人类GAD67基因扩增及pEGFP-C2-GAD67真核表达载体的构建

目的扩增人类谷氨酸脱羧酶（GAD）67基因，并构建pEGFP-C2-GAD67真核表达载体。方法应用基因重组技术，采用反转录PCR方法对来自人类脑组织cDNA中编码GAD67的基因片段进行扩增，插入PUC57克隆载体，经XhoⅠ和BamHⅠ双酶切出GAD67基因片段，再克隆入真核表达载体pEGFP-C2后构建pEGFP-C2-GAD67重组载体，经PCR扩增、酶切后测序鉴定。结果人类GAD67基因扩增产物大小为1785bp，编码594个氨基酸残基。重组真核表达载体经酶切鉴定表明为正确重组子，PCR正确扩增出目的条带。与GenBank中人类GAD67基因序列比较，核苷酸和氨基酸水平的同源性分别达99．78％和99．66％。结论人类GAD67基因克隆后，可成功构建真核表达载体pEGFP-C2-GAD67为进一步该基因转染神经干细胞移植治疗癫痫提供了实验基础。     

基于人脂肪组织获取基因构建pET28a-leptin(瘦素)重组子

目的：构建pET28a-leptin重组子。方法：取人脂肪组织,RT-PCR得到瘦素基因后通过DNA重组技术克隆至pMD18T载体与pET28a原核表达载体,EcoRⅠ+XhoⅠ双酶切及测序鉴定。结果：扩增得到520bp目的基因;所构建重组瘦素原核表达载体pET28a-leptin经双酶切电泳见520bp目的条带,DNA测序与相应基因序列同源性达100%。结论：成功构建pET28a-leptin重组子,为后续研究提供了基础和物质保障。     

空肠弯曲菌cdtA、cdtB及cdtC真核表达重组载体的构建与表达

目的以空肠弯曲菌(CJ)细胞扩张毒素(cytolethal distending toxi,CDT)cdtA、cdtB及cdtC为目的基因,构建CJ-cdtA、cdtB及cdtC基因的真核表达重组载体pcDNA3.1(+)-cdtA,pcDNA3.1(+)-cdtB,pcDNA3.1(+)-cdtC,为CJ核酸疫苗的研制提供实验材料。方法用Primer5.0软件分析GenBank中空肠弯曲菌细胞扩张毒素cdtA、cdtB及cdtC基因序列,设计合成相应特异性引物,引入EcoRI、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点,PCR扩增cdtA、cdtB及cdtC目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组体pcDNA3.1(+)-cdtA、pcDNA3.1(+)-cdtB及pcDNA3.1(+)-cdtC;通过酶切分析、PCR鉴定及测序鉴定,筛选阳性重组体。结果扩增出特异的cdtA、cdtB及cdtC基因片段,大小约为807bp、798bp、570bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了CJ真核表达重组载体pcDNA3.1(+)-cdtA、pcDNA3.1(+)-cdtB及pcDNA3.1(+)-cdtC。结论 PCR扩增得到了大小约为807bp、798bp、570bp的CJ-cdtA、cdtB及cdtC目的基因片段;并成功构建了pcDNA3.1(+)-cdtA、cdtB及cdtC真核表达重组载体。     

BDNF基因重组逆转录病毒表达载体pLEGFP-BDNF的构建与鉴定

目的构建脑源性神经营养因子(BDNF)基因重组逆转录病毒表达载体。方法根据 BDNF基因已知序列,设计合成一对引物并导入HindⅢ和BamH Ⅰ酶切位点;从大鼠海马组织提取总 RNA,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)获得编码BDNF的基因片段,与克隆载体pMD 18-T Simple连接构建pMDT-BDNF质粒;经HindⅢ、BamHⅠ双酶切,获得BDNF基因片断再克隆至逆转录病毒载体 pLEGFP-N1中构建重组质粒pLEGFP-BDNF。结果限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组子,测序结果证实与已知序列吻合。结论构建的重组逆转录病毒表达载体 pLEGFP-BDNF含有序列正确的大鼠BDNF基因,可以作为今后治疗老年性痴呆动物模型转基因实验的基因来源。     

携带DREAM基因小分子干扰RNA重组质粒的构建☆

背景：DREAM是一种多功能蛋白,在细胞中不同位置与不同靶蛋白结合,体外细胞培养和动物实验均证明DREAM参与了许多疾病的发病机制。 目的：构建携带DREAM基因的小分子干扰RNA重组质粒。 方法：设计并合成shRNA对应的两条互补的寡核苷酸链,pDC316-EGFP-U6质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切与退火后的寡核苷酸连接,转化感受态E.coli DH5α,获得阳性克隆进行PCR和测序鉴定。 结果与结论：经PCR、酶切及测序证实,重组质粒pDC316-EGFP-DREAM-shRNA-U6片段大小为473 bp,其中插入的片断序列和位点与预期完全一致,说明pDC316-EGFP-DREAM-shRNA-U6重组质粒构建成功。     

人重组pcDNA6.2/生长分化因子5质粒的构建及鉴定

背景：生长分化因子5是一种刺激肌腱、韧带塑型，增强愈合反应有效的生长因子，在活性组织工程肌腱构建中有重要作用。 目的：构建人重组pcDNA6.2/生长分化因子5质粒，为转染基质干细胞向肌腱诱导分化实验奠定基础。 设计、时间及地点：细胞基因工程体外实验，于2007-08/12在哈尔滨医科大学遗传学教研室和分子生物学教研室完成。 材料：根据Genbank（NM000557）中人生长分化因子5的序列化学合成一对引物,从人胎儿软骨组织提取总RNA。 方法：通过反转录-聚合酶链反应得到人生长分化因子5完整成熟肽基因。将所得基因片段插入克隆载体pcDNA6.2并转化入JM109菌株，提取重组质粒，PCR鉴定、酶切鉴定并测序。 主要观察指标：反转录-聚合酶链反应检测结果，PCR及SalⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定结果,重组质粒测序与Genbank中序列比较结果。 结果：电泳显示，反转录-聚合酶链反应产物为一长约380 bp的带，阳性克隆质粒经PCR电泳及双酶切均出现约380 bp的片段。测序表明与Genbank中的序列完全相符。 结论：成功构建出人重组pcDNA6.2/生长分化因子5质粒，为组织工程化肌腱过程中种子细胞的制备提供转染质粒。     

构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率

背景：超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel, HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势,成为目前最受关注的生物起搏备选基因。 目的：构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率。 设计、时间及地点：细胞-基因学体外实验,于2008-02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成。 材料：SD大鼠10只,由中山大学实验动物中心提供。携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5α由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存。腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司。 方法：质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ双酶切后回收HCN4片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,得到重组穿梭质粒;I-Ceu Ⅰ+I-Sce Ⅰ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4,回收CMV-HCN4片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后,应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒AdHCN4;应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：重组腺病毒质粒载体的鉴定,重组腺病毒的鉴定及滴度测定,重组腺病毒的感染效率。 结果：构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+Xho Ⅰ双酶切,得到大小为3 600 bp(HCN4)和5 100 bp (pShuttle-CMV)两个片段,DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中;重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用XhoⅠ酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;重组腺病毒AdHCN4 PCR鉴定可见657 bp的阳性扩增条带;经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×1011PFU/mL。成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数值为800,转染效率最高,达90%。 结论：实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞。     

神经轴突运动蛋白Kif1a启动子基因全长序列报告基因载体构建

目的克隆Kif1a启动子区基因全长序列,构建并鉴定Kif1a启动子全长序列荧光素酶报告基因载体p GL3-Kif1a。方法以含Kif1a启动子基因全长序列的基因片段(2565 bp)的重组p GEM-T easy载体为模板,用含有酶切位点的特异性引物扩增出Kif1a启动子基因全长序列1853 bp,克隆至荧光素酶表达载体p GL3-basic,构建含正确目的基因的表达载体p GL3-Kif1a,行Sac I和Xho I酶切、PCR及测序鉴定;并以该质粒转染小鼠SCG细胞进行活性检测。结果酶切、PCR及序列测定表明,克隆获得的1853 bp与Gen Bank DNA序列数据库对比分析序列一致,插入方向正确;且p GL3-Kif1a启动子在小鼠SCG细胞中有明显转录活性。结论成功构建了Kif1a启动子基因全长序列荧光素酶报告基因载体,为下一步研究Kif1a启动子的活性分析、基因表达调控机制及其信号转导通路等研究奠定了基础。     

pcDNA3/BDNF真核表达载体的构建☆

背景：脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)作用广泛,但属于生物大分子,不能通过血脑屏障。基因治疗是目前解决脑源性神经营养因子给药途径最有希望的方案。 目的：拟构建大鼠脑源性神经营养因子基因真核表达载体。 方法：采用反转录聚合酶链式反应技术从SD大鼠脑组织提取总RNA,扩增脑源性神经营养因子基因cDNA序列,并将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,分别取10 g质粒pcDNA3和纯化的目的基因分别进行EcoR Ⅰ、xho Ⅰ双酶切。将目的基因片段和pcDNA3载体连接,转入感受态DH5α细胞中,经酶切鉴定后送上海博亚生物技术有限公司测序。 结果与结论：RT-PCR产物为749 bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/BDNF酶切后产生 749 bp和5 446 bp的片段,DNA测序证实749 bp片段的碱基序列与大鼠脑源性神经营养因子基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/BDNF重组质粒。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL的构建及鉴定*☆

背景：FasL通过与靶细胞上Fas结合诱导程序性细胞死亡，可维持机体内稳态，诱导同种异基因移植免疫耐受，促进肿瘤细胞凋亡。 目的：构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因hFasL的真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL。 方法：通过实时聚合酶链反应RT-PCR方法从人外周血淋巴细胞中扩增出hFasL基因，与真核空载体 plRES2-EGFP一起，经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切，T4 DNA连接酶连接，从而构建pIRES2-EGFP-hFasL。用紫外分光光度计测定质粒浓度及纯度，经酶切、PCR技术、基因测序等方法进行鉴定。 结果与结论：扩增出的hFasL条带大小约846 bp，构建的plRES2-EGFP-hFasL经酶切后在846 bp和2 000 bp处有特异性条带，DNA测序证实hFasL与Genebank上的序列完全一致。提示成功构建了含有hFasL及EGFP的真核表达载体plRES2-EGFP-hFasL。     

NOV基因真核表达载体的构建及在大鼠真皮多能干细胞中的表达

目的 构建肾母细胞瘤过度表达(NOV)基因真核表达载体并检测其在真皮多能干细胞中的表达. 方法 利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)方法,以新生大鼠大脑组织总RNA为模板,扩增出1 178bp的NOV基因的cDNA编码区序列,然后用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切后定向克隆入真核表达载体pEGFP-N1质粒中,用脂质体法将重组质粒转染入大鼠真皮多能干细胞中,荧光显微镜观察转染产物,RT-PCR法检测转染细胞中NOV基因表达. 结果 NOV基因cDNA正确克隆到真核表达载体pEGFP-N1质粒中;重组质粒体外转染入大鼠真皮多能干细胞后,可见转染细胞有绿色荧光表达.转染细胞中检测到NOV基因. 结论 构建成功NOV基因重组质粒,并能在大鼠真皮多能干细胞中稳定表达,为NOV基因及真皮多能干细胞的作用研究提供了有利的分子工具.     

pDsRed-C1-CDNF真核表达载体在大鼠骨髓间质干细胞中的表达*

背景：骨髓间质干细胞是一类具有多向分化能力的成体干细胞,目前,已有将其作为细胞载体对帕金森病进行治疗的相关报道。 目的：构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体,并诱导其在大鼠骨髓间质干细胞中表达。 方法：通过RT-PCR的方法从小鼠组织中扩增出CDNF基因片段,并在其两端引入Xho I、BamH I限制性内切酶酶切位点,然后将其克隆至pDsRed-C1真核载体,构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体,并通过Lipofectin2000将其转染至大鼠骨髓间质干细胞中。 结果与结论：pDsRed-C1-CDNF真核表达载体经双酶切、单酶切、PCR及测序验证正确,提示已成功构建pDsRed-C1-CDNF真核表达载体并已转染至大鼠骨髓间质干细胞中。     

构建携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的重组反转录病毒表达载体pLXSN-Kozak-EGFP及鉴定

背景：增强型绿色荧光蛋白作为报告基因可在活细胞中表达发光蛋白。研究表明通过促进表达增强的Kozak序列可促进基因编码的蛋白质在真核细胞中的表达。 目的：构建含增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,并对此重组载体进行鉴定。 方法：用聚合酶链反应方法从含增强型绿色荧光蛋白基因的表达载体pEGFP-N1上高保真克隆出EGFP基因,通过分子克隆技术将目的基因重组至反转录病毒表达载体pLXSN。用菌斑快速聚合酶链法筛选阳性重组子,针对目的基因插入载体的方向设计鉴别插入方向的引物,用聚合酶链反应法、限制性酶法鉴定目的基因及连接的正向性,并对pLXSN-Kozak-EGFP重组载体进行DNA测序分析。 结果与结论：从pEGFP-N1载体中克隆出上游含Kozak序列的EGFP基因,目的条带大小约750 bp。构建的pLXSN-Kozak-EGFP重组子经菌落PCR鉴定,750 bp处有特异性条带。插入方向经PCR鉴定,350 bp处有特异性条带。限制性内切酶法鉴定,750与6 000 bp处有特异性条带。DNA测序比对结果表明克隆的目的基因与Kozak-EGFP一致性为100%。结果提示实验成功构建了含EGFP报告基因与促进表达增强的Kozak序列的pLXSN-Kozak-EGFP重组反转录病毒表达载体,且插入方向为正向。     

pcDNA3-hNGFb真核表达载体的构建及其表达

目的构建人神经生长因子β（NGF-β）基因真核表达载体并观察其在L929细胞内的表达。方法以RT-PCR从人脑组织总RNA中扩增NGF-βcDNA,将其克隆到真核表达载体pcD-NA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以Lipofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定NGF-β在细胞内的表达。结果RT-PCR产物为750bp的特异片段,重组质粒pcDNA3-hNGFb酶切后产生750bp和5.2kb的片段,DNA测序证实750bp片段的碱基序列与人NGF-βcDNA完全一致。将其转染L929细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明NGF-β及其前体proNGF-β能在真核细胞中正确表达。结论成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3-hNGFb,为后续的研究奠定基础。     

构建携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因腺病毒表达载体在骨髓基质干细胞中的表达

血管内皮生长因子具有促进血管生成的作用,在骨缺损的治疗研究中运用较多,但其异构体VEGF121的研究较少。 目的：构建携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体并观测其在骨髓基质干细胞中的表达。 方法：以pTG19T-VEGF121为模板利用PCR技术突变VEGF121基因以去除VEGF121基因中终止密码子,之后在基因序列前后分别加入NotⅠ和XhoⅠ酶切位点,并将得到的基因亚克隆至pMD19-T质粒上,双酶切pMD19-T-VEGF121和pShuttle-CMV-IRES- hrGFP-1质粒,凝胶回收小片段和大片段,后进行连接反应,完成穿梭质粒的构建。重组病毒物理滴度测定后感染骨髓基质干细胞,在荧光显微镜下观察荧光强度。 结果与结论：经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功, 荧光显微镜下观察表明, 感染重组腺病毒的骨髓基质干细胞有明显的绿色荧光表达。可见构建的携带VEGF121-FLAG和hrGFP-1基因的腺病毒表达载体可在真核细胞表达, 有可能用于缺血性疾患的基因治疗。     

pcDNA3.1(+)GDNF真核表达载体的构建及其在真核细胞中的表达

目的：构建pcDNA3.1( )胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达。方法：将GDNF逆转录聚合酶链 式反应（RT－PCR）产物克隆至pcDNA3.1( ）真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以FuGene6介导法转染真核细胞,了解其在细胞内的表达及春表达蛋白折生物学活性。结果：RT－PCR产物为640bp特异性片段,pcDNA3.1( )GDNF重组体经酶切后分别出现640bp和300bp片段,测序分析与文献报道结果完全一致,表明重组pcDNA3.1( )GDNF表达质粒克隆成功,可见pcDNA3.1( )GDNF质粒在真核动物细胞中得到表达,GDNF蛋白能刺激含多巴胺的细胞生长,表明重组质粒能在真核动物细胞中出具有活性的GDNF蛋白。结论以FuGene6介导pcDNA3.1( )GDNF质粒传染真核细胞为基因治疗帕金森病奠定了一定基础。     

构建胶质原纤维酸性蛋白原核表达载体及蛋白表达鉴定

背景：胶质原纤维酸性蛋白在神经损伤的发生发展过程中具有重要作用。 目的：对胶质纤维酸性蛋白进行基因克隆,构建原核表达质粒并加以鉴定。 设计、时间及地点：单一样本观察,于2008-09/11在上海市长征医院神经外科实验室完成。 材料：中间载体pGEM-T Easy质粒购于Promega 公司,原核表达质粒pGEX-4T-2由上海市长征医院神经外科实验室保存。 方法：从人脑胶质瘤组织提取mRNA, 采用反转录-聚合酶链反应的方法扩增胶质纤维酸性蛋白序列并表达,然后与载体pGEX-4T-2连接,转化宿主菌BL21构建重组质粒,诱导表达后纯化,Western-blot鉴定。 主要观察指标：总RNA鉴定结果,聚合酶链反应扩增产物分子质量的鉴定,重组表达载体的酶切鉴定,Western-blot鉴定。 结果：抽提肿瘤组织总RNA后,电泳清晰可见rRNA28S、18S、5S 3条带。且总RNA的A260nm/A280 nm值为1.903。聚合酶链反应结果显示,在约1 300 bp左右有一条特异性条带,与预期的胶质原纤维酸性蛋白基因大小一致。重组表达载体的酶切鉴定及测序结果与GenBank的胶质原纤维酸性蛋白序列一致,经Western-blot验证为目的蛋白。 结论：用双酶切、DNA测序与Western-blot的方法证实原核表达载体构建成功。     

中国人胶质细胞源神经营养因子基因的克隆及测序

目的 为了克隆中国人胶质细胞源神经营养因子（GDNF）基因，从而为开发重组人GDNF治疗神经变性疾病打下基础。方法 根据从GeneBank中调出的人GDNF基因全序列设计引物，以中国人外周血白细胞提取的基因组DNA为模板，通过PCR扩增出中国人GDNF基因片段，克隆到pGEM-T载体上，进行序列分析。结果 我们得到的一种425bp DNA片段。经与GeneBank中已注册的GDNF基因片段，克隆到pGEM-T载体上，进行序列分析。结果 我们得到的一种425bp DNA片段。经与GenBank中已注册的人GDNF基因比较，序列完全相同。结论 正确的中国人的GDNF基因已克隆成功。     

人14-3-3β蛋白的原核表达、抗血清制备及真核表达载体的构建

目的 纯化原核表达的14-3-3β(YWHAB)重组蛋白并制备多抗血清,构建适用于哺乳动物细胞的真核表达载体.方法 将重组蛋白表达载体pET30a(+)/YWHAB转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,镍-四齿螯合剂(Ni-NTA)亲和层析柱纯化重组蛋白;以纯化的重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,应用ELISA和Western blot方法分别检测抗血清的效价和特异性;应用PCR扩增添加BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点把YWHAB的ORF亚克隆至真核表达载体pEGFP-N1,添加BamH Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点把YWHAB的开放阅读框(ORF)亚克隆至真核表达载体pCDNA3.1(+),对重组载体进行酶切和PCR鉴定.结果 YwHAB重组蛋白以可溶性形式表达,分子量为32 000,与预期分子量一致;纯化后的重组蛋白纯度达90%以上,ELISA结果显示其抗血清的效价为1:50 000,Western blot结果表明抗血清的特异性较好;酶切和PCR鉴定结果表明真核表达载体pEGFP-N1/YWHAB和pCDNA3.1(+)YWHAB构建成功.结论 通过亲和层析纯化获得人14-3-3β重组蛋白,进而免疫BALB/c小鼠制备多抗血清,为进一步研究人14-3-3β的功能成功构建了其真核表达载体.     

重组腺病毒载体pAdeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-β-NGF的构建和鉴定

目的构建携带绿色荧光蛋白(GFP)标记的小鼠β-NGF重组腺病毒载体。 方法利用RT-PCR法从小鼠颌下腺总mRNA中扩增β-NGF全长cDNA片断,定向克隆于腺病毒穿梭质粒pAdtrack-CMV(已标记绿色荧光蛋白)中;在细菌中与缺陷型腺病毒基因组pAdeasy-1进行同源重组,构建Adeasy- 1/pAdtrack-CMV-GFP-β-NGF载体,并进行酶切鉴定。 结果成功获得小鼠-NGF全长扩增片段;pAdTrack-CMV-β-NGF测序验证含有目的基因;双酶切鉴定成功构建重组pAdTrack-CMV-β-NGF质粒;限制性内切酶的酶切分析结果证明成功构建同源重组的Adeasy-1/pAdtrack-CMV-GFP-β-NGF载体。 结论本实验所用方法可高效、安全构建腺病毒载体pAdeasy- 1/pAdtrack-CMV-GFP-β-NGF。