实时荧光RT—PCR定量检测BRMS1基因表达

目的建立一种实时荧光RT—PCR定量检测乳腺组织中BRMS1 mRNA表达水平的方法。方法采明逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）扩增目的基因片段,并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立的标准曲线,计算出待测样本中BRMS1 mRNA含量,并以BRMS1 mRNA与GAPDHmRNA的比值作为BRMs1 mRNA的表达水平。结果实时荧光RT—PCR检测BRMS1及GAPDH的线性范围为4×10^2-4×10^8拷贝／μl。批内和批间变异系数分别为3．9％-4．6％和4．8％-5．5％。BRMS1 mRNA表达范围为0—1．65．结论实时荧光定量检测BRMS1 mRNA含量的方法具有较高的灵敏度和较好的重复性。     

一步法实时荧光定量PCR检测白血病WT1基因mRNA

目的 构建RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因mRNA表达的方法,准确定量检测白血病患者微小残留病,指导临床判断预后和早期预测复发.方法 从K562细胞提取的RNA用特异性引物扩增WT1基因,pMD18-T载体克隆法构建荧光定量PCR标准模板,建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测wTl基因方法,并对该方法的灵敏度、重复性和稳定性进行检测.结果 构建的RT-PCR一步法实时荧光定量PCR方法的灵敏度达10-4水平:以拷贝数为1.0x106～1.0×102 cps/ml的标准品,分别进行RT-PCR一步法实时荧光定量PCR扩增后,标准品的Ct值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系,r值达0.998:管间和批间的变异系数均小于8%.结论 所建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因方法的灵敏度、重复性和特异性好;RT和PCR反应过程一步完成,更简便快捷,减少加样和污染机会,更适合临床检测.     

定量RT-PCR法检测冠心病患者外周血15-脂氧合酶基因表达水平的研究

目的建立检测15-脂氧合酶(15-Lipoxygenase,15-LOX)mRNA含量的实时荧光定量RT-PCR方法,测定冠心病患者外周血单核细胞中15-LOX的基因表达水平,探讨15-LOX基因表达水平与冠状动脉粥样硬化发生、发展的关系。方法构建重组质粒pMD18-T-15-LOX作为定量模板,建立以Taqman探针技术为基础的Real-ti me定量RT-PCR方法,测定了60例冠状动脉粥样硬化性心脏病患者和40例健康对照组白细胞中15-LOX mRNA的含量。结果15-LOX mRNA在60例患者单核细胞中的表达范围为4.23×104～2.67×107copy/mL;40例健康对照的表达范围为6.15×103～5.25×106copy/mL,冠心病组15-LOXmRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组〔(7.43±3.81)×105vs(4.79±1.76)×104;P<0.05〕。结论成功建立了15-LOX基因表达含量的荧光定量检测方法,检测发现冠状动脉粥样硬化性心脏病患者单核细胞中15-脂氧合酶mRNA的含量显著高于健康对照组,单核细胞中的15-LOX表达量与动脉粥样硬化的发生、发展存在一定的相关性。     

实时荧光定量测定人B细胞激活因子受体-BCMA基因表达水平

目的:研究建立实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR)检测人B细胞激活因子受体-BCMA含量的方法,及探讨其外周血单个核细胞(PBM C)中BCMA mRNA表达的检测价值。方法:在BCMA基因高保守区设计特异性引物和荧光探针,用逆转录-PCR扩增目的片段实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立标准曲线,由软件自动计算出待测样本中BCMA mRNA含量,并以BCMA mRNA和2βM mRNA含量的比值进行BCMA表达水平评价。结果:RFQ-PCR检测BCMA含量的线性范围为109pg/m l~101pg/m l,低浓度样本批内和批间变异系数(CV)分别为13.5%和11.2%,高浓度样本批内和批间CV分别为8.9%和9.7%。30例健康献血员样本的PBM C中,90%(27例)检出有BCMA mRNA表达,范围为0.10~0.98。结论:RFQ-PCR检测BCMA mRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性。     

实时逆转录聚合酶链反应定量检测人 TNF-αmRNA的表达

目的建立一种快速、灵敏、特异定量检测人外周血单个核细胞(PBMC)表达 TNF-α mRNA 的方法。方法根据 Gene Bank 中 TNF-α mRNA 序列和 MGB 探针荧光定量分析原理,设计合成特异的引物和探针,优化实验条件,建立定量检测人 TNF-α mRNA 的实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,并对10名健康体检者 PBMC PHA 刺激前后进行 TNF-α表达检测。结果本法灵敏度为10~3拷贝/毫升、线性检测范围达6个数量级(10~3～10~9拷贝/毫升);特异性好,PCR 产物电泳后无非特异性条带产生,非目的扩增产物用本法进行检测,均无荧光信号响应;以 Ct 值计算变异系数(CV 值),批内批间 CV值均小于5%;10名健康体检者 PBMC PHA 刺激前后 TNF-α mRNA 的平均含量分别为10~(4.15±0.49)和10~(5.19±0.43)拷贝/毫升。结论Taqman-MGB 实时荧光 RT-PCR 定量检测人 TNF-α mRNA 表达水平,结果快速、准确、特异、灵敏,具有临床推广价值。     

周围神经损伤再生后肌肉 nAChR ε亚单位基因表达的变化

目的:建立肌肉内烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR )ε亚单位mRNA表达水平的荧光定量检测方法,观察周围神经损伤后肌肉内nAChR ε亚单位mRNA表达的变化.方法:构建克隆载体pMD18-T-ε作为定量模板,进行TaqMan实时荧光定量PCR反应,同时测定该法的灵敏性、特异性和重复性.同法检测大鼠股薄肌支配神经损伤修复后不同时间肌肉标本内nAChR ε亚单位mRNA表达的变化.结果:用该方法检测nAChR ε亚单位mRNA表达,其线性检测范围为6个数量级,最低检测下限为1×102拷贝,最高检测上限为1×107拷贝.大鼠股薄肌支配神经损伤后,与对照组相比ε亚单位mRNA表达的拷贝数先增加后减少,在术后第3周降到最低后又逐渐增高,但到术后30周仍处于低水平(P<0.01).结论:采用TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测nAChR ε亚单位mRNA的表达水平具有灵敏度高、特异性强、重复性好、线性检测范围宽的优点.神经损伤再生的晚期ε亚单位mRNA表达水平较损伤前有所降低.     

定量RT-PCR测定冠心病患者外周血Siglec-1(CD169)的基因表达水平

目的:建立检测人Siglec-1(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins,唾液酸结合的免疫球蛋白样凝集素1,CD169)mRNA含量的实时荧光定量RT-PCR的方法,并用来测定冠心病患者外周血单个核细胞(PBMCs)中Siglec-1的基因表达水平,探讨Siglec-1基因表达水平与冠状动脉粥样硬化发生发展的关系.方法:基于SYBR Green荧光标记技术,建立实时荧光相对定量RT-PCR方法,在ABI PRISM 7000荧光定量PCR仪上测定了57例冠状动脉粥样硬化性心脏病患者和38例健康对照者外周血中Siglec-1 mRNA的含量.生化常规测定所有入选者血脂水平.结果:冠心病组Siglec-1 mRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组,为健康对照组的3.23(1.28～8.11)倍(P<0.01);其中急性心肌梗死组(AMI)、稳定型心绞痛组(SA)和不稳定型心绞痛组(UA)分别为对照组的3.32(1.38～7.97)、2.56(0.88～7.42)、3.35(1.25～8.96)倍,而三组之间差异无统计学意义;冠心病血脂正常组和血脂异常组的Siglec-1 mRNA平均拷贝数无显著差异.结论:成功建立了人Siglec-1基因表达含量的实时荧光定量RT-PCR检测方法;冠心病患者Siglec-1 mRNA的含量显著高于健康对照组,且其含量高低与血脂无关;Siglec-1 mRNA含量在冠心病患者外周血单核细胞上表达显著升高,说明冠心病患者外周血单核细胞已经发生巨噬细胞化,单核巨噬细胞介导的免疫炎症反应在冠心病发生发展过程中起重要作用.     

实时荧光定量RT-PCR检测人外周血单个核细胞中FOXP3 mRNA的表达

目的：建立实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应（real-time fluorescence quantitative RT-PCR）检测人外周血单个核细胞中FOXP3 mRNA的方法,并研究其与CD4＋CD25＋Treg细胞活性相关性。方法：提取人外周血单个核细胞总RNA,将mRNA逆转录成cDNA,以β-actin为内参照,实时荧光定量RT-PCR检测29例哮喘患儿及24例同龄对照FOXP3 mRNA的相对表达量,采用融解曲线和琼脂糖电泳鉴定PCR产物特异性;同时采用流式细胞技术检测CD4＋CD25＋Treg细胞含量,分析两者相关性。结果：哮喘患儿组CD4＋CD25＋Treg细胞百分率明显低于同龄对照组,P〈0.01;FOXP3 mRNA的表达也显著降低,P〈0.05;FOXP3和β-actin的融解曲线分析表明均仅有单一峰,Tm值分别为82.4℃和87.8℃;琼脂糖电泳显示都仅有单一扩增产物。结论：应用SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR技术检测FOXP3 mRNA表达水平简便易行、结果稳定可靠。初步结果证实,外周血CD4＋CD25＋Treg细胞数量和FOXP3 mRNA表达有相同的趋势,存在一定的相关性。     

实时荧光定量测定人B细胞激活因子受体基因表达水平

目的：建立实时荧光定量聚合酶链反应（RFQ-PCR）检测人B细胞激活因子受体（BAFF-R）含量的方法，及探讨其在外周血单个核细胞（PBMC）中BAFF-RmRNA表达的检测价值。方法：在BAFF-R基因高保守区设计特异性引物和荧光探针，用逆转录（RT-PCR）扩增目的片段实时检测产物的荧光强度，根据标准品建立标准曲线，由软件自动计算出待测样本中BAFF-RmRNA含量，并以BAFF-RmRNA和132MmRNA含量的比值进行BAFF-R表达水平评价。结果：RFQ-PCR检测BAFF-R含量的线性范围为10^∧9～10^∧1pg／ml，低浓度样本批内和批间变异系数（CV）分别为12．5％和11．9％，高浓度样本批内和批间CV分别为8．3％和9．3％。30名健康献血员样本的PBMC中，83％（25／30）有BAFF-RmRNA表达，范围为0．14-1．03。结论：RFQ-PCR检测BAFF-mRNA含量的方法，具有较好的检测灵敏度和重复性。     

结直肠癌组织中BRMS1 mRNA的表达及意义

目的:探讨乳腺癌转移抑制基因1（BRMS1）mRNA在结直肠癌组织中的表达及临床意义。方法:采用RT-PCR法分别检测40例结直肠癌组织和20例正常结直肠组织中BRMS1 mRNA的表达,并分析其与各临床病理特征之间的关系。结果:BRMS1 mRNA在结直肠癌组织中低表达0.420±0.133,在正常结直肠组织中高表达0.836±0.102,差异有统计学意义（P<0.01）。结直肠癌组织中BRMS1 mRNA的表达水平与病人年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤分化程度及浸润深度无关（P>0.05）,而与淋巴结转移呈负相关关系（P<0.01）。结论:BRMS1 mRNA在结直肠癌组织中呈低表达,并有可能成为反映结直肠癌转移潜能的参考指标之一。     

BRMS1 mRNA在直肠癌中的表达及其临床意义

目的探讨乳腺癌转移抑制基因1(BRMS1)mRNA在直肠癌组织中的表达及其临床意义。方法应用RT-PCR法检测80例直肠癌组织及其40例癌旁正常黏膜组织中BRMS1 mRNA的表达。结果 BRMS1 mRNA在直肠癌中低表达(0.467±0.045),在癌旁组织中呈高表达(0.991±0.054),两者相比较差异均具有统计学意义(P<0.01)。直肠癌组织中BRMS1 mRNA的表达水平与直肠癌患者年龄、性别无关(P>0.05),与直肠癌患者的组织分化、淋巴结转移和临床分期有关(P<0.05)。结论BRMS1 mRNA在直肠癌中低表达,且其低表达可能与直肠癌的临床分期、病理分化以及淋巴结转移有关。     

转染BRMS1基因对乳腺癌MDA MB 231细胞体外侵袭力的影响

目的：探讨BRMS1基因对乳腺癌MDA MB 231细胞体外侵袭力的影响。方法：将携带BRMS1基因的真核表达载体pcDNA3.1/myc BRMS1通过脂质体介导稳定转染乳腺癌MDA MB 231细胞;RT PCR检测转染前后细胞中BRMS1mRNA的表达;扫描电镜观察细胞表面超微结构的改变;Boyden小室检测细胞体外侵袭力。结果：转染成功的乳腺癌MDA MB 231细胞其BRMS1mRNA呈高表达;细胞表面超微结构发生改变;体外侵袭力下降。结论:转染BRMS1基因可抑制乳腺癌MDA MB 231细胞的体外侵袭能力。     

鼻咽癌细胞株中乳腺癌转移抑制基因表达的研究

目的:检测乳腺癌转移抑制(BRMS1)基因在不同转移习性的人鼻咽癌细胞株中的表达情况。方法:应用免疫组织化学法和逆转录聚合酶链式反应法在mRNA和蛋白2方面检测人鼻咽癌细胞株高分化磷癌、低分化磷癌、低分化细胞株、高成瘤高转移性细胞株、低成瘤低转移性细胞株中BRMS1的表达。结果:5种细胞株中BRMS1的蛋白表达皆为阳性,在不同转移习性的细胞株中其表达强度明显不同。4种细胞株中扩增出BRMS1 mRNA,而BRMS1 mRNA在高转移性细胞株中未扩增出,高分化鳞癌、低分化鳞癌、低分化细胞株BRMS1mRNA表达水平均显著高于低成瘤低转移性细胞株(P<0.01)。结论:BRMS1的表达与细胞株的转移能力有明显相关性,表明BRMS1可能作为鼻咽癌细胞转移的重要指标。     

胃癌组织中乳腺癌转移抑制基因1的表达及其临床意义

目的: 探讨乳腺癌转移抑制基因1(BRMS1)蛋白在胃癌组织中的表达及其临床意义。方法: 采用免疫组织化学法检测60例胃癌组织及相应癌旁组织60例中BRMS1蛋白的表达情况, 并分析其与各临床病理特征之间的关系。结果: 在胃癌组织中BRMS1蛋白低表达(35.0%), 在癌旁组织中高表达(75.0%), 差异有统计学意义(P<0.01);胃癌组织中BRMS1的表达水平在胃癌患者组织分化程度、淋巴结转移和临床分期间差异均有统计学意义(P<0.01),而在患者性别、年龄、浸润深度和肿瘤大小间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论: BRMS1蛋白在胃癌组织中呈异常低表达, 且其低表达可能与胃癌的发生、发展以及浸润转移有一定关系。     

核酶阻断IGF-1及IGF-1R表达抑制病理性瘢痕形成的研究

目的:探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)及其受体(IGF-1R)在瘢痕组织中的表达水平及核酶对其表达的影响作用.方法:选取2015年5月至2016年7月广州红十字会医院烧伤整形科手术切除的18例患者的病理性瘢痕组织(增生瘢痕9例、瘢痕疙瘩9例),同期收集的20例正常皮肤标本组织,采用苏木精-伊红染色对组织进行观察,采用实时荧光定量PCR技术检测各组织标本的IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平,取瘢痕组织成纤维细胞进行细胞培养获得IGF-1及其受体核酶,取第2-4代生长状态良好的对数生长期细胞+核酶继续培养72h后采用实时荧光定量PCR技术检测IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平.结果:正常皮肤组织、增生性瘢痕组织、瘢痕疙瘩组织中的IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平差异具有统计学意义(P<0.05),组间比较呈现正常皮肤组织<增生性瘢痕组织<瘢痕疙瘩组织的特点且差异均具有统计学意义(P<0.05).正常皮肤组织、增生性瘢痕组织、瘢痕疙瘩组织中的IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平差异具有统计学意义(P<0.05),组间比较呈现正常皮肤组织<增生性瘢痕组织<瘢痕疙瘩组织的特点且差异均具有统计学意义(P<0.05).结论:瘢痕组织中IGF-1 mRNA及其受体mRNA的表达水平高于正常组织,核酶具有阻断IGF-1 mRNA及其受体mRNA表达的作用,可能在抑制瘢痕的形成中发挥作用.     

BRMS1、HDAC1、VEGF-C在乳腺癌组织中的表达及意义

目的探讨BRMS1、HDAC1及VEGF-C蛋白在乳腺癌、乳房纤维瘤及正常乳腺组织的表达及意义。方法采用免疫组织化学方法随机检测60例乳腺癌组织标本BRMS1、HDAC1、VEGF-C蛋白的表达,随机收集乳房纤维瘤组织及其旁正常乳腺组织各20例作为对照组,结合临床病理资料分析其临床意义。结果BRMS1在乳腺癌组织中表达率为60%,在乳房纤维瘤组织中表达率为85%,在正常乳腺组织中表达率为95%,乳腺癌组织中的BRMS1的表达明显低于乳房纤维瘤和正常乳腺组织(P0.05)。HDAC1在乳腺癌组织中表达率为91.7%,在乳房纤维瘤组织中表达率为55%,在正常乳腺组织中表达45%,HDAC1在乳腺癌组织中的表达明显高于乳房纤维瘤和正常乳腺组织(P0.01),乳腺癌中VEGF-C的表达58.3%高于乳房纤维瘤25%和正常组织20%(P0.05)。结论BRMS1、HDAC1和VEGF-C共同参与了乳腺癌的转移,联合检测BRMS1、HDAC1及VEGF-C的表达有助于判断其预后。     

强脉冲光对人体皮肤成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA表达水平的影响

目的 研究强脉冲光(IPL)照射对人皮肤成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA表达水平的影响.方法 用强脉冲光对目标皮肤进行连续照射,在照射前及照射后取照射部位皮肤组织,应用实时荧光定量PCR法测定各时间点成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA的表达水平.结果 连续的强脉冲光照射可以显著提高Ⅰ型前胶原mRNA的表达水平.照射2,3次后皮肤成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA表达[(7.9±1.7)×10-4、(11.1±2.4)×10-4]明显高于照射前[(2.1±0.7)×10-4],P＜0.05.结论 强脉冲光可促进皮肤成纤维细胞Ⅰ型前胶原mRNA的表达,证实了强脉冲光的除皱作用.     

The study on quantitative expression of CD44v6mRNA by real-time RT-PCR with the micro-metastases of gastric cancer

JNANJINGMEDUNIV2005;19(6):30330INTRODUCTION CD44isanintegralmembraneglycoprofeinwithanapparentmolecularmassthatrangesfrom85kDto250kd.Itwasoriginallydescribedasalymphocyto homingreceptoroncirculatinglymphocytes[4],cellad hesion,activationofleukocytes,andmigrationofcells.Atleast20variants(v)ofCD44havebeenreported[57]duetothealternativesplicingof10exons(v1v10)thatencodethemembranesproximalportionoftheextracellu lardomain.Guntherwasthefirsttoshowthattheex pressionofvariantsofCD44endow…     

FoxO1在新疆维吾尔族先天性马蹄内翻足的表达及其临床意义

目的 探讨FoxO1基因在新疆维吾尔族先天性马蹄内翻足(ICTEV)中的表达及FoxO1与先天性马蹄内翻足畸形程度的相关性.方法 运用Western Blot方法检测新疆地区51例维吾尔族先天性马蹄内翻足患儿和25例维吾尔族健康儿童足部肌肉组织中FoxO1蛋白表达水平;应用实时荧光定量PCR测定不同畸形程度维吾尔族先天性马蹄内翻足患儿FoxO1 mRNA相对表达量.结果 Western Blot检测结果显示ICTEV患儿FoxO1蛋白表达水平(0.52±0.23)低于正常儿童(1.61±0.15),两组比较差异有统计学意义(P=0.017).实时荧光定量PCR检测显示,DimeglioⅡ、Ⅲ、Ⅳ型ICTEV的FoxO1 mRNA相对表达量分别为1.02±0.24、0.67±0.15、0.24±0.19;维吾尔族ICTEV畸形程度与FoxO1 mRNA相对表达量呈负相关性(P=0.039).结论 FoxO1基因转录水平随ICTEV畸形程度的加重而逐渐降低,提示FoxO1基因可能参与了维吾尔族ICTEV的整个发病过程.