和30,49株北京家族菌株中,89.8为典型北京家族;MLVA结果显示,可分4个基因群,分别为Ⅰ群占8.5,含5个基因型,Ⅱ群占18.3,含13个基因型,Ⅲ群占70.4,含38个基因型,Ⅳ群占2.8,含2个基因型。两种方法对菌株的基因分型结果非常吻合,Spoligotyping分型为北京家族的菌株均分布在MLVAⅢ型中,非北京家族菌株的基因多态性,分属于MLVAⅠ、Ⅱ和Ⅳ型。MLVA将70株菌分为58个基因型(含53个独特基因型),而Spoligotyping只分为18种基因型(含12个独特基因型)。结合对临床一线4种药物的耐药检测结果分析,两种方法的分型结果均显示北京家族菌株中表现为全敏感者71.4(35/49),表现为耐药者为28.6(14/49);而非北京家族菌株中表现为全敏感者为66.7,表现为耐药者为33.3,经卡方检验,两者间的差异无统计学意义(χ2=0.158,P>0.05)。结论初步证实浙江省结核分枝杆菌存在明显的基因多态性,主要流行型为北京家族。北京家族与耐药无明显相关性。MLVA株水平鉴定能力明显高于Spoligotyping,尤其是在鉴别北京家族菌株上具有明显的优势。     

中国炭疽芽胞杆菌中11个串联重复序列位点的特征和分布

目的检测炭疽芽胞杆菌中可变数量串联重复序列(VNTR)的变化,分析我国菌株中VNTR的特征和分布规律。方法 PCR扩增,琼脂糖电泳和毛细管电泳,测序验证,BLAST比对等。结果 11个VNTR位点中有4个在所有菌株中没有差别,另外7个位点只在个别菌株中检测到差别,有差别的菌株多分布在新疆;11个VNTR位点均位于基因编码区内,编码对细菌生存重要的蛋白和一些功能不明蛋白。结论结果提示新疆的菌株类型较复杂;本研究中的VNTR位点比较保守,可能不能用于区别不同的炭疽芽胞杆菌,但对于了解炭疽芽胞杆菌的基因组特征以及鉴定炭疽芽胞杆菌具有一定的作用。     

Identification of possible loci of variable number of tandem repeats in Mycobacterium tuberculosis.

Three VNTR loci were previously cloned from Mycobacterium tuberculosis in our laboratory. The VNTR sequences were used as queries to search for similar sequences in the GenBank database by the BLAST program. Direct and tandem repeats were identified visually. The search revealed 45 more loci of direct and tandem repeats. Comparison of the sequences to the ones in the genome sequence database of the M. tuberculosis CDC1551 strain revealed 22 different loci. Combining these results with previously reported experimental work, at least 24 loci should be polymorphic enough to be detected by simple PCR. The repeats are present both inside coding sequences and in intergenic regions on the 5' or 3' ends of genes. M. tuberculosis contains several VNTR. Studies of their functions may be useful for understanding the differences of phenotypes between strains.