~(35)S标记探针在核酸分子杂交上的应用

以[α-(35)~S]脱氧腺苷三磷酸(dATP)进行缺口平移制备~(35)S-cDNA_(AFP)探针,试与人肝癌染色质DNA作点状杂交实验,得到阳性结果。~(35)S具有半衰期长,使用安全的优点。[α-~(35)S]dATP已在国内试制成功,容易得到,有推广用于核酸分子杂交实验的价值。     

生物素标记DNA探针的研制(简报)

目前国内外应用核酸分子杂交技术检测外源基因以诊断病毒等微生物的感染,探测内源基因的多态性和缺陷以诊断遗传病和研究肿瘤。其中基因探针(即DNA探针)是关键,常用~32P放射性同位素标记DNA作探针。由于~32P脱氧核苷三磷酸半衰期短、价钱昂贵、主要依靠进口、以及保存和防护运输等原因,使基因诊断技术不能广泛应用。本文参考国外经验,用生物素标记的DNA作探针巳获得成功. 生物素标记的DNA是已知片断,例如作者用生物素标记HBV-DNA及Y染色体特异的DNA等.标记方法既采用传统的缺口平移法,以Bio-ll-duTP(BRL公司产品)为标记底物,标记双链DNA还     

[α-~(35)S]dATP标记DNA探针在临床样品检验中的应用

用国产[α-~(35)S]dATP,经体外缺口翻译(nick translation)方法,制备 pBR322 DNA 探针,用于检测临床样品中 pBR322 DNA 的同源性物质。结果提示,~(35)SdATP 标记 DNA 探针,具有特异性强,敏感性高,方法简便,而且对人体辐射危害小,价格便宜等特点,可用于临床检验、诊断及基因分析。     

生物素-链霉抗生物素蛋白硷性磷酸酶体系标记检测DNA探针

本室采用近年发展的生物素—链霉抗生物素蛋白体系检测特异互补的核酸序列,先经缺口翻译制备生物素DNA探针,分子杂交后,再与链霉抗生物素蛋白—生物素—硷性磷酸酶复合物反应和显色,检测限度约50pg靶DNA,并将其结果与~(35)S标记相同的探针进行了比较。     

宫颈癌组织基因组中C-MYC癌基因同源序列的检测及其临床意义

以α-~(32)p-dCTP标记的C-MYC癌基因为探针,采用斑点杂交法检测38例慢性宫颈炎,49例宫颈癌组织DNA中C—MYC癌基因的同源序列。结果慢性宫颈炎、宫颈癌杂交阳性率分别为26.32％(10/38)、83.67％(41/49)。而以α-~(32)p-dCTP标记的C-MYC重组体作探针进行杂交,结果49例宫颈癌杂交阳性率分别为100％(49/49)。结果提示:(1)分子杂交法检测以C—MYC DNA的同源序列有助于宫颈癌的早期诊断;(2)人体组织基因组中存在有PBR_(322)的同源序列,因此以克隆化重组体作探针进行条交必须注意到载体所产生的假阳性。     

DNA的生物素标记

非放射性标记探针的应用,对于推广基因诊断技术有重要意义。本文研究酶促和光促两法进行生物素标记DNA。以碱性磷酸酶偶联体系检测两法得到的生物素探针及其分子杂交产物,显色灵敏度近1pg,杂交灵敏度达5pg,而5～10×10~5倍的无关DNA没有或痕量非特异性显色。表明此两种生物素标记探针以及所使用的分子杂交和显色体系皆可用于病毒或真核基因的分析和检测。     

地高辛素、生物素标记产毒性大肠杆菌 Ⅰ型不耐热肠毒素ADN探针的制备及应用

采用随机引物法制备地高辛素、生物素和~(32)P标记产毒性大肠杆菌Ⅰ型不耐热肠毒素(LT_1)DNA探针。地高辛素、生物素和~(32)P LT_1探针分别在DNA斑点杂交试验中检测到0.1pg、1pg和0.1pg的质粒DNA,在菌落原位杂交试验中检测到12、120和12个细菌/ml,在粪便斑点杂交试验中检测到24、240和24个细菌/ml。采用RNA酶A和蛋白酶K消化处理滤膜,消除了假阳性,使得地高辛素、生物素LT_1探针的特异性与~(32)PLT_1探针完全一致。检测143株自腹泻病人分离的大肠杆菌,14株(9.79％)阳性,3种探针结果相同。     

用不同标记的乙型肝炎病毒DNA探针对肝组织内病毒基因进行原位核酸分子杂交

本文报道采用国产[α-(55)~S]dATP及进口[3~H]dNTP与生物素标记HBV DNA全基因探针进行原位核酸分子杂交,均可获得阳性结果。其中[3~H]dNTP标记探针的敏感性与特异性最佳。对6例慢性乙型肝炎患者肝组织切片进行原位核酸分子杂交,结果与肝组织提取物经Southern吸印转移HBV DNA杂交的阳性率完全一致。原位核酸杂交显影后的银颗粒呈灶性分布于肝细胞内,提示病毒在肝内扩散为细胞——细胞间传播方式进行。对1例有复制型HBV DNA的肝癌组织进行原位核酸分子杂交,发现HBV DNA主要分布在光镜下癌细胞旁肝细胞胞浆中,而癌细胞中未测得HBV DNA,其意义有待更多病例数检测后才能阐明。     

光敏生物素标记流行性出血热病毒R_(22)株M片段cDNA探针

核酸探针一般多采用同位素标记,限制了它的推广应用。所以应用非放射性标记物代替同位素,具有实际意义。作者采用国产光敏生物素,标记流行性出血热病毒R_(22)株M片段R_3 cDNA探针,报告如下。1 光敏生物素标记 cDNA探针的敏感性 以R_3克隆cDNA为目的基因,加热变性后再经10倍系列稀释后,点到硝酸纤维素膜上,分别用光敏生物素,生物素-11-dUTP及a-~(32)P-dATP标记的探针杂交检测,结果光敏生物素与生物素-11-dATP敏感性一致,均     

生物素标记DNA探针测定人性别

白细胞或胎儿绒毛组织染色体DNA经限制酶Hae (?)消化后,用光生物素(photo-biotin)标记人Y染色体特异的3.4 kb DNA片段作探针,进行Southern印迹杂交,并以生物素结合蛋白-碱性磷酸酶体系显示生物素探针杂交信号。结果表明,0.1μg男性DNA可显示清晰的信号,而5μg女性DNA则无信号出现;平行试验证明生物素探针测定人性别的结果与32P标记探针完全一致。提示生物素探针可用于X连锁遗传病、性异常,运动员体检,法医学及异性别骨髓移植方面的性别分析。     

地高辛配基标记DNA打点杂交和原位杂交检测钩端螺旋体

应用一种新的非放射标记物地高辛配基(DIG)制备黄疸出血群赖型017株钩端螺旋体DNA(017DNA)探针,与~(32)P和光敏生物素标记017DNA探针对照打点杂交检测钩端螺旋体DNA。结果,上述三种探针均能检测到不同群型的问号状钩体,DIG探针的敏感性为0.1pg,~(32)P和光敏生物素探针的敏感性分别为1 pg和10pg。以上探针均不能检测双曲钩体patoc型Patocl株、细螺旋体illini型3065株,与其它致病菌及人白细胞DNA也无明显杂交信号。DIG标记017DNA探针原位杂交检测感染017株钩体的豚鼠系列组织切片和血浆涂片,以对比度极大的着色反应,清晰地显示各组织和血浆中的钩体形态。细螺旋体illini型3055探针和HBV-DNA探针不能检测到上述标本中的钩体.     

HBV—DNA分子杂交技术的建立及其临床方面的应用

本文采用目前最灵敏的HBV—DNA分子杂交技术,利用α—~(32)P和生物素标记DNA做为探针进行乙型肝炎的研究。对230例HBsAg阳性的携带者进行检测HBV—DNA阳性者占26.5%。230例中HBeAg占63%,抗—HBe占25.2%。而HBV—DNA阳性的血清中HBeAg阳性占86.9%为阳性。抗—HBe中只有8.1%。两者有显著差异。本文还对HBV—DNA与HBsAg免疫复合物的关系以及乙肝疫苗的检测有一些新的评价。     

用生物素标记DNA探针检测红内期间日疟原虫

在疟疾基因诊断的研究中,目前所用的DNA探针大多是用放射性同位素~(32)P标记的,~(32)P有辐射能量强和检测敏感度高的优点,但是半衰期短,价格昂贵,有辐射危害和易污染环境等不足之处,难以用于疟疾流行病学现场.用非同位素取代放射性同位素标记探针是疟原虫核酸探针研究中的大趋势,作者首次报道用生物素标记DNA探针检测红内期间日疟原虫.1 材料和方法 含间日疟原虫DNA插入片段的重     

生物素标记寡核苷酸探针探测扩增的病理性突变基因

碱基突变可直接影响人类基因的功能,导致各种遗传病的发生。本文作者建立了用生物素标记寡核苷酸探针探测扩增的病理性突变基因的方法。标记时寡核苷酸的用量仅需6ng,在末端转移酶的催化下,把生物素标记的脱氧核苷酸连接到寡核苷酸的3’羟基末端。经分离纯化后,进行斑点杂交和Southern印迹杂交,最后用ABC系统(即:Avidin-Biotin-碱性磷酸酶复合物)酶标显示杂交信号。用两种寡核苷酸探针(β_(41-42)~Αβ_(41-42)~Τ等探针)分别与克隆化扩增的正常和突变的β-珠蛋白基因DNA杂交,结果表明:~(32)P探针     

原位分子杂交法检测细胞内腺病毒DNA

用生物素biotin-14-dATP标记的腺病毒探针，在标本预处理的基础上，经过原位分子杂交，免疫显色等步骤，检出了被腺病毒感染的宫颈癌细胞株HeLa细胞     

宫颈癌组织中HPV16型基因组内切酶谱的研究(摘要)

近年来,人乳头状瘤病毒(Human papil-loma virus,HPV)与宫颈癌发病关系的研究,已日益引起人们重视,并从基因及分子水平表明其在宫颈癌变中起着重要作用。作者曾以生物素及~(32)P—dATP标记HPV16型DNA为探针,经点杂交证实了宫颈癌中存在有HPV的     

光敏生物素和~(32)P标记DNA打点杂交检测钩端螺旋体

应用光敏生物素和~(32)P标记黄疸出血群赖型017株钩端螺旋体DNA(简称017DNA)作为探针,打点杂交检测问号状钩体。结果表明:两种探针均能检测不同群、型的问号状钩体DNA,最小检测量分别为5pg和1pg;与双曲钩体patoc型PatocⅠ株、细螺旋体属illini型3055株及其他致病菌和正常人血清未发现明显杂交信号。提示光敏生物素制备的017DNA探针可以用于检测钩体,也可应用于钩体病的早期诊断和流行病学调查。     

宫颈癌组织中HSV-2核酸片段的检测

本文以[α-~(32)ρ]dATP 标记HSV-2 DNA,分别用Southern 转印及打点杂交技术,同时检测了39例宫颈癌及4例正常活检标本。在39例宫颈癌中未发现HSV-2 DNA,其中12例宫颈癌组织RNA 与HSV-2 DNA 杂交呈阳性结果。初步结果说明HSV-2与宫颈癌的发生可能有关。     

DNA-RNA杂交法检测血清中HDV RNA

从丁型肝炎病毒(HDV)cDNA的克隆菌中提取到高纯度的HDV cDNA,对其进行α?~(32)P放射性标记,制备的探针比放射活性达5.1×10~7cpm μg DNA。以此探针作DNA-RNA斑点杂交,结果:检测敏感量为5pg;阴、阳性对照区别明显且与实际符合;6%(9?150)的待检血清为HDV RNA阳性。由此证明本文的方法制备的HDV cDNA探针具有高度灵敏度和特异性,适用于核酸分子杂交法检测血清中的HDV RNA。     

PCR-ELISA检测TB DNA方法的建立及其初步应用

目的 建立灵敏，快速，特异的PCR-ELISA检测结核菌DNA的方法。方法 用一对生物素标记的上游引物和未标记的下游引物对TBIS6110的一段DNA进行快速PCR扩增，使扩增产物的一条链上带有生物素，同时PCR反应液中存在有地高辛的标记的检测探针，随着PCR的结束，探针与生物素标记的扩增产物形成特异的杂交体，该杂交体通过链霉亲和素被固定在微孔板表面，然后用标记有过氧化物酶的地高辛抗体与杂交体上的地高辛结合，漂洗后加底物显色。测定吸光度值（A450nm)。结果 该方法灵敏，特异，快速，可以检测出10copies的模板量，对临床60例痰标本进行培养法。结论 该方法适用于临床进行快速的TB基因检测，也可用于其它病原体的检测。