NKG2D配体的表达直接影响NK细胞对不同发育阶段DC的杀伤

目的:探讨NKG2D配体在不同发育阶段树突状细胞(DC)表面的表达及其对自然杀伤(NK)细胞杀伤活性的影响.方法:用细胞因子(rh IL-4、rhGM-CSF、TNF-α)体外诱导培养单核细胞来源的未成熟树突状细胞(iDC)和成熟树突状细胞(mDC)并鉴定形态和表型,免疫磁珠法分离纯化NK细胞.流式细胞术(FCM)检测iDC和mDC表面NKG2D配体MICA/B、ULBP1-3的表达.用LDH释放法检测NK细胞对iDC和mDC的杀伤活性以及抗NKG2D单克隆抗体(mAb)阻断NK细胞后的杀伤活性.结果:培养的iDC和mDC具有典型的细胞形态和免疫表型特征.iDC表面表达MICA、MICB、ULBP1、ULBP3,表达率分别为(32.39±8.30)%、(17.75±3.40)%、(26.71±6.48)%、(38.37±6.89)%;mDC表面表达MICA 、ULBP3,表达率分别为(7.82±2.67)%、(8.36±2.42)%,比iDC表面相应配体表达率低(P<0.01).各效靶比NK细胞对iDC的杀伤活性均比对mDC的杀伤活性高,差异有统计学意义(P<0.01).抗NKG2D mAb阻断NK细胞后对iDC杀伤活性比阻断前减弱(P<0.05);对mDC的杀伤活性与阻断前相比无统计学意义(P>0.05).结论:NKG2D配体在iDC表面表达高,介导了NK细胞对iDC的杀伤,而对mDC的杀伤无影响,是NK细胞对iDC选择性高杀伤的分子机制之一.     

膜型/分泌型MICA对NK细胞受体NKG2D的相反调节效应及其对NK细胞受体谱的影响

目的　观察膜型和分泌型MICA对NK细胞受体表达的影响 ,以探讨NK细胞抗肿瘤活化机制及肿瘤细胞表达MICA分子的意义。方法　用MTT法测定人NK细胞系 (NK92 )的细胞毒活性 ;用RT PCR或FACS检测NK细胞受体 (NKG2D ,NKG2A B ,KIR2DL1,KIR2DS1)及NKG2D的识别配体MICA的表达。结果　肿瘤细胞表面的MICA分子可上调NKG2D的表达 ,下调抑制性受体NKG2A B和KIR2DL1的表达 ;而分泌型MICA (sMICA)分子对NKG2D及抑制性受体的表达均有抑制作用。结论　膜型MICA分子可上调NKG2D的表达 ,激发NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒效应 ;分泌型MICA分子则通过降低NKG2D的表达下调机体的抗肿瘤免疫效应 ,肿瘤细胞分泌sMICA分子为肿瘤发生免疫逃逸的机制之一。     

Raji细胞逃逸NK细胞免疫杀伤机制的初步探讨

目的 探讨人B细胞淋巴瘤Raji细胞逃逸NK细胞免疫杀伤的机制.方法 以K562细胞作为对照,应用LDH释放法检测不同效靶比时同种异体NK细胞杀伤Raji细胞的活性.并分别用PCR方法和流式细胞仪检测K562和Raji细胞MICA/B、ULBP1-3、HLA基因型和分子的表达情况.效靶比20∶1时用单抗分别阻断K562和Raji细胞表面MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3和HLA-Ⅰ类分子,观察NK细胞对其杀伤活性的变化.结果 不同效靶比时NK细胞杀伤Raji细胞的活性明显低于杀伤K562细胞的活性,二者之间差异有统计学意义(P<0.05).K562细胞表达MICMB和ULBP1～3基因和分子,不表达HLA-Ⅰ类分子,Raji细胞表达ULBP1～3基因和HLA-Ⅰ类分子,不表达MICA/B和ULBP1～3分子.Raji细胞HLA基因型为A*3、3.B*71、71,Cw3、4.用单抗封闭MICMB和ULBP1～3分子后,NK细胞对K562细胞的杀伤活性明显降低,对Raji细胞的杀伤活性无明显改变.结论 Raji细胞逃逸NK细胞免疫杀伤机制和Raji细胞高表达HLA-Ⅰ类分子,不表达NKG2D的配体MI-CA/B和ULBPI～3有关.     

三氧化二砷提高多发性骨髓瘤ARH-77细胞对NK细胞杀伤敏感性的研究

目的 研究三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)前后人多发性骨髓瘤ARH-77对NK细胞杀伤细胞敏感性的变化,并初步探讨其机制.方法 分别应用CCK-8法和台盼蓝染色法测算ATO对ARH-77细胞株的50%抑制量(IC50)和细胞活性;乳酸脱氢酶释放法检测ATO作用前后ARH-77细胞对NK细胞的杀伤敏感性.流式细胞仪检测ARH-77细胞表面NKG2D配体(MICA/B、ULBP1、ULBP2、ULBP3)和HLA-Ⅰ类分子表达以及ATO作用前后的细胞周期变化.结果 ATO对ARH-77细胞的IG50为5.0μmol/L.NK 细胞杀伤ATO作用前后ARH-77细胞的活性有显著差异(P＜0.05).ATO作用后,ARH-77细胞发生G1/S期阻滞,同时其表面MICA/B、ULBP1、ULBP3表达显著升高,二者之间差异有统计学意义(P＜0.05).ULBP2和HLA-Ⅰ类分子无明显变化(P＞0.05).结论 ATO能提高ARH-77细胞NKG2D配体(MICA/B、ULBP1、ULIBP3)表达;从而使其对NK细胞的杀伤敏感性增强.     

同种异体NK细胞对不同肿瘤细胞的体外杀伤活性及其机制的初步探讨

为了观察同种异体NK细胞对不同肿瘤细胞的体外杀伤活性,并初步探讨其分子机制。以K562细胞为对照,应用LDH释放法检测不同效靶比时同种异体NK细胞杀伤CNE2、KG1a和U251细胞的活性。应用RT-PCR和流式细胞仪分别检测4种细胞MHCI类链相关分子(MICA/B)和人巨细胞病毒糖蛋白UL16结合蛋白(ULBP1~3)基因和分子的表达情况。效靶比20∶1时用AMO-1、BMO-1、M295、M310和M551单抗分别阻断肿瘤细胞表面MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3分子,观察NK细胞对其杀伤活性的变化。结果:NK细胞对K562、CNE2和KG1a细胞均有杀伤活性,对U251细胞无杀伤活性。在mRNA水平4种细胞均表达MICA/B和ULBP1~3基因。K562细胞表达MICA/B和ULBP1~3全部分子;KG1a和U251细胞均不表达5种分子;CNE2细胞表达MICA/B和ULBP2,不表达ULBP1和ULBP3。CNE2、KG1a和U251细胞均高表达HLAI分子,而K562细胞不表达。用单抗分别阻断靶细胞表面相应的NKG2D配体分子,NK细胞对KG1a和U251细胞的杀伤活性无变化。NK细胞对K562和CNE2细胞的杀伤活性可部分被封闭。同种异体NK细胞在体外对不同肿瘤细胞的杀伤活性不同,其杀伤机制也不完全相同。     

NKG2D配体在鼻咽癌细胞的表达及其对NK细胞杀伤活性的影响

NK细胞对靶细胞的杀伤活性与其细胞表面的受体和靶细胞表面的配体密切相关，NKG2D为NK细胞活化性受体，表达于所有的NK细胞表面，是介导NK细胞识别和溶解肿瘤细胞的主要活化性受体。NKG2D配体为MHCⅠ类链相关基因产物（MICA、MICB）及ULBPS（人巨细胞病毒UL16蛋白的结合蛋白ULBP1、ULBP2、ULBP3），NKG2D的配体在多种肿瘤细胞表达，其在鼻咽癌细胞的表达尚未见报道。本文通过流式细胞仪技术探讨其在鼻咽癌细胞CNE2的表达情况，并进一步分析其在NK细胞杀伤CNE2细胞中的作用。     

板蓝根多糖促进NKG2D 配体表达增强NK 细胞对食管癌细胞的杀伤作用及机制研究

目的:研究板蓝根多糖(RIP)影响NK细胞对食管癌细胞杀伤作用的分子机制。方法:MTT法检测细胞增殖率,Western blot检测增殖相关蛋白CyclinD1、p21和p27的表达,ELISA法检测培养上清中IFN-γ和TNF-α的表达,流式细胞术检测NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1和ULBP2的表达,钙黄绿素释放法(CARE-LASS)检测NK细胞对食管癌细胞的杀伤率。结果:RIP可促进NK-92细胞增殖,抑制食管癌Eca-109细胞增殖,且具有显著剂量依赖性。食管癌可促进NK细胞中TNF-α和IFN-γ的表达。RIP可促进食管癌细胞Eca-109中NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1和ULBP2的表达,促进与食管癌细胞联合作用后NK细胞中TNF-α和IFN-γ表达,提高NK-92细胞对食管癌Eca-109细胞的杀伤活性。结论:RIP通过提高食管癌Eca-109细胞中NKG2D配体表达,促进NK-92细胞中TNF-α和IFN-γ表达,增强NK-92细胞对食管癌细胞的杀伤作用。     

红色诺卡菌细胞壁骨架多糖组分诱导免疫抗肿瘤作用

目的评价红色诺卡菌细胞壁骨架(Nocardia rubracell wall skeleton,Nr-CWS)多糖组分对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用,对巨噬细胞、NK、LAK、CTL细胞增殖活化的诱导以及对HeLa细胞的杀伤作用,并阐述其诱导免疫发挥抗肿瘤作用的机制。方法 MTT法检测Nr-CWS多糖组分对HeLa细胞的抑制作用和促进NK、LAK、CTL细胞及对宫颈癌HeLa细胞的杀伤作用;采用ELISA法分别测定经Nr-CWS多糖组分作用后NK、LAK、CTL细胞中IL-12、IFN-γ等相关炎症因子水平,Real-time PCR检测NK、LAK和CTL细胞NKG2D mRNA表达,Western blot检测NK、LAK和CTL细胞NKG2D蛋白表达和HeLa细胞NKG2D配体ULBP1、ULBP2和MICA的蛋白表达;评价Nr-CWS多糖组分诱导免疫和杀伤肿瘤细胞的作用。结果 Nr-CWS多糖提取物具有明显增强NK、LAK、CTL细胞增殖活化和杀伤宫颈癌HeLa细胞的作用,并呈剂量-时间依赖性,同时上调HeLa细胞NKG2D配体表达,使其敏感性增强。结论 Nr-CWS多糖提...     

结肠癌患者单核或树突状细胞MICA的表达及其与NK细胞活性的关联

目的:观察结肠癌患者单核或树突状细胞是否表达MHCⅠ类相关抗原A(MICA),并分析MICA+单核细胞的频率是否与患者体内NK细胞的活性相关联。方法:首先利用流式细胞仪检测MICA在外周血单核细胞和由单核细胞诱导而来树突状细胞(DCs)上的表达;并用IL-15和IFNα-刺激树突状细胞,观察MICA表达的变化;然后检测患者外周血NKG2D+、CD16+、CD69+NK细胞的频率及NK细胞的杀伤活性;最后分析MICA+单核细胞的频率是否与NK细胞表达NKG2D及其杀伤活性关联。结果:与健康个体相比,结肠癌患者MICA+单核细胞的频率无显著变化。未成熟DCs表达MICA,但受IL-15和IFNα-刺激后,结肠癌来源的DCs表面MICA的表达无显著上调。结肠癌患者外周血NKG2D+、CD69+NK细胞的频率显著降低,NK细胞的杀伤活性显著降低,而CD16+NK细胞的频率无明显变化。结肠癌患者MICA+单核细胞的频率与NK细胞表达NKG2D无明显关联,但与NK细胞杀伤靶细胞时CD107a的表达正相关。结论:结肠癌患者体内单核细胞表达MICA与NK细胞表达NKG2D无关,但高频率MICA阳性的单核细胞与NK细胞的抗肿瘤活性正相关。     

5-氟尿嘧啶增强HeLa细胞对自然杀伤细胞敏感性研究

目的 用5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)处理HeLa细胞,检测其NKG2D 配体 MICA 的表达及其对NK92细胞杀伤敏感性的变化.方法 不同浓度的 5-FU处理 HeLa细胞,在不同时间点用半定量PCR及流式细胞术检测HeLa细胞表面的NKG2D配体MICA在RNA及蛋白水平的表达变化情况,用MTT法检测NKG2D抗体封闭NK92细胞的NKG2D受体前后, NK92 细胞对HeLa细胞的杀伤作用.结果 不同浓度的5-FU作用于 HeLa 细胞后,半定量RT-PCR结果显示MICA表达随5-FU作用浓度增加逐渐增高.而且40 μg/ml 5-FU作用于HeLa细胞后随着作用时间的延长(0、8、16、24 h)MICA表达增加,流式细胞术检测结果表明,MICA表达的增加主要依赖于未凋亡细胞的 MICA表达.在40μg/ml 5-FU作用24 h,效靶比为2.5∶ 1,5∶ 1,10∶ 1,20∶ 1时都检测到NK92细胞对HeLa细胞的杀伤增强,杀伤作用可部分被NKG2D抗体抑制.结论 5-FU 能够上调HeLa细胞表面NKG2D配体MICA的表达,增强HeLa细胞对NK92细胞的敏感性,提示化疗联合NK细胞免疫治疗宫颈癌可产生协同作用,提高治疗效果.     

T cells,dendritic cells and epithelial cells in intestinal homeostasis

The mucosal immune system of the intestinal tract is continuously exposed to both potential pathogens and beneficial commensal microorganism. A variety of mechanisms contribute to the ability of the gut to either react or remain tolerant to antigen present in the intestinal lumen. Antigens of the gut commensals are not simply ignored, but rather trigger an active immunosuppressive process, which prevents the outcome of immunopathology. The aim of this review is to provide an update on the mechanism of intestinal homeostasis, with particular focus on the complex crosstalk between T cells, dendritic cells and intestinal epithelial cells.     

脂肪来源干细胞诱导分化为神经元样细胞的实验研究

目的： 研究脂肪来源干细胞（ASCs）的分离、纯化、扩增以及在体外定向分化为神经元样细胞的能力。 方法: 获取并培养正常人的ASCs，倒置显微镜下观察其形态；流式细胞仪检测其免疫表型。全反式维甲酸（ATRA）诱导ASCs在体外分化为神经元样细胞，倒置显微镜观察神经元样细胞的形态，逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测巢蛋白基因的表达；免疫组织化学染色法和Western blotting法检测神经丝蛋白（NF）和神经元烯醇化酶（NSE）的表达。 结果: ASCs呈纤维样贴壁生长，体外培养易扩增；ASCs表达相关抗原CD29和CD105，不表达CD31、CD34、CD45和HLA-DR；不同扩增代数的ASCs经诱导剂的作用可呈现典型的神经元样细胞形态，巢蛋白基因及NF、NSE均呈阳性表达。 结论: 脂肪组织中分离培养的ASCs具有体外大量扩增并保持低分化状态的特性，以及定向分化为神经元样细胞的能力, 是一种可用于神经系统疾病治疗的种子细胞。     

胚胎干细胞诱导发育为树突状细胞的研究

目的：探讨胚胎干细胞（ESC）诱导分化为树突状细胞（DC）的实验方法，实现体外大规模扩增高纯度DC用于临床免疫治疗。方法：E14小鼠胚胎干细胞系在GM-CSF与IL-3联合作用下经胚胎体（EB）诱导分化为DC。不成熟DC （im-DC）流式细胞仪检测CD11c、CD80、CD86、MHC II-DR表达。用磷酸脂多糖（LPS）促进DC的成熟，收获细胞后观察细胞形态及摄片并做扫描电镜检查，分析细胞表型并与不成熟DC细胞表型做对比，异体淋巴细胞增殖实验行功能检测。结果：ES细胞来源DC呈典型DC形态学表现。im-DC CD11c、CD80、CD86、MHC-II表达低,m-DC CD11c、CD80、CD86、MHC-II的表达均较前明显升高。功能检测发现，ES细胞来源的DC具有强烈的激发同种异体淋巴细胞增殖的作用，证实ES细胞来源的DC具备正常的免疫学功能。结论：使用GM-CSF联合IL-3能成功诱导E14胚胎干细胞发育为DC。故ES细胞可作为DC来源的一条新途径，对于体外大规模制备DC用于免疫过继治疗提供了一个较好的方法。     

NT-3基因修饰施万细胞促进神经干细胞体外分化为神经元样细胞

目的：观测神经营养素-3（NT-3）基因修饰施万细胞(SCs)对神经干细胞体外分化为神经元样细胞的影响。方法：神经干细胞(NSCs)分别与NT-3基因修饰SCs（NT-3-SCs）、LacZ基因基因修饰SCs（LacZ-SCs）和SCs在体外共培养，7d后用免疫组化方法观测NSCs的分化并计算其中神经元样细胞的分化率。结果：NSCs在体外可分化为神经元样细胞（NF阳性）和神经胶质样细胞（GFAP阳性），与未基因修饰的SCs相比，NT-3-SCs能更有效地提高神经元样细胞的分化率，而LacZ-SCs与SCs没有明显区别。结论：NT-3-SCs能促进NSCs向神经元样细胞分化。     

后肾细胞微环境诱导胚胎干细胞向肾系细胞分化的实验研究

目的: 探讨胚胎后肾细胞微环境诱导胚胎干细胞(ESCs)分化为肾系细胞的作用。方法: 小鼠D3系胚胎干细胞通过悬滴法制备拟胚体(EBs),将EBs细胞与取自孕12.5 d小鼠胚胎的后肾细胞通过间接共培养以诱导其分化,即为共培养诱导组,设EBs细胞自然分化为对照组;采用免疫荧光染色法检测共培养第3、5、7 d后的EBs细胞Pax2、WT-1蛋白表达情况,通过逆转录PCR法检测诱导3 d后的EBs细胞Pax2、WT-1、Lim1、Sall1、Emx2、GDNF、Wnt4、BMP7、Nephl、Nephrin、KSP和CD24 mRNA的表达情况。结果: EBs细胞在诱导的第3 d即出现了全部肾发育相关基因的表达,其中共培养组Pax2、WT-1、Emx2、GDNF、Nephl、Nephrin、KSP和CD24的表达强于对照组;免疫荧光结果显示在诱导3 d后的EBs细胞中可观察到Pax2阳性细胞,阳性细胞数在共培养第5、7 d增多;诱导5 d后可观察到WT-1阳性细胞,对照组未见Pax2或WT-1蛋白阳性细胞出现。结论: 后肾细胞微环境可促进ESCs分化为肾系细胞。     

Electrophysiological characteristics of hippocampal complex-spike cells and theta cells

Summary Stimulating electrodes were chronically implanted in the ventral hippocampal commissure and the entorhinal cortex or angular bundle of rats. Moveable metal microelectrodes which could be passed through the hippocampus were implanted. All hippocampal units were classified as complex-spike cells or theta cells on the basis of the form of their action potentials and their rates of firing in various behaviors. Field potentials and unit firing evoked from the stimulating electrodes were recorded during slow wave sleep.Complex-spike cells (1) could often be antidromcally activated in CA3 (it was not attempted in CA1); (2) could only be induced to fire one or two action potentials in response to a single stimulus; (3) had action potentials at the same time as the local population-spike and, in condition-test studies, were depressed when the population-spike was depressed. (The population-spike is presumably the summed synchronous action potentials of pyramidal cells.)Theta cells: (1) were antidromically activated in only one out of 25 cases; (2) usually could fire long bursts of action potentials in response to a sufficiently intense single stimulus; (3) this firing occurred before, during, and after the local orthodromic population-spike.Most complex-spike cells in Ammon's horn must be pyramidal cells (projection cells), and vice versa. The case for theta cells is more difficult. Some are non-pyramidal cells with locally ramifying axons, but at least some are projection cells. The data is consistent with most of them being inhibitory interneurons, but this is not established.This work was supported in part by Grants NS 12664 and NS 14497 from the National Institutes of Health and BNS 77-09375 from the National Science Foundation to J.B. Ranck, Jr. and N.I.H. Grant NS 10987 to VE. Amassian. The results have been presented in preliminary form elsewhere (Fox and Ranck 1977; Fox 1978)     

抗原致敏DC与CIK共培养体外抗肾癌效应的研究

目的： 探讨肾癌(RCC)抗原致敏树突状细胞(DC)与同源细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)共培养后的DC-CIK细胞对RCC的杀伤活性。 方法： 将健康成人外周血单个核细胞（PBMC）来源的DC经RCC(786-0细胞株)抗原致敏后与同源CIK细胞共培养，实验分3组：RCC抗原致敏DC与CIK共培养组（A组），未致敏DC与CIK共培养组（B组），单纯CIK组（C组）。流式细胞仪检测DC及CIK免疫表型。MTT法检测3组效应细胞对786-0细胞杀伤活性。 结果： 效靶比 20∶1 时，A、B、C组对786-0细胞杀伤活性分别为（70.64±8.26）%、（53.40±7.33）%、（46.64±6.01）%，各组比较差异显著（P<0.05）；以前列腺癌PC3细胞作靶细胞对照，A组对786-0及PC3细胞的杀伤活性有显著差异（P<0.05）。 结论： RCC抗原致敏DC与CIK共培养后的DC-CIK细胞可明显提高CIK细胞对RCC的杀伤特异性和杀伤活性。     

放射状胶质细胞的研究进展

脊椎动物中枢神经系统(central neural system,CNS)发育过程中,有一类细胞与CNS的发育密切相关一神经干细胞(neural stem cells,NSCs),目前已知的NSCs主要有3种:神经上皮细胞、放射状胶质细胞(radial glial cells,RGCs)、基祖细胞.