RNA干扰下调HE4基因表达对人卵巢癌SK-OV-3细胞增殖和侵袭的影响

目的应用RNA干扰技术下调人附睾蛋白HE4基因表达水平,观察HE4对人卵巢癌SK-OV-3细胞增殖和侵袭能力的影响。方法化学合成3对HE4特异性小分子干扰RNA(siRNA),脂质体法转染人卵巢癌细胞系SK-OV-3(HE4-siRNA组),同时以非特异序列siRNA转染的SK-OV-3细胞(阴性对照组)和正常培养的SK-OV-3细胞(正常对照组)为对照,于转染后48 h,采用实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)和Western blot方法分别检测HE4 mRNA及蛋白表达水平。采用CCK8试剂盒检测卵巢癌细胞增殖活性的变化,穿膜小室模型测定HE4对细胞侵袭能力的影响。结果与正常对照组相比,HE4-siRNA转染卵巢癌SK-OV-3细胞48 h后,HE4 mRNA的表达水平显著下降,仅为正常对照组的12.7%(P<0.01),与之相应HE4蛋白表达也显著下降,而转染非特异序列的阴性对照组与正常对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。HE4-siRNA下调卵巢癌SK-OV-3细胞HE4表达后,细胞增殖受到明显抑制,细胞增殖活性仅为正常对照组的60%,阴性对照组细胞增殖未见明显变化。体外侵袭实验显示,HE4-siRNA组穿膜细胞数为每视野(21.8±2.86)个,显著低于正常对照组(187.4±11.17)个(P<0.01)和阴性对照组(177.8±9.76)个(P<0.01),而阴性对照组和正常对照组两组之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论 HE4特异性siRNA能成功下调SK-OV-3细胞中HE4基因的表达,显著降低卵巢癌细胞增殖和侵袭能力,HE4有可能成为人卵巢癌侵袭转移防治的重要靶点。     

shRNA沉默β-catenin基因表达对人食管癌细胞生物学特性的影响

目的 构建稳定抑制β-catenin表达的食管癌细胞克隆,观察shRNA介导的β-catenin基因沉默对人食管癌细胞生物学特性的影响,为以β-catenin为靶的食管癌基因治疗提供理论和实验依据.方法 通过细菌转化、酶切、测序鉴定和基因重组等方法构建针对β-catenin的RNA干扰质粒pGen-3-CTNNB1和阴性对照质粒pGen-3-con.利用脂质体介导转染技术转染人食管癌细胞系Eca-109,经G418筛选得到稳定抑制β-catenin表达的食管癌细胞模型(pGen-3-CTNNB1细胞);逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、细胞免疫荧光和Western blot检测RNA干扰组(pGen-3-CTNNB1)、阴性对照组(pGen-3-con)及未转染组(Eca-109)3组细胞中β-catenin的表达;建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察抑制β-catenin表达在活体内对肿瘤细胞生长能力的影响,免疫组织化学检测移植瘤组织中β-catenin的表达水平;体外浸润实验、迁移实验检测各组细胞的侵袭转移能力.结果 成功构建了针对β-catenin基因的RNA干扰载体pGen-3-CTNNB1,建立了稳定抑制β-catenin基因表达的食管癌细胞模型;与阴性对照组[(1.18±0.13)g]和未转染组[(1.38±0.21)g]比较,RNA干扰组[(0.42±0.09)g]移植瘤重量明显减轻(P＜0.05);瘤组织中β-catenin的表达水平明显降低;抑制β-catenin基因表达后,食管癌细胞的浸润能力显著降低,阴性对照组浸润细胞数为(81±5)个/HPF、未转染组为(77±6)个/HPF、RNA干扰组为(41±4)个/HPF(P＜0.01);迁移能力也显著下降,阴性对照组迁移细胞数为(73±5)个/HPF、未转染组为(69±5)个/HPF、RNA干扰组为(38±4)个/HPF(P＜0.05).结论 在人食管癌细胞Eca-109中存在β-catenin表达异常和Wnt信号通路的异常激活,抑制β-catenin基因的表达可以在裸鼠体内显著抑制食管癌细胞的生长,并降低其侵袭转移的能力.     

蛋白激酶Cε对肝癌SK-Hep-1细胞生物学行为的影响*

 目的：使用小干扰RNA（siRNA）抑制人肝癌SK-Hep-1细胞中蛋白激酶Cε（PKCε）的表达并对抑制效果进行测定,检测沉默后SK-Hep-1细胞增殖和侵袭能力的变化。方法：培养SK-Hep-1细胞,分为PKCε-siRNA组、阴性对照（NC-siRNA）组和未行处理（control）组。采用MTT比色法观察各组细胞增殖能力的变化,采用Transwell法观察各组细胞侵袭能力的变化,Western blotting观察细胞核增殖抗原Ki67、基质金属蛋白酶 9（MMP-9）等功能蛋白的表达,萤光素酶报告基因检测NF-κB信号通路的活性。结果：与对照组相比,PKCε-siRNA组PKCε mRNA和蛋白表达水平都明显降低（P＜0.01）,Ki67和MMP-9蛋白表达水平降低,细胞增殖能力明显降低（P＜0.01）,PKCε-siRNA组穿过Transwell膜的细胞少于对照组（P＜0.01）,且NF-κB转录活性下降（P＜0.01）。结论：通过siRNA技术降低PKCε表达可抑制肝癌SK-Hep-1细胞增殖及其侵袭能力,其抑制作用可能与抑制NF-κB通路的转录活性有关。     

鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白基因影响高转移人前列腺癌细胞体外生物学行为的机制探讨

目的 探讨鞘糖脂微结构域1相关磷酸化蛋白(PAG1)基因对高转移人前列腺癌细胞系PC-3M-1E8细胞体外生物学行为影响的机制.方法 异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导JM109细菌中GST-Raf1-Ras结合域(GST-Raf1-RBD)融合蛋白的表达,其中Raft-RBD能特异性的与活性Ras(GTP-Ras)结合,聚丙烯酰胺凝胶电泳和考马斯亮蓝染色观察融合蛋白诱导表达结果.GST-pull down实验检测稳定转染PAG1基因、转染空载体及未转染的PC-3M-1E8细胞中活性Ras水平.Western blot检测Ras信号通路相关蛋白表达变化.用异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)耦联的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白,激光扫描共聚焦显微镜观察肿瘤细胞形态和细胞内F-肌动蛋白排列变化.收集人前列腺及前列腺腺癌组织标本,通过免疫组织化学PV9000法检测PAG1蛋白的表达.结果 GST-Raft-RBD融合蛋白诱导表达结果显示,经IPTG诱导后在相对分子质量约33 000处出现较亮的GST-Raf1-RBD融合蛋白条带.GST-pull down结果显示PC-3M-1E8细胞稳定转染PAG1基因后,活性Ras蛋白表达明显减少,总Ras蛋白表达无明显变化.Western blot检测结果显示PC-3M-1E8细胞稳定转染PAG1基因后,磷酸化胞外信号调节激酶(ERK)表达明显减少,总ERK表达无明显变化;细胞周期素D1(cyclin D1)表达明显减少;p21WAF1/CIP1蛋白及磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表达无明显变化.TRITC耦联的鬼笔环肽标记F-肌动蛋白结果显示稳定转染PAG1基因的PC-3M-1E8细胞F-肌动蛋白骨架结构紊乱,丝网状结构不明显,细胞呈长梭形,细胞表面伪足明显较少.免疫组织化学检测结果显示正常前列腺组织PAG1蛋白表达阳性率较高,前列腺腺癌组织中随着Gleason分级的增加,PAG1蛋白表达阳性率降低.结论 PC-3M-1E8细胞中PAG1表达上调能降低Ras活性,抑制ERK活化,进一步抑制cyclin D1的表达而引起细胞周期阻滞,抑制细胞增殖.PAG1表达上调可引起PC-3M-1E8细胞运动、侵袭和转移能力降低.正常前列腺组织中PAG1蛋白表达阳性率较高,前列腺腺癌组织中PAG1蛋白的表达与肿瘤细胞的分化程度及恶性程度相关.     

siRNA特异性沉默hTERT基因对人结肠癌LoVo细胞生物学行为的影响

目的:探讨靶向端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的siRNA抑制人结肠癌LoVo细胞生物学行为的影响和机制。方法:构建针对hTERT基因的siRNA(pU6-hTERT-siRNA),LipofectamineTM2000转染LoVo细胞,以同源性的pU6作阴性对照,以未转染的细胞作空白对照。MTT法检测细胞生长率。建立裸鼠结肠癌皮下移植瘤模型,瘤内注射法将pU6-hTERT-siRNAs、pU6转导,观察各组移植瘤生长情况。RT-PCR和荧光定量PCR检测细胞株和移植瘤细胞hTERTmRNA水平的变化。Western blotting检测hTERT蛋白水平的变化。结果:LoVo细胞转染pU6-hTERT-siRNA72 h后,细胞增殖抑制率达42.1%,显著高于阴性对照组(3.2%),P0.01。裸鼠皮下移植瘤转染pU6-hTERT-siRNA14 d后,种植瘤体积为(85.9±18.7)mm3,显著小于阴性对照组[(157.4±55.6)mm3]和空白对照组[(155.2±54.2)mm3],P0.01。荧光定量PCR和Western blotting结果显示转染pU6-hTERT-siRNA后,细胞株和移植瘤内的hTERT mRNA以及细胞株蛋白水平表达显著减少(P0.01),阴性对照和空白对照间无显著差异。结论:pU6-hTERT-siRNA在体内外能有效抑制结肠癌LoVo细胞中hTERT基因表达,对裸鼠皮下结肠癌细胞移植瘤有明显的抑制生长作用。     

靶向着丝粒蛋白A的小RNA干扰对肝癌细胞株HepG2细胞生物学行为的影响

目的 研究靶向着丝粒蛋白A(CENP-A)的siRNA对肝癌细胞株HepG2细胞生物学行为的影响.方法 设计并合成三对CENP-A编码基因的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,通过定向克隆至载体pSilencerTM 2.1-U6 neo,构建siRNA真核表达质粒,经稳定转染HepG2细胞后检测肝癌细胞中CENP-A基因mRNA及蛋白质表达的抑制情况;通过观察HepG2细胞生长、凋亡、细胞周期和平板克隆形成能力评价CENP-A基因干扰对细胞生物学行为的影响;通过检测bcl-2、Bax、p21waf1、mdm2、p53蛋白表达水平初步探讨CENP-A生物学作用的可能机制.结果 三对靶向CENP-A的siRNA干扰片段中有二对抑制效果明显.与未转染组及空载体组相比,转染CENP-A干扰片段的细胞生长减慢,平板克隆形成率下降.细胞周期检测显示,G1期阻滞(P＜0.01),S期细胞比例减少(P＜0.001).细胞凋亡比例增加(P=0.003),并伴随bcl-2蛋白表达明显下降(P=0.000),Bax蛋白表达明显增高(P=0.001).还可致p21waf1表达增高,mdm2表达下降,但对野生型p53表达未显示明显影响.结论 CENP-A通过参与细胞周期调控而密切相关于细胞恶性增殖和凋亡抑制,其机制可能涉及野生型p53非依赖性通路和凋亡相关基因bcl-2Bax的表达异常.     

CXCL12／CXCR4对胰腺癌细胞生物学行为的影响

目的探讨CXCLl2／CXCR4生物轴对胰腺癌细胞增殖、侵袭等生物学行为的影响。方法体外培养胰腺癌细胞系Miapaca-2,将其分为对照组、CXCLl2组和AMD3100组。（1）采用RT—PCR检测胰腺癌细胞中CXCLl2、CXCR4、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和人尿激酶型纤溶酶原激活物（uPA）mRNA的表达水平;（2）采用CCK-8法检测各组细胞的增殖情况;（3）采用Transwell侵袭实验检测CXCLl2／CXCR4对胰腺癌细胞趋化活性的影响。结果胰腺癌细胞系Miapaca-2中CXCLl2mRNA未见表达,而CXCR4mRNA在胰腺癌细胞中有表达。MMP-2、MMPO和uPAmRNA在AMD3100组、对照组和CXCLl2组中的表达水平呈递增趋势,差异具有统计学意义（P〈0．05）。胰腺癌细胞的增殖和侵袭能力在CXCLl2组明显增强,而在AMD3100组得到了有效的抑制,组间差异有统计学意义（P〈0．05）。结论趋化因子CXCLl2及其受体CXCR4所构成的生物轴对胰腺癌细胞的增殖和侵袭能力发挥着重要的作用。     

HE4基因表达载体的构建及对卵巢癌细胞HO8910生长侵袭的影响

目的探讨卵巢癌基因HE4对卵巢癌细胞增殖及侵袭能力的影响。方法构建针对HE4基因的PcDNA3．1／HE4载体．脂质体法介导PcDNA3．1／HE4载体转染人浆液性卵巢癌细胞系HO8910,WESTERN—BLOT检测转染前后细胞内HE4蛋白的表达效果。用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法、平板克隆形成实验观察HE4基因对细胞增殖能力的影响,经细胞粘附实验、体外侵袭力实验比较转染前后细胞侵袭能力的变化。结果Western-blot结果显示PcDNA3．1／HE4载体成功转染HO8910细胞并显著提高该细胞HE4基因的表达,细胞增殖能力较前无明显变化,侵袭能力明显下降。结论通过增强HE4基因表达,可降低其侵袭能力,有望成为卵巢癌基因治疗的新的候选基因。     

RNA干扰端粒酶活性对HeLa细胞生物学行为的影响

目的 观察RNA干扰(RNAi)体外培养的HeLa细胞端粒酶催化亚单位(hTERT)对HeLa细胞生物学行为的影响,进一步探讨端粒酶活性与肿瘤细胞恶性生物学行为的相关性.方法 体外转录法设计合成4条针对hTERT基因的shRNA,脂质体转染HeLa细胞后经免疫荧光染色和端粒重复序列扩增-酶联免疫法(TRAP-ELISA)测定端粒酶活性,筛选出端粒酶沉默效果最佳片段即B链shRNA.以B链shRNA转染HeLa细胞为实验组,转染无关siRNA的HeLa细胞为对照组,显微镜下观察细胞在纤维黏连蛋白(FN)上的铺展;CCK-8细胞计数试剂盒检测细胞在FN上黏附;划痕实验评价细胞迁移;Boyden小室侵袭实验检测细胞侵袭能力.结果 铺展实验显示细胞接种到FN上30 min时,对照组铺展细胞的比率为(31.3±7.9)%,而实验组铺展细胞的比率仅为(5.6±2.3)%,两组差异有统计学意义(P<0.01);2 h后对照组和实验组铺展细胞的比率分别为(79.4±4.8)%和(26.3±6.1)%,两组差异仍有统计学意义(P<0.01);24 h后两组所有细胞几乎均呈铺展状态.细胞黏附实验显示细胞在FN上黏附30 min时对照组细胞黏附率为(83.7±5.4)%,而实验组的细胞黏附率为(67.2±2.8)%,明显低于对照组(P<0.05).划痕实验检测细胞的迁移能力显示实验组细胞24 h迁移率为(27.1±6.2)%,明显低于对照组(58.7±15.0)%.Boyden小室侵袭实验显示在Matrigel胶上培养4 h后,实验组和对照组侵袭的细胞数分别为75.7±14.5和165.1±11.0,差异有统计学意义(P<0.05).结论 降低体外培养HeLa细胞的端粒酶活性使细胞的生物学特性发生改变,表现为减低了HeLa细胞的恶性生物学行为.     

RNA干扰阻抑Bax inhibitor-1(bi-1)基因表达对卵巢癌细胞凋亡的影响

目的： 研究RNA干扰(RNAi)效应对人卵巢癌细胞株HO8910PM和HO8910中bi-1基因表达的抑制作用和凋亡诱导作用。 方法： 把表达bi-1 shRNA的各重组干扰质粒转染到HO8910PM和HO8910细胞中,RT-PCR和Western blotting法检测bi-1基因mRNA和蛋白表达水平;流式细胞术和Hoechst 33258/PI荧光染色检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果：与对照组细胞相比较,转染4种候选干扰质粒组细胞中bi-1的mRNA和蛋白表达水平均明显下降（P<0.05）,以转染pmU6-b4组细胞的表达抑制率最高,在HO8910PM细胞中的抑制率分别为 (45.50±3.04）%和(51.08±4.96）%,在HO8910细胞中的抑制率分别为 (37.29±3.69）%和(44.96±4.28）%;流式细胞术结果表明,与对照组细胞相比较,转染pmU6-b4质粒24 h、48 h、72 h、96 h的HO8910PM细胞中亚二倍体峰比值明显升高 (P<0.05),以转染72 h组细胞的比值最高,达到 (25.89±5.63）%,而HO8910细胞中无亚二倍体峰出现;荧光显微镜下可见转染pmU6-b4质粒72h的HO8910PM细胞出现细胞核缩小、染色质固缩和核断裂,而HO8910细胞核无明显变化。 结论： 针对bi-1的siRNA能特异有效地下调HO8910PM和HO8910细胞中bi-1基因的表达,不同序列特异性的siRNA下调bi-1基因表达的能力不同;瞬时转染质粒pmU6-b4能有效诱导HO8910PM细胞凋亡,但不能诱导HO8910细胞凋亡。     

B7-H4基因对SKOV3细胞生长功能的影响

目的： 初步探讨B7-H4基因对人卵巢癌细胞株SKOV3细胞生长和致瘤性的影响。方法：RT-PCR法扩增编码基因, 构建真核表达载体PEGFP-N1/B7-H4,以脂质体为载体将重组质粒PEGFP-N1和PEGFP-N1/B7-H4分别导入SKOV3细胞中,筛选建立高表达的细胞株。MTT法绘制体外培养细胞生长曲线,将转染前后的肿瘤细胞分别接种于SCID小鼠的腹部皮下观察其致瘤性。结果：成功构建了人B7-H4真核表达载体,SKOV3/B7-H4细胞高表达B7-H4,转染后肿瘤细胞体外生长速度明显增快。SKOV3/B7-H4细胞在小鼠体内的致瘤性较SKOV3/neo细胞和野生型SKOV3细胞明显升高。结论： B7-H4基因导入细胞后在体外和体内具有明显加快肿瘤生长的作用,可作为肿瘤基因治疗的靶向基因。     

RNA干扰抑制EphA2癌基因在结肠腺癌HCT-8细胞系中的表达

目的利用RNA干扰（RNAi）技术抑制EphA2癌基因在结肠腺癌HCT-8细胞系中的表达,以期为肿瘤的基因治疗提供新的思路和手段。方法构建逆转录病毒表达载体pSIREN-EphA2,应用逆转录病毒载体介导的RNAi技术抑制EphA2癌基因在结肠腺癌细胞HCT-8中的表达,同时利用Western免疫印迹和免疫组织化学SP法分别检测转染后HCT-8细胞中EphA2蛋白的表达水平。结果从EphA2 mRNA序列中筛选出有效的siRNA序列,并设计了互补双链寡核苷酸发夹结构,成功构建了EphA2 siRNA的逆转录病毒表达载体,重组逆转录病毒载体pSIREN-EphA2经酶切鉴定结果正确;测序分析证实插入的EphA2 siRNA的方向及序列正确。Western免疫印迹和免疫组织化学方法分析,与对照空载体及未转染细胞相比,重组pSIREN-EphA2转染的HCT-8细胞中EphA2蛋白表达水平明显降低,差异具有统计学意义（P〈0．001）。结论通过逆转录病毒载体介导的RNAi能够抑制HCT-8细胞中EphA2的蛋白表达,为以EphA2为靶向的结直肠癌的基因治疗提供了新的思路和手段。     

卵巢癌中ETV4基因高表达对患者预后的临床意义

目的　探讨ETV4在卵巢癌中的表达及与预后的关系。 方法　分别利用BioGPS数据库、Oncomine数据库、癌症细胞系百科全书（CCLE）和Kaplan-Meier Plotter数据库分析ETV4基因在正常人体组织中的表达、卵巢癌组织中的表达，以及卵巢癌患者预后生存分析；利用cBioPortal数据库分析ETV4在卵巢癌中基因突变和预后关系。 结果　BioGPS数据库分析结果显示ETV4在正常卵巢组织低表达；Oncomine数据库检索出340项，ETV4表达水平有差异意义的结果32项，其中ETV4表达增高30项，ETV4表达降低2项；对符合设定条件的2项研究进行Meta分析发现，ETV4在卵巢癌组织中呈高表达状态（P<0.05）；CCLE分析结果显示ETV4在卵巢癌细胞中高表达；Kaplan-Meier Plotter数据库结果显示，ETV4高表达组的卵巢癌患者总体生存时间（OS）与无病生存时间（DFS）较低表达组均显著延长（P<0.05）。cBioPortal数据库结果显示ETV4在卵巢癌中基因突变率为2.5%，但对卵巢癌患者的OS与DFS均无显著影响（P>0.05）。 结论　ETV4在卵巢癌组织中高表达，且具有显著延长卵巢癌患者OS与DFS的作用，可作为卵巢癌临床预后的候选标志物；ETV4基因的突变对卵巢癌患者的OS与DFS无显著影响。     

RNA干扰技术抑制耐药细胞MDR1基因表达的研究

目的： 探讨载体表达的小干扰RNA (siRNA)抑制MDR1基因的表达，并逆转卵巢癌耐药细胞多药耐药的可行性。 方法： 浓度梯度诱导法和人MDR1基因载体转染法建立阿霉素耐药细胞株OVCAR/AR和多药耐药亚株OVCAR/MDR细胞。脂质体介导将MDR1特异性siRNA的表达载体(pSN/mdr1a和pSN/mdr1b)转染耐药细胞，实时定量RT-PCR方法检测MDRl mRNA的表达，流式细胞术检测P-gp的表达，MTT法检测耐药细胞对化疗药的抵抗性。 结果： 耐药细胞OVCAR/MDR细胞MDR1 mRNA的表达高于OVCAR/AR细胞，两者均高于其亲代细胞OVCAR-3；转染pSN/mdr1a和pSN/mdr1b可显著抑制两株耐药细胞MDR1 mRNA和P-gp的表达，OVCAR/MDR和OVCAR/AR细胞对阿霉素抗药性的逆转率分别为79.5%和93.9%。 结论： 载体表达的MDR1特异性siRNA可抑制卵巢癌耐药细胞亚株MDR1基因的表达，因而增加耐药细胞对化疗药物的敏感性。     

槲皮素对人卵巢癌SKOV-3细胞增殖的影响

 目的：探讨槲皮素对人卵巢癌SKOV-3细胞增殖抑制和凋亡的影响,为卵巢癌临床治疗提供依据。方法：不同浓度槲皮素处理卵巢癌SKOV-3细胞后,采用MTT实验检测细胞增殖抑制作用并计算抑制率,细胞免疫化学染色法鉴定细胞凋亡,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡。结果：槲皮素能够抑制SKOV-3细胞的增殖,且呈时间和剂量依赖性,免疫荧光显示槲皮素对SKOV-3细胞具有诱导凋亡作用,流式细胞术显示SKOV-3细胞被阻滞在S期, G2/M期细胞比例降低,凋亡率上升。结论：槲皮素在体外能够抑制卵巢癌SKOV-3细胞的增殖,阻止细胞由S期向G2期移行,促进其凋亡。     

卵巢良性肿瘤组织和卵巢上皮癌组织基因表达差异的研究

目的 探讨卵巢上皮癌组织相关基因的差异表达.方法 采用含384条肿瘤相关基因的cDNA阵谱检测了卵巢上皮癌组织及卵巢良性肿瘤的基因谱,分析卵巢上皮癌组织相关基因的差异表达.结果 在384条候选基因中,与卵巢癌相关的差异表达基因36条,其中23条表达上调,13条表达下调.结论 cDNA阵谱技术是筛查卵巢癌相关基因的有效方法.     

RNA干扰抑制MTA1基因对人乳腺癌细胞ERα表达及浸润能力的影响

目的 通过观察pGenesil-1肿瘤转移相关基因1(MTA1)对人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞MTA1基因的沉默效应,了解其对ERα表达及浸润能力的影响.方法 设计合成并构建重组质粒pGenesil-1MTA1,将该质粒分别转染MDA-MB-231和MCF-7细胞,荧光显微镜评估转染效率,RT-PCR检测MTA1和基质金属蛋白酶(MMP)-9 mRNA表达,免疫细胞化学检测ERα和MMP-9表达,Western blot检测ERα蛋白表达,用Boyden小室体外侵袭实验检测转染前后两株细胞侵袭力的变化.结果 成功构建重组质粒pGenesil-1MTA1,并成功转染入MDA-MB-231和MCF-7细胞(平均转染效率分别为82.5%和78.2%).两株细胞MTA1 mRNA表达均受到不同程度的抑制(分别为80.2%和58.7%).经干扰MTA1基因后MDA-MB-231细胞ERα蛋白表达得到逆转,呈阳性表达;MMP-9 mRNA表达下降;细胞体外侵袭力减弱(侵袭指数为27.2%±2.1%),与干扰前(76.3%±2.4%)相比差异有统计学意义(P＜0.05).而MCF-7细胞转染重组质粒并干扰MTA1基因后,ERα蛋白、MMP-9 mRNA表达和体外侵袭能力变化均无统计学意义(P＞0.05).结论 重组质粒pGenesil-1MTA1能有效抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-231和MCF-7细胞MTA1基因表达,ERa在MDA-MB-231细胞得到逆转,表达阳性,其高侵袭能力减弱,使干扰肿瘤转移靶基因成为可能.     

RNA干扰对宫颈癌细胞中E6AP基因的影响及其意义

目的 探讨RNA干扰(RNAi)对宫颈癌细胞系HeLa细胞E6AP基因表达及细胞增殖和凋亡的影响.方法 实验分为3组:空白对照组(未经转染的HeLa细胞)、转染阴性对照的小干扰RNA(siRNA)组及转染特异性E6AP siRNA组.采用半定量RT-PCR技术、Western blot方法 检测E6AP mRNA、蛋白表达水平,用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法检测细胞增殖状况,用流式细胞术检测细胞凋亡.结果 转染E6AP siRNA 24、48、72 h后,E6AP siRNA组E6AP mRNA表达水平与对照siRNA组比较下降33%、72%、70%.Western blot结果 显示,在转染48及72 h,E6AP蛋白表达下降38%、59%.MTT法检测显示,转染HeLa细胞24、48、72、96 h后细胞生长速度明显降低,E6AP siRNA组与空白对照组(F=101.38,P＜0.05)、对照siRNA组(F=38.64,P＜0.05)比较,差异均有统计学意义.E6AP siRNA作用24、48、72 h后E6AP siRNA组凋亡率明显高于对照siRNA组(F=41.48,P＜0.05)和空白对照组(F=86.36,P＜0.05),差异有统计学意义.结论 体外合成的siRNA能有效封闭宫颈癌细胞中E6AP基因的表达,抑制细胞增殖,促进细胞的凋亡,为宫颈癌的基因治疗提供理论依据.