反义蛋白激酶Cξ下调角质形成细胞中增殖相关基因的表达

自从1997年发现蛋白激酶C（PKC）以来，研究证明PKC信号转导通路在细胞生长、分化等功能的调节中起关键的作用，我们以往的研究已证明细胞的增殖与增殖相关基因的表达密切相关。我们在以前研究的基础上，从细胞增殖相关基因的角度，进一步探讨了反义PKCξ抑制Colo16角质形成细胞增殖的机制，为弄清PKCξ在角质形成细胞增殖调控中的作用提供实验依据。     

反义蛋白激酶Cζ下调角质形成细胞中增殖相关基因的表达

自从1977年发现蛋白激酶C(PKC)以来,研究证明PKC信号转导通路在细胞生长、分化等功能的调节中起关键的作用[1],我们以往的研究已证明细胞的增殖与增殖相关基因的表达密切相关[2,3]。我们在以前研究的基础上,从细胞增殖相关基因的角度,进一步探讨了反义PK C灼抑制Colo16角质形成细胞增殖的机制,为弄清PK C灼在角质形成细胞增殖调控中的作用提供实验依据。一、材料和方法(一)材料:PTB654-PKC灼、PcD NA3、Colo16角质形成细胞株分别由日本神户大学Ono教授、北京大学医学部生化系侯维敏教授及日本北里大学H ikaru教授惠赠。Dulbecco…     

K17反义寡核苷酸对角质形成细胞增殖和K17表达的影响

目的研究脂质体介导角蛋白17(K17)反义寡核苷酸对培养人角质形成细胞增殖和K17表达的影响。方法利用脂质体将人工合成的正义、反义及错配K17寡核苷酸基因片段导入体外培养的人角质形成细胞系HaCaT,应用MTT法检测其对HaCaT细胞增殖的影响,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测K17mRNA水平的变化,并以蛋白质印迹法、免疫荧光细胞化学结合激光扫描共聚焦显微镜检测K17蛋白水平的改变。结果脂质体介导的K17反义寡核苷酸转染HaCaT细胞后,细胞增殖受到明显抑制,同时细胞中K17mRNA和蛋白的表达明显下降,而正义寡核苷酸组、错义寡核苷酸组及空白对照组均无明显变化。结论应用反义技术封闭K17基因,可以阻遏角蛋白K17基因和蛋白的表达,抑制角质形成细胞的体外生长和增殖能力。     

反义寡核苷酸阻遏角蛋白14的表达

目的 研究脂质体介导角蛋白K14反义寡核苷酸(ASODN)阻遏人角质形成细胞K14基因和蛋白的表达及抑制体外增殖活性的效果.方法 人表皮角质形成细胞原代培养,3~10代用于实验,利用脂质体将人工合成的正义、反义及错配K14寡核苷酸基因片段导入角质形成细胞,应用流式细胞仪、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫组化(SABC)方法检测反义寡核苷酸对角质形成细胞的细胞周期、K14基因和蛋白表达的影响.结果 脂质体介导的K14反义寡核苷酸转染角质形成细胞后,能有效地抑制角质形成细胞中K14基因的表达;48h后可阻遏K14蛋白表达;流式细胞仪检测见反义寡核苷酸处理组细胞周期发生明显改变,G₁期细胞百分率上升,S期细胞百分率下降.而正义寡核苷酸1组、错义寡核苷酸组及空白对照组均无此变化.结论 应用反义技术封闭K14基因,可以阻遏角蛋白K14基因和蛋白的表达,并可以抑制体外培养的角质形成细胞的增殖.     

反义PKCζ对角质形成细胞增殖的调节

目的:探讨角质形成细胞中,反义蛋白激酶Cζ与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和细胞外信号调节激酶ERK1/2信号转导网络以及与核因子NF-κB的相互作用关系。方法:通过细胞原位杂交、间接免疫荧光和激酶活性测定方法,研究反义PKCζ抑制角质形成细胞增殖的信号转导机制。结果:表达反义PKCζ的角质形成细胞中,PI3K的基因表达显著下调,ERK1/2和NF-κB的核内表达水平以及ERK1/2的激酶活性明显降低。结论:表达反义PKCζ可通过下调PI3K和ERK1/2信号通路抑制角质形成细胞的增殖。     

蛋白激酶Cζ在银屑病发病中的意义

目的 探讨蛋白激酶Cζ在银屑病发病中的作用.方法 通过原位杂交和免疫组化的方法,研究了12例寻常型银屑病患者皮损区、非皮损区和5例正常人表皮中蛋白激酶Cζ的mRNA和蛋白的表达及分布特点.结果 银屑病皮损区表皮中PKCζ的mRNA和蛋白表达均较非皮损区和正常表皮中的表达明显增强,正常人表皮中PKCζ的mRNA表达分布于表皮上层,而银屑病皮损区PKCζ的mRNA表达几乎分布于表皮全层.结论 PKCζ在银屑病表皮中的过表达提示,PKCζ可能与银屑病表皮细胞的过度增殖相关.     

人类乳头瘤病毒16全基因在体外培养的正常人角质形成细胞中的瞬时表达

目的 利用含有人类乳头瘤病毒(HPV)16全基因的质粒转染正常人角质形成细胞,观察HPV16 mRNA在转染细胞的表达。方法 用FuGENE^TM6转染试剂,将携带HPV16全基因的质粒pSV2-neo/16转染体外培养的正常人角质形成细胞,在转染后24h提取细胞总RNA和DNA,进行RT-PCR和Southern印迹分析。结果 24h后,RT-PCR成功地扩增出110bp的片段,转染细胞中已出现HPV16 mRNA的表达,Southern印迹证实转染细胞中含有HPV16全基因7.9kb。结论 pSV2-neo/16转染正常人表皮角质形成细胞,24h内即可检测到HPV16mRNA表达。     

银屑病患者角质形成细胞凋亡以及维A酸与榄香烯的影响

目的 探讨银屑病患者角质形成细胞凋亡以及维A酸与榄香烯对体外培养的角质形成细胞凋亡的影响.方法 用TUNEL法测定28例银屑病患者角质形成细胞凋亡;流式细胞仪和DNA片段化观察维A酸与榄香烯对体外培养的角质形成细胞凋亡的影响.结果 28例银屑病患者中19例有大量凋亡细胞分布于表皮各层,另9例较少,分布于棘细胞层和颗粒层.浓度为1、5、10、20μg/mL的维A酸和浓度为20、40、60、80μg/mL的榄香烯可促进人角质形成细胞株Colo16细胞凋亡.结论 银屑病患者角质形成细胞凋亡异常增多,一定浓度的维A酸与榄香烯可在实验室内促进人角质形成细胞株Colo-16细胞凋亡.     

抗角蛋白单克隆抗体5G5对培养角质形成细胞增殖的影响

目的 研究抗角蛋白单克隆抗体5G5在无血清培养的角质形成细胞中的免疫学活性,观察其对角质形成细胞增殖的影响。方法 免疫组化观察5G5对角质形成细胞的反应性;从培养的角质形成细胞中提取角蛋白,免疫印迹法检测5G5所识别的角蛋白区带;四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT法)测定5G5对细胞增殖的影响。结果 5G5仅识别角质形成细胞中相对分子质量为50000的角蛋白区带,呈现为一条很强的染色带,而未与其它分子质量的角蛋白反应;免疫组化染色明显呈胞浆阳性;该单克隆抗体明显抑制培养的角质形成细胞增殖,并且存在剂量依赖关系。结论 特异性抗相对分子质量为50000角蛋白的抗体可能是角蛋白抗体家族中影响角质形成细胞增殖的有效成分。     

NB-UVB和阿维A对角质形成细胞肝素结合表皮生长因子样生长因子mRNA的影响

目的 探讨阿维A和窄谱中波紫外线(NB-UVB)对培养的正常人角质形成细胞增殖和肝素结合表皮生长因子样生长因子(HB-EGF)mRNA表达的影响.方法 用1μmol/L阿维A和/或100mJ/cm²NB-UVB处理正常人角质形成细胞12h后,用MTT法、RT-PCR和实时荧光定量RT-PCR法分别检测细胞增殖和HB-EGFmRNA表达的改变.结果 1μmol/L阿维A和100mJ/cm²NB-UVB单独作用时,均可抑制角质形成细胞的增殖和上调HB-EGFmRNA的表达,两者联合作用时,对角质形成细胞增殖的抑制和HB-EGFmRNA的诱导作用更强,分别为19.7%和8.6倍,之后依次为1μmol/L阿维A(14.4%,7.1倍)和100mJ/cm²NB-UVB(8.7%,2.5倍).结论 阿维A和/或NB-UVB处理后,可协同上调HB-EGF的表达,可能参与调节二者对角质形成细胞增殖的抑制作用.     

卡泊三醇、维A酸及雷公藤内酯醇对角质形成细胞及COLO16细胞中血管内皮生长因子生成的影响

目的 探讨卡泊三醇、维A酸及雷公藤内酯醇对角质形成细胞及COLO16细胞中血管内皮生长因子(VEGF)生成的影响.方法 采用RT-PCR法检测原代培养的人角质形成细胞及COLO16细胞中VEGFmRNA的水平.结果 卡泊三醇作用于正常人角质形成细胞4h和24h后,以及作用COLO16细胞24h后,均可抑制VEGFmRNA的表达,呈剂量依赖性,IC₅₀值分别为1.19×10^-4μg/mL、1.51×10^-4μg/mL和3.16×10^-5μg/mL.维A酸作用于正常人角质形成细胞4h后可抑制VEGFmRNA的表达,作用于正常角质形成细胞24h后及作用于COLO16细胞4h和24h均无抑制作用.雷公藤内酯醇对正常角质形成细胞和COLO16细胞中VEGFmRNA表达均无抑制作用.结论 在转录水平抑制VEGF生成可能是维A酸与卡泊三醇抗银屑病的作用机制之一.     

抗角蛋白16抗体对角质形成细胞外皮蛋白、Toll样受体2和4的调节

目的 研究抗角蛋白16抗体对角质形成细胞分化、Toll样受体2和4的调节。方法 将抗角蛋白16抗体加入培养的角质形成细胞中,以同种型抗体作对照,研究外皮蛋白和Toll样受体2和4mRNA表达。结果 抗角蛋白16抗体作用角质形成细胞6h、24h、36h后,Toll样受体2mRNA表达分别上调1.73、1.60、2.52倍:12 h和36h后Toll样受体4mRNA表达分别上调3.62和2.21倍;12 h、36h后外皮蛋白mRNA表达分别上调2.33倍和2.0倍。结论 抗角蛋白16抗体可能是联系Toll样受体2和4与角质形成细胞分化的重要环节。     

天然抗角蛋白自身抗体抑制角质形成细胞及鳞状细胞癌细胞增殖的作用

目的 探索天然抗角蛋白自身抗体抑制角质形成细胞及鳞状细胞癌细胞增殖的作用机理。方法 经体外培养人角质形成细胞及鳞状细胞癌细胞,作用于不同浓度的天然抗角蛋白自身抗体,四甲基偶氮唑盐法检测活性,免疫组化检测增殖及凋亡相关蛋白变化。结果 天然抗角蛋白自身抗体对二者的增殖有着明显的抑制作用,且呈一定的浓度-效应关系。对二者P53、C-myc的表达具有促进作用,而对增殖细胞核抗原的表达则具有抑制作用。结论 天然抗角蛋白自身抗体对角质形成细胞及鳞状细胞癌细胞增殖的抑制作用,可能系通过调节细胞中增殖与凋亡相关蛋白的表达来实现。     

降钙素基因相关肽对HaCaT细胞一氧化氮合酶表达的影响

目的 研究降钙素基因相关肽对体外培养角质形成细胞HaCaT株神经型一氧化氮合酶(NOS)mRNA、蛋白表达和NO释放的调节作用。方法 应用NO试剂盒(酶法)检测培养细胞上清液中NO水平,RT-PCR和免疫组化(SP)方法检测HaCaT细胞神经型NOSmRNA和蛋白的表达水平。结果 体外正常培养的HaCaT细胞表达和释放基础水平的神经型NOS和NO,降钙素基因相关肽上调HaCaT细胞神经型NOS表达和NO释放,降钙素基因相关肽受体抑制剂CGRP-8-37抑制降钙素基因相关肽的作用。结论 降钙素基因相关肽诱导角质形成细胞表达神经型NOS并促进神经型NO释放。     

角质形成细胞生长因子受体反义寡核苷酸对HaCaT细胞增殖的影响

目的 研究角质形成细胞生长因子受体反义寡核苷酸(KGFR ASODN)对角质形成细胞生长因子(KGF)促HaCaT细胞增殖效应的抑制作用。方法 HaCaT细胞体外培养,采用绘制生长曲线、MTT实验、集落形成实验研究KGFR ASODN对KGF促增殖效应的抑制作用。采用流式细胞仪研究KGFR ASODN对KGFR表达的影响。结果 反义序列1和反义序列2均可抑制HaCaT细胞的生长速度(P<0.05)。高于0.25μg/mL质量浓度反义序列1和反义序列2均可抑制KGF介导的HaCaT细胞增殖(P<0.05)。高于0.25μg/mL质量浓度反义序列1和反义序列2都可抑制KGF诱导的HaCaT细胞集落形成(P<0.05)。HaCaT细胞存在KGFR基础表达,高于0.25μg/mL质量浓度反义序列1和反义序列2均可抑制HaCaT细胞KGFR表达(P<0.05),抑制率呈浓度依赖性,正义序列核苷酸(S-ODN)对KGFR表达无抑制作用(P>0.05)。结论 KGFR ASODN可有效抑制KGFR表达,进而抑制KGF介导的HaCaT细胞过度增殖。     

降钙素基因相关肽对HaCaT细胞表达血管内皮生长因子的调控

目的 探讨降钙素基因相关肽(CGRP)对角质形成细胞表达和分泌血管内皮生长因子(VEGF)的调控.方法 用实时定量PCR(RT-PCR)方法检测CGRP、CGRP1型受体拮抗剂CGRP8-37、细胞外信号调节激酶ERK1/2特异性的抑制剂PD98059、p38MAPK特异性拮抗剂SB203580对HaCaT角质形成细胞表达VEGFmRNA水平的影响;用酶联免疫吸附方法检测HaCaT细胞分泌至培养液中VEGF蛋白的水平.结果 CGRP时间依赖性地促进HaCaT细胞表达VEGFmRNA和分泌VEGF蛋白;CGRP8-37和PD98059均可明显抑制CGRP刺激的HaCaT细胞表达和分泌VEGF,SB203580不能减弱CGRP刺激的VEGF表达和分泌.结论 CGRP可以上调HaCaT细胞表达和分泌VEGF,CGRP1型受体及其相关的ERK1/2信号通路参与其调控.     

体外重建皮肤与正常人皮肤基本特征的对比研究

目的 用正常人的皮肤角质形成细胞和黑素细胞在体外重建皮肤,为将来用于临床、生物及药理学研究奠定基础.方法 从正常儿童的包皮分离、培养角质形成细胞、黑素细胞和成纤维细胞.用成纤维细胞和I型鼠尾胶原制备真皮类似物.将角质形成细胞和黑素细胞接种到真皮类似物表面进行培养,制备表皮类似物.将重建的皮肤类似物和正常人皮肤进行对比研究.结果 皮肤类似物的组织形态包括基底层、基底上层、角质层与正常人皮肤相似.与基底膜形成有关的标志,在皮肤类似物和正常人皮肤中的表达是相似的.角蛋白10、泛角蛋白在皮肤类似物和正常人皮肤中的表达也是相似的.结论 组织形态和所检测的各种标志的表达显示,该皮肤类似物与正常人皮肤相似.     

UVB与钙离子对体外培养人角质形成细胞表达天疱疮抗原的影响

目的 研究中波紫外线(UVB)照射以及不同钙离子浓度对角质形成细胞表达天疱疮抗原的影响.方法 通过改变培养基中的钙离子浓度以及采用不同剂量UVB照射体外培养的人角质形成细胞,在不同时间段以寻常型天疱疮(PV)或落叶型天疱疮(PF)血清作为一抗进行免疫荧光检测,观察寻常型天疱疮抗原(PVA)和落叶型天疱疮抗原(PFA)的表达情况;提取细胞或皮肤表皮组织蛋白质,用PV和PF血清进行免疫印迹检测.结果 无论是否增加钙离子浓度,体外培养人角质形成细胞间隙均可以检测到PV血清特异性着色.只有增加培养基中钙离子浓度后,形成的复层化角质形成细胞间隙才可以检测到PF血清特异性荧光着色.不同剂量UVB照射后的角质形成细胞均不产生PF血清的特异性着色.PF血清与160000条带反应,PV血清可与130000和160000两条带反应.结论 体外培养的单层或复层角质形成细胞均可以表达PVA,提高培养基中钙离子浓度可以诱导培养人角质形成细胞复层化并表达PFA,而UVB照射不能促使人角质形成细胞在体外培养条件下表达PFA.     

维生素D3抑制角质形成细胞CXCR2的表达

目的 观察维生素D3对角质形成细胞表面表达CXCR2的影响,探讨其在治疗银屑病中的作用机制。方法 用不同浓度的维生素D3处理人角质形成细胞株HaCaT,48h后通过四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测了维生素D3抑制HaCaT增殖的有效剂量;通过流式细胞仪(FACS)分析维生素D3处理的HaCaT表达趋化因子受体CXCR2的情况。结果 HaCaT经维生素D3在8.0×10^-8mol/L～5.12×10^-6mol/L浓度范围内处理48h后的A值较未处理组明显降低(P<0.05).HaCaT在5.12×10^-6mol/L维生素D3处理48h后CXCR2的表达明显低于正常对照组。结论 维生素D3治疗银屑病的作用机制部分是通过抑制角质形成细胞表达CXCR2,从而达到抑制角质形成细胞增殖的目的。     

TRP-1编码基因反义核酸对黑素细胞增殖及功能的影响

目的 构建酪氨酸相关蛋白-1(TRP-1)反义真核表达载体并转染TRP-1高表达的黑素细胞及恶性黑素瘤细胞,进一步研究其对黑素细胞及恶性黑素瘤细胞增殖及功能的影响。方法 将TRP-1基因反向亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1,转染黑素细胞及恶性黑素瘤细胞。以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测TRP-1mRNA水平的变化,免疫印迹法检测TRP-1蛋白水平的改变。通过流式细胞仪检测细胞周期的变化,并用L-多巴测定酪氨酸酶活性的改变。结果 成功构建重组反义表达载体pcDNA3.1/TRP-1(-),转染细胞稳定表达TRP-1反义核酸。RT-PCR提示TRP-1mRNA水平显著下降,免疫印迹提示其TRP-1蛋白表达水平降低。流式细胞检测表明反义TRP-1转染细胞发生细胞周期G1期阻滞。转染组黑素细胞及黑素瘤细胞酪氨酸酶活性抑制率分别达46%和54%。结论 TRP-1在黑素细胞及黑素瘤细胞的增殖及功能方面发挥重要作用,TRP-1反义核酸转染细胞细胞周期受到阻滞,酪氨酸酶活性明显降低。