抗人CD154单抗轻重链可变区基因克隆与序列分析

目的:克隆抗人CD154抗体轻重链可变区基因,并分析其核苷酸序列,为基因工程抗体的构建奠定基础。方法:从分泌能抑制免疫反应的抗人CD154单克隆抗体杂交瘤细胞株 7E8中提取总RNA,合成cDNA第一链后,经PCR扩增获得抗人CD154单抗轻链可变区 (VL)和重链可变区 (VH)基因,分别克隆入pUC18载体,并进行序列分析。结果:①抗体的轻链可变区基因全长为 341bp,编码113个氨基酸,归属于Ig的Vκ2基因,氨基酸序列分析结果显示轻链可变区含有明确的 4个骨架区和 3个抗原决定簇互补区,在第 2 3位和第 93位氨基酸为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两个特征性氨基酸;②抗体的重链可变区基因全长为 354bp,编码118个氨基酸,归属于小鼠IgVH基因,D、J区基因分别属于DSP2.9和JH2,氨基酸序列分析结果显示,重链可变区含有明确的 4个骨架区和 3个抗原决定簇互补区,在第 2 3和第 97位氨基酸为半胱氨酸,是与抗体二硫键形成有关的两个特征性氨基酸。结论:经核苷酸序列分析证明所克隆的基因分别为抗体的轻、重链可变区基因.     

抗人肝癌单克隆抗体重链可变区基因克隆和序列测定

应用反转录ＰＣＲ方法从分泌抗人肝癌单克隆抗体鼠杂交瘤细胞系ＨＢｂ２７中成功地克隆了单抗重链可变区基因，将此基因重组入Ｍ１３噬菌体中，双脱氧链终止法测定了核苷酸序列。经计算机分析，基因全长４０８ｂｐ，编码１３６个氨基酸，并进行了基因同湖泊性分析，结果表明获得的重链可变区基因是具有功能性的，两端引物自带起始码和终止码，可直接插入原核载体中进行表达。     

抗CD3单克隆抗体重、轻链可变区基因的克隆及序列分析

目的：抗CD3单克隆抗体（WuT3)可变区基因克隆及序列分析。方法；采用RT-PCR技术，从WuT3杂交瘤细胞总RNA中扩增VH，VL片段，经酶切后通过链接反应构建重组克隆载体，测序鉴定。结果：通过国际联机检索发现VH，VL基因与Ig同源，分别符合小鼠IgVH,Vк基因特征。VH基因属于鼠重链VH第ⅡB亚类，全长363bp，可编码121个氨基酸；VL基因属于鼠к轻链第Ⅲ亚类，全长330bp，可编码110个氨基酸，结论：成功获得WuT3单抗的重，轻链可变区基因。     

抗转铁蛋白受体单抗可变区基因克隆和序列分析

目的：制备基因工程抗体，减少或消除鼠源性单克隆抗体（ｍＡｂ）在人体内的免疫原性，保留其对人体抗原配体的高度特异性，发展临床导向诊断和治疗，方法：从体外发泌抗转铁蛋白受体ｍＡｂ杂交瘤细胞系７５７９中，对其ｍＡｂ可变区基因进行克隆和序列分析，利用录ＰＣＲ技术扩增轻，重链可变区基因，再分别与ｐＧＥＭ－Ｔ载体连接，并克隆了ＪＭ１０９受体菌之中，利用荧光染色体链终止法测定其序列，采用ＤＮＡＳＩＳ７分析软件和     

9.1C3单克隆抗体轻,重链可变区基因克隆及序列分析

９．１Ｃ３分子是一种参与ＮＫ、巨噬细胞及ＬＡＫ细胞杀伤过程的重要细胞表面分子，主要表达于外周血单个核细胞表面。本文运用分子生物学技术，从分泌９．１Ｃ３ＭＣＡｂ的杂交瘤细胞中提取总ＲＮＡ，经反转录、ＰＣＲ分另１１分离了９．１Ｃ３ＭｃＡｂ轻链可变区（ＶＬ）基因及重链可变区（ＶＨ）基因，并用全自动荧光ＤＮＡ序列分析仪对９．１Ｃ３ＶＨ、ＶＬ基因序列进行了分析。结果表明：９．１Ｃ３ＶＨ基因为３５１ｂＰ，编码１１７ａａ残基，９．１３ＶＬ为３２４ｂＰ，编码１０８ａａ残基；从推导出的氨基酸序列分析证实９．１Ｃ３ＶＨ、ＶＬ序列均符合小鼠ｌｇ可变区的氨基酸序列特征；根据Ｋａｂｂａｔ分类体系，９．１Ｃ３ＶＨ隶属Ｉｇ重链第Ⅱ（Ｃ）亚组，９．１Ｃ３ＶＬ隶属小鼠ＩｇＫ链第Ⅴ亚组。９．１Ｃ３ＶＨ、ＶＬ基因的克隆成功为其单链抗体的构建、表达奠定了良好的物质基础。     

抗bFGF McAb制备、鉴定及轻链可变区基因克隆和序列分析

目的以重组人碱性成纤维细胞生长因子为抗原免疫小鼠,建立多株稳定分泌bFGF单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞.并对bFGF单克隆抗体(McAb)可变区基因进行扩增及序列分析.方法采用Western blot法和免疫沉淀法对抗体特异性和Ig类型进行鉴定,同时,应用分子生物学技术,对Vk基因的DNA片段进行克隆,并对4a2Vk基因进行序列测定.结果bFGF单克隆抗体可特异性结合人重组bFGF抗原,且均为IgM.由杂交瘤4a2、3d3细胞株扩增Vk基因是由330个碱基组成,编码110个氨基酸残基.通过国际联机检索进行EMBL和Kabat基因库扫描发现,4a2VkDNA仅与Ig同源,符合小鼠Ig的Vk基因特征;同源性为90%～98%,应归属于Ig的Vk基因.结论杂交瘤4a2、3d3细胞株可稳定分泌bFGF单克隆抗体,并获得其轻链可变区基因,为进一步构建和表达单链Fv(ScFv)抗体打下良好的基础.     

抗HSV糖蛋白单克隆抗体重链可变区DNA的克隆及序列分析

作者从分泌具有高中和活性和高保护作用的抗ＨＳＶ型共同性糖蛋白Ｃ的鼠源性单抗的杂交瘤细胞１Ａ１２／４Ｄ５中提取ＲＮＡ，逆转录成ｃＤＮＡ。用合成的寡核苷酸引物从中扩增了抗体的重链可变区基因，并克隆入质粒，随机挑取两个阳性克隆进行核苷酸序列分析，见所克隆基因确可编码小鼠抗体的重链可变区。     

抗SEB单克隆抗体可变区基因克隆及单链抗体的基因构建和表达

目的 从分泌抗SEB的单克隆抗体(FMU-SEB-No.1)杂交瘤细胞中,克隆出FMU-SEB-No.1重链和轻链可变区(VH和VL)基因,构建FMU-SEB-No.1单链抗体(scFv)的原核表达载体,并进行scFv基因的蛋白表达.方法 从FMU-SEB-No.1杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR扩增出VH和VL基因;通过在引物上设计linker序列,拼接VH和VL为完整FMU-SEB-No.1的scFv基因(FMU-SEB-scFv).将测序正确的scFv基因克隆入PGEX4T-1载体,转化入E.coli BL21(DE3)进行蛋白表达.通过SDS-PAGE,Western blot法分析其表达水平和特异性,酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定其抗原结合活性.结果 测序结果显示,本实验成功克隆出FMU-SEB-No.1重链及轻链可变区基因,并成功构建FMU-SEB-scFv基因,所得的基因全长为750 bp,编码250个氨基酸.SDS-PAGE和Western blot分析表明,PGEX4T1-FMU-SEB-scFv在E.coli BL21(DE3)可表达为Mr约54 000的可溶型scFv/GST融合蛋白.间接ELISA检测结果表明,可溶型scFv/GST融合蛋白与SEB具有较高的抗原结合活性.结论 制备并鉴定了针对SEB的基因工程抗体,为开发出针对SEB的治疗性抗体奠定了实验基础.     

抗迟缓爱德华菌独特型单克隆抗体轻链可变区基因的克隆及序列分析

迟缓爱德华菌(Edwardsiella tarda)属肠杆菌科,为革兰氏阴性菌,兼性厌氧,周生鞭毛,无荚膜,无芽孢[1].该菌引起的原发感染或继发感染,对人或鱼类的致病性均较严重[2,3].为了构建迟缓爱德华菌抗独特型抗体基因工程疫苗,我们应用RT-PCR的方法,从分泌迟缓爱德华菌抗独特型的杂交瘤细胞株1E11中克隆出抗体轻链可变区(VL)基因,并进行了克隆和序列分析.     

CLONING AND SEQUENCE CHARACTERIZATION OF THE RE-ARRANDED VH GENE FROM HYBRIDOMA CELLS SECRETING ANTI-HUMAN C1-INHIBITOR McAb

由分泌抗人Ｃ１－ＩＮＨＭｃＡｂ的杂交瘤Ｆ７细胞株提取总ＲＮＡ，合成与ＶＨ基因ＦＲ１和ＦＲ４互补的通用引物，以ＲＮＡ反转录合成的第一链ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ法克隆出Ｆ７ＶＨ基因的ＤＮＡ片段。将分离获得的目的ＤＮＡ片段亚克隆入ｐＵＣ１８／１９测序载体，从两头进行双脱氧核苷酸随机终止法的ＤＮＡ序列测定。结果显示：ＶＨ基因是由３３３个碱基组成，编码１１１个氨基酸残基。通过国际联机检索进行ＥＭＢＬ和Ｋａｂａｔ基因库扫描发现，Ｆ７ＶＨＤＮＡ仅与Ｉｇ同源，符合小鼠Ｉｇ的ＶＨ基因特征；同源性为６０％～８５％，应归属于Ｉｇ的ＶＨ基因。根据Ｋａｂａｔ分类方法，Ｆ７ＶＨ基因推导的氨基酸顺序属于小鼠Ｉｇ的ＶＨ基因的Ⅱ（Ａ）亚组，是由ＶＨ－Ｄ－ＪＨ３重排产生；其框架区的９和６７位点为脯氨酸（Ｐｒｏ）和赖氨酸（Ｌｙｓ）（非芳香族氨氨酸），符合Ⅱ（Ａ）亚组框架残基结构模式；其ＣＤＲ３区含有７个氨氨酸残基，表明Ｃ１－ＩＮＨ抗原表面结构并不复杂；ＦＲ２和ＦＲ３的２２和８９位点为半胱氨酸残基（Ｃｙｓ），与ＶＨ片段二硫键形成有关。成功获得Ｆ７ＶＨ基因为进一步构建和表达单链Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体打下良好的基础。     

抗人C1q杂交瘤细胞中一未知DNA片段的克隆与分析

使用一对ＩｇＶＨ通用引物，应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从分泌抗人Ｃ１ｑＭｃＡｂ的Ｂ６杂交瘤细胞株总ＲＮＡ扩增出－３８７ｂｐ的ＤＮＡ片段。通过计算机网络系统对其进行序列的类似性检索，未发现与之一致或显著相似的序列。     

CEA单抗轻重链可变区基因的克隆和序列分析

从分泌具有高亲和力和特异性的小鼠抗癌胚抗原（ＣＥＡ）的单抗杂交瘤细胞株Ｃ５０中提取总ＲＮＡ，通过ＲＴＰＣＲ扩增并克隆了抗体的轻、重链可变区基因。核苷酸序列分析表明所克隆基因分别为抗体轻、重链可变区基因。     

重组人γ-干扰素单克隆抗体杂交瘤细胞建株研究

本文报道重组人γ-干扰素单克隆抗体杂交瘤细胞株建立的方法及结果。为获得供融合用的小鼠脾细胞,用两种不同的方案免疫了两组(每组3只)BALB/c小鼠。血清抗体效价最高的第4号小鼠,于加强免疫4天后取脾,制成脾细胞悬液。按照常规方法与小鼠骨髓瘤SP 2/0·Ag 14细胞融合。采用直接中和试验法筛选融合细胞孔的上清液,从中选出两株(A3和B3)分泌抗重组人γ-干扰素的杂交瘤细胞。交叉中和试验显示,A_3和B_3抗体只中和重组或自然的人γ-干扰素;与α-干扰素或β-干扰素无反应。此两株单克隆抗体的效价分别超过128,000和25,600。双扩散试验证明,A_3和B_3均为小鼠IgG_1型抗体;液氮中保存半年以上,仍保持原有的各种特性。     

分泌抗骨肉瘤单克隆抗体杂交瘤细胞建株研究

用人体骨肉瘤细胞株HOS-8603脾内一次性免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞 NSO融合,经ELISA和 FIA筛选,获得2株分泌抗人体骨肉瘤单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株(OS-MAb_1)和OS-MAb_2)。用ABC 免疫酶标法检测发现(OS-MAb_1)杂交瘤细胞所分泌的 McAb,除对人体骨肉瘤组织呈阳性反应外,对部分骨巨细胞瘤、软骨肉瘤和尤文氏肉瘤组织呈阳性反应,而对其它肿瘤组织和正常成人及胎儿组织呈阴性反应。同位素~(125)I标记该抗体,在荷人骨肉瘤裸鼠体内定位,发现72小时起到96小时肿瘤放射性影像清晰,放射性积聚高于其他部位。显示OS-MAb_1株所分泌的抗人体骨肉瘤McAb作为定位诊断和导向治疗载体的可能性。     

刀豆凝集素单克隆抗体特性分析和初步应用

建立了一株能分泌抗刀豆凝集素(ConA)单克隆抗体(McAb)的细胞株-CA2。ELISA证实所得 CA2 McAb仅与 ConA有反应,而与菜豆凝集素(PHA)、美洲商陆(PWM)、花生凝集素(PNA)、扁豆凝集素(LcA)以及牛血清白蛋白(BSA)都无交叉反应。免疫印迹试验进一步证实该McAb 只能与 ConA 形成免疫沉淀线。该McAb 能抑制 ConA对RLc-802细胞的凝集作用,竞争抑制试验显示α-甲基甘露糖、果糖不能抑制 CA2 McAb与 ConA 的结合,提示它可能是针对 ConA蛋白结合点部位抗原决定簇的 McAb。应用该McAb证实了急性T淋巴细胞白血病细胞株Molt_4、CEM和B淋巴母细胞CCRF-sb以及转化的扁桃腺淋巴细胞表面膜存在有分子量大小不同的 ConA受体,提示同是ConA受体,可能具有不同的生物学功能。     

ESTABLISHMENT AND CHARACTERIZATION OF PERMANENT MURINE HYBRIDOMAS SECRETING MONOCLONAL ANTI-THY-1 ANTIBODIES *

Hybridomas secreting anti-Thy-1 antibodies were produced by fusing cells of the mouse myeloma line P3-NSI/1-Ag4-1 (NS-1) with spleen cells from AKR/J mice immunized with C3H/Di thymus cells and by subsequent growth in tissue culture and selection of the hybrid cells. Two permanent hybridomas, 1B5 and 1aG4/C5, secreting antibodies of IgG3 subclass were isolated by repeated cloning of cells by dilution and in soft agar. Growth of the hybrid cell colonies depended on the presence of feeder cells; spleen cells at 1-2 X 10⁶/ml were most effective, then thymus cells at 1-4 X 10⁶/ml and peritoneal cells at a concentration 1-2 orders of magnitude lower. The two hybridomas were grown in vitro or in vivo and their products were further analysed. In tissue culture in serum-free medium under the optimum conditions the supernatant from hybridoma 1B5 contained 0.07 mg/ml of antibodies and that from hybridoma 1aG4/C5 had 0.26 mg/ml of antibodies, whereas ascites 1B5 contained 3.6 mg/ml and ascites 1aG4/C5 4.4 mg/ml of antibodies. A very low electrophoretic mobility of both antibodies facilitated their isolation. The specificity of the antibodies was tested in the cytotoxicity assay in the presence of complement and by the binding of isotopically labelled antibodies to thymus cells from A/Ph mice and other Thy-1.2⁺ strains and A. Thy-1.1 and AKR/J mice. Antibodies of clone 1aG4/C5 were specific for Thy-1.2⁺ cells, whereas antobodies of clone 1B5 at higher concentrations also reacted with Thy-1.1⁺ cells from the thymus and lymph nodes. Both antibodies killed more than 95% thymus cells and 60-70% lymph node cells in the cytotoxicity assay. The specificity of antibodies for T lymphocytes was confirmed in the functional test in which the antibodies eliminated the response of spleen cells to Concanavalin A but did not affect the response to lipopolysaccharide in the presence of complement.     

抗HSV糖蛋白单克隆抗体可变区基因的克隆和序列测定

选用具有动物体内高保护作用的抗ＨＳＶ－１／ＨＳＶ－２型共同性糖蛋白Ｃ（ｇＣ）单克隆抗体１Ａ１２，从其杂交瘤细胞中提取总ＲＮＡ，以Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５为引物反转录合成ｃＤＮＡ，用一对鼠抗体通用ＶＨ引物和一对Ｖ引物进行ＰＣＲ，扩增出１Ａ１２ＶＨ和１Ａ１２ＶＬ基因，并分别克隆入ｐＵＣ１８质粒中，序列分析结果表明，１Ａ１２ＶＨ基因由３３６ｂｐ组成，编码１１２个氨基酸，隶属于小鼠重链第３组亚组（Ｄ）；１Ａ