ERK1/2MAPK通路在Eca109细胞体外增殖和迁移中的作用及其机制

目的观察ERK1/2 MAPK通路在食管鳞状细胞癌(ESCC)Eca109细胞系增殖和迁移中的作用并探讨其作用机制。方法使用MAPK(ERK1/2)抑制剂U0126处理Eca109细胞;细胞计数检测细胞增殖;倒置显微镜下观察细胞形态;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ERK1/2 mRNA;Western blot检测总ERK1/2(t-ERK1/2)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2);MTT和细胞划痕实验检测细胞增殖和迁移能力;qRT-PCR检测MicroRNA-21(miR-21)。结果20μmol/L浓度的U0126可抑制Eca109细胞生长(P<0.05),破坏细胞正常形态,ERK1/2 MAPK通路的活化在蛋白质水平被抑制(P<0.05),Eca109细胞增殖和迁移明显减弱(P<0.05),显著下调miR-21的表达(P<0.05)。结论ERK1/2 MAPK信号通路抑制可减弱Eca109细胞增殖和迁移,其可能的作用机制之一与其抑制miR-21表达有关。     

食管鳞癌中Klf17蛋白表达及其对Eca109细胞迁移和侵袭能力的影响

目的探讨KLF17与临床病理特征的关系;探讨KLF17对Eca109细胞迁移和侵袭能力的影响及其作用机制。方法采用免疫组化法,检测KLF17在食管鳞癌及癌旁正常食管上皮中的表达;构建KLF17慢病毒过表达载体感染Eca109细胞,细胞分组为转染组(CON)、空载体转染组(Ad-GFP)和慢病毒转染组(Ad-KLF17)。Real timePCR检测KLF17 mRNA的表达、Western blot检测KLF17、E-cadherin和N-cadherin蛋白的表达;细胞划痕实验及体外Transwell实验观察Eca109细胞迁移和侵袭能力。结果 KLF17蛋白表达与侵袭深度、TNM分期显著相关(P0.05);real time-PCR及Western blot结果显示Ad-KLF17组KLF17及上皮标志物E-cadherin表达明显高于Ad-GFP组及对照组(P0.05),而间质标志物N-cadherin表达明显低于Ad-GFP组及对照组(P0.05);划痕实验与体外Transwell实验结果显示Ad-KLF17组细胞迁移距离及细胞数量明显短于和少于Ad-GFP组和对照组(P0.05)。结论 KLF17能抑制Eca109细胞发生上皮-间质转化,与其迁移、侵袭能力相关。     

IL-27活化NK细胞抗肿瘤效应及其机制研究

目的:本文通过研究转染IL-27基因的人食管癌细胞在裸鼠体内的抗肿瘤效应及其对NK细胞表达和功能的影响,旨在探讨其抗肿瘤作用机制。方法:IL-27基因转染的人食管癌细胞(Eca109/IL-27)接种于裸鼠,观察其抗肿瘤效应。用免疫组化法检测移植瘤组织间质中NK细胞浸润数量;ELISA检测脾细胞产生IFN-γ的含量;RT-PCR检测移植瘤组织中IL-12Rβ2、TNF-α和IL-1β基因的表达;LDH法检测NK细胞对其靶细胞K562细胞的杀伤活性。结果:接种Eca109/IL-27细胞荷瘤裸鼠的移植瘤体积较接种野生型Eca109细胞(未转染)和Eca109/LXSN(空载体质粒转染)减小、裸鼠生存期明显延长(P0.05)。接种Eca109/IL-27细胞移植瘤组织中NK细胞浸润数量增多(P0.05),IL-12Rβ2、TNF-α和IL-1β基因的表达水平增高(P0.05)、脾细胞产生IFN-水平增高(P0.05)、NK细胞对其靶细胞K562细胞杀伤活性增强(P0.05)。结论:IL-27在裸鼠体内能够通过活化NK细胞、诱导炎症性细胞因子的产生而发挥抗肿瘤作用。     

转染IL-27基因的食管癌细胞在裸鼠体内的抗肿瘤作用

目的将小鼠IL-27基因转染人食管癌细胞株,研究其在裸鼠体内的抗肿瘤活性.方法以逆转录病毒为载体,将IL-27基因转染人食管癌细胞株Eca109,获得表达IL-27的阳性细胞克隆(Eca109/IL-27),用ELISA法检测细胞IL-27的分泌.将Eca109/IL-27移植裸鼠腹腔,观察瘤细胞的成瘤性和裸鼠的生存期.用RT-PCR检测IL-27基因在裸鼠体内瘤组织中的表达,用流式细胞仪检测CD204表达、细胞周期和细胞凋亡变化.结果成功建立了表达IL-27基因的人食管癌细胞株Eca109/IL-27,该细胞培养上清中IL-27含量为(137.73±7.00)pg/ml,而Eca109/LXSN和Eca109细胞培养上清中未检出IL-27(P＜0.01),但Eca109/IL-27与Eca109/LXSN和Eca109细胞周期和细胞凋亡率无明显差异(P＞0.05).将Eca109/IL-27、Eca109/LXSN 和Eca109细胞分别接种裸鼠腹腔15天后,各组裸鼠均于腹腔形成多数瘤结节,Eca109/IL-27组明显少于Eca109/LXSN 和Eca109细胞组(P＜0.05);Eca109/IL-27组裸鼠的生存期(35天时均无死亡)明显长于Eca109/LXSN 和Eca109细胞组[分别为(23.33±1.52)、(24.00±1.37)天](P＜0.01);Eca109/IL-27组肿瘤组织中有p28和EBI3亚基基因表达,而Eca109/LXSN 和Eca109细胞组瘤组织中未见表达(P＜0.01);其CD204表达水平、细胞凋亡率也明显高于接种Eca109/LXSN与Eca109细胞组(P＜0.05);G0/G1和G2/M期细胞增多,S期细胞明显减少,与接种Eca109/LXSN和Eca109细胞组比较均有显著差异(P＜0.05).结论IL-27可于体内促进肿瘤细胞凋亡,阻滞细胞周期发展,提高CD204的表达,延长生存期,发挥抗肿瘤免疫活性.     

8—Br—cAMP对人食管癌Eca—109细胞生长相关基因表达的影响

目的 探讨８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ对人Ｅｃａ－１０９细胞与生长相关基因表达的影响。方法 体外培育的人食管癌Ｅｃａ－１０９细胞受８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ处理后,用原位杂交,免疫组织化学及ＲＮＡ,蛋白质斑点印迹技术研究了与细胞生长相关的几种基因的表达变化。结果 ８－Ｂｒ－ｃＡＭＰ可减弱ＥＧＦＲ,Ｈ－ｒａｓ,ｃ－ｍｙｃ,突变型ｐ５３等原表达,增强野生型ｐ５３基因表达和ｐ２１＾ＷＡＦ１蛋白的表达。     

柚皮苷通过阻断JAK/STAT信号通路抑制Eca109人食管癌细胞的增殖、侵袭并促进其凋亡

目的 探究柚皮苷(NAR)对Eca109食管癌细胞的增殖活性的抑制作用和凋亡的促进作用及其作用机制.方法 培养Eca109细胞,采用(0、15、30、45) μmol/L NAR处理24、48、72 h.采用细胞集落形成试验评估Eca109食管癌细胞的集落形成能力,噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性,Transwell...     

circ_0044516靶向miR-1281促进食管癌细胞增殖、抑制细胞凋亡北大核心CSCD

目的:探索circ_0044516是否通过靶向miR-1281影响食管癌Eca109细胞增殖和凋亡。方法:将食管癌Eca109细胞分为si-NC组、si-circ_0044516组、miR-NC组、miR-1281组、si-circ_0044516+anti-miR-NC组和si-circ_0044516+antimiR-1281组。采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)测定食管癌组织及Eca109细胞中circ_0044516和miR-1281表达。运用CCK-8法检测Eca109细胞增殖能力,克隆形成实验测定克隆形成,Western blot测定活化的半胱氨酸蛋白酶(cleaved-caspase)3蛋白和cleaved-caspase9蛋白表达,流式细胞术测定细胞凋亡。采用荧光素酶报告实验分析circ_0044516与miR-1281的靶向结合。结果:食管癌组织中circ_0044516表达量比相匹配的癌旁组织增加2.70倍左右,miR-1281表达量较癌旁组织显著减少(P<0.05)。食管癌Eca109细胞中干扰circ_0044516表达或miR-1281过表达可使cleaved-caspase3蛋白、cleaved-caspase9蛋白表达量和凋亡率升高,细胞增殖能力降低,克隆形成数减少(P<0.05)。circ_0044516靶向调控miR-1281的表达。干扰circ_0044516表达对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡的作用被下调miR-1281表达所逆转。结论:食管癌Eca109细胞中干扰circ_0044516表达通过靶向miR-1281抑制细胞增殖并促进其凋亡。     

多种肿瘤干细胞标志物在食管鳞癌Eca109细胞球细胞中的表达

目的 观察肿瘤干细胞标志物P75NTR、Oct-4、Sox-2、Lin28、Nanog在食管鳞癌Eca109细胞系富集的细胞球细胞中的表达。探讨食管鳞癌的肿瘤干细胞标记物。
方法 采用无血清成球培养法,富集培养细胞球细胞,观察其增殖过程。培养5d获得小细胞球继续培养至14d获得又大又圆的悬浮生长的细胞球,收集第14天的细胞球,一部分用于实验,一部分予以传代。应用免疫荧光技术检测细胞球细胞中P75NTR、Oct-4、Sox-2、Lin28、Nanog的表达和定位。结果 P75NTR、Oct-4荧光定位于细胞球细胞的细胞核上,贴壁的Eca109为细胞核和细胞质表达,但是Oct-4荧光强度比P75NTR弱;Lin28在细胞球细胞上为细胞核表达,贴壁的Eca109上为细胞核和细胞质表达;Nanog和Sox-2在食管鳞癌Eca109细胞球细胞和贴壁的Eca109上均为细胞质表达。结论 P75NTR、Oct-4、Lin28核表达阳性的细胞球可能为食管癌干细胞。     

IL-27在RA中的作用机制分析

目的:通过观察IL-27对胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠模型的抗炎效果及病理形态的影响,探索IL-27在类风湿性关节炎(RA)发病中的作用机制.方法:构建CIA小鼠模型,随机分为空白对照组、CIA小鼠+同源IgG干预组(IgG)、IL-27干预组,并于二次免疫后第7天给予相应处理.观察小鼠疾病进展并检测相关炎症因子表达...     

IL-24基因修饰增强CIK细胞对HL-60细胞的细胞毒作用

目的:研究IL-24基因修饰的CIK细胞与同源树突状细胞共培养后对白血病细胞的杀伤作用及其机制.方法:从健康人外周血单个核细胞中常规诱导DC和CIK 细胞,电穿孔法将IL-24基因导入CIK细胞中(获得细胞为CIK-IL24),RT-PCR 和ELISA法检测CIK细胞中IL-24基因的表达,FCM和ELISA法检测转基因前后CIK表型及分泌细胞因子能力的变化,将CIK 细胞和同源DC共培养,FCM法检测共培养的DC-CIK细胞对HL-60细胞细胞毒活性的变化.结果:通过电穿孔法成功将IL-24基因导入CIK细胞,与对照组相比,转IL-24基因后CIK细胞中CD3~+、CD3~+CD56~+细胞的比例无明显改变,CD4~+CD25~+细胞比例显著下降.IL-24可上调CD3+CD56+细胞表面粘附分子CD54、CXCR4的表达,转染IL-24基因后CIK分泌TNF-α和IFN-γ的能力显著增强,与DC共同作用HL-60细胞时转染IL-24基因后的CIK细胞细胞毒活性明显增强.结论:通过IL-24基因修饰,明显增强了CIK细胞对HL-60细胞的杀伤能力,其机制与IL-24促进CIK分泌TNF-α、IFN-γ,上调CIK细胞表面粘附分子的表达,减少CD4~+CD25~+调节性T细胞比例等密切相关.     

神经生长因子在食管鳞癌细胞中的表达及分泌

目的 探讨神经生长因子（NGF)与食管鳞癌细胞分化的相关性。方法 采用有限稀释法分选出圆形和梭形单细胞克隆,采用无血清悬浮培养获得细胞球细胞, 贴壁的Eca109细胞分别在含血清和不含血清培养基中培养48h;分别采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR)技术和免疫印迹法,检测NGF在食管鳞癌细胞中mRNA水平和蛋白水平的表达;免疫荧光技术检测NGF在食管鳞癌细胞中的表达定位;免疫组织化学法检测食管鳞癌组织中NGF的表达定位;用酶联免疫吸附法（ELISA）检测NGF在Eca109细胞培养基中的分泌情况。结果 在Eca109细胞中能检测到NGF的mRNA水平和蛋白水平的表达,其中NGF在细胞球细胞中的mRNA水平和蛋白水平的表达量最高。食管癌组织中检测到NGF表达于细胞质。Eca109细胞在无血清培养条件下能够分泌NGF,且明显高于含血清培养基中的含量。结论 食管癌细胞系Eca109表达并分泌NGF,并且食管癌组织中表达NGF,NGF可能在维持食管鳞状细胞癌的干细胞特性发挥了重要作用。     

IL-17体内外抗肿瘤作用及其机制研究

目的研究IL-17体内外抗肿瘤作用及其机制,为IL-17基因疫苗进入临床提供实验依据。方法建立稳定转染小鼠IL-17全长基因的小鼠乳腺癌细胞(4T1/IL-17)及相应的对照细胞(4T1/pcDNA3.1、4T1),MTS法检测3种细胞的体外增殖情况;流式法检测3种细胞表面MHCI、MHCⅡ、LFA-1分子表达的变化及3种细胞的凋亡情况。建立荷瘤动物模型,观察3种细胞移植瘤在小鼠体内成瘤性、生长情况及小鼠生存期的变化。接种肿瘤细胞6周后分别检测3组小鼠脾细胞CTL杀伤活性、脾细胞增殖情况。用ELISA法检测小鼠脾细胞经刺激后产生IFN-γ、IL-12的情况;流式细胞技术检测4T1/IL-17细胞接种于小鼠体内的细胞凋亡情况及肿瘤组织细胞表面MHCI、MHCⅡ、LFA-1等分子表达的变化。结果转染IL-17基因后在体外对4T1/IL-17、4T1/pcDNA3.1和4T1细胞的增殖;MHCI、MHCⅡ、LFA-1分子表达;细胞凋亡无影响。将4T1/IL-17细胞接种小鼠体内后,荷瘤小鼠的肿瘤生长速度、体积均明显小于4T1/pcDNA3.1细胞组及4T1细胞组,生存时间也明显延长(P<0.05);肿瘤细胞凋亡率明显增高(P<0.05);细胞表面MHCI、MHCⅡ、LFA-1分子表达水平显著性增高(P<0.01);CTL杀伤活性及对ConA刺激的细胞增殖反应性均明显升高(P<0.01);可产生高水平的IFN-γ、IL-12,有显著性差异(P<0.01)。结论 IL-17在体外未显示抗肿瘤作用,IL-17在小鼠体内具有明显的抗肿瘤作用,其抗肿瘤作用与促进肿瘤细胞细胞凋亡及增强机体免疫应答有关。     

白细胞介素-27及其受体的结构与生物学作用

IL-27是由p28和EBI3组成的异二聚体,主要由抗原提呈细胞产生;IL-27R由WSX-1/TCCR和gp130组成。IL-27具有多种生物学作用,能促进T细胞尤其初始CD4T细胞增殖,向Th1细胞方向分化产生IFN-γ,具有诱导Th1反应促炎性作用和减轻炎性反应双重作用,同时在抗肿瘤免疫方面也发挥重要作用。     

IL-27 regulates IL-4-induced chemokine production in human bronchial epithelial cells

IL-4 coordinates the Th2-type immune response in inflammatory diseases such as asthma. IL-27 can inhibit the development of both Th2 and Th1 cells. However, IL-27 can also drive naïve T cells to differentiate toward the Th1 phenotype. In this study, we investigated the effects of IL-27 on the activation of IL-4-induced human bronchial epithelial cells (BEAS-2B). Compared to controls, both IL-4 and IL-27 (25–100 ng/mL) increased the concentrations of CCL2 and IL-8 in a dose-dependent manner. However, compared to cells stimulated individually with IL-4 or IL-27, treatment with a combination of both cytokines reduced CCL2 and IL-8 concentrations in a dose- and time-dependent manner. IL-4 increased the activation of p38 MAPK, ERK1/2, STAT6 and NF-κB, while IL-27 increased the activation of p38 MAPK and ERK1/2 but not STAT6 and NF-κB. Compared to IL-4-stimulated cells, cells treated with both IL-27 and IL-4 displayed decreased activation of STAT6 and NF-κB but not ERK1/2 and p38 MAPK. Taken together, these results suggest that IL-27 plays a pro-inflammatory role when administered alone but downregulates bronchial epithelial cell activation when combined with IL-4. Therefore, IL-27 may be an interesting target for the treatment of Th2 inflammatory diseases.     

IL-27介导的炎症反应在原发性胆汁性肝硬化中的作用

目的 探讨IL-27介导的免疫炎症性反应在原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)发病中的作用.方法 荧光定量PCR、流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组化等方法检测PBC患者IL-27的表达;生化常规测定PBC患者和健康对照者的谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、谷氨酰基转移酶(GGT)水平,分析IL-27与它们之间的相关性.结果 PBC患者外周血IL-27/P28亚基mRNA的表达显著高于慢性乙型肝炎组和健康对照组(P＜0.05),IL-27/EBI3 mRNA未有明显改变;免疫组化结果显示IL-27在PBC患者肝脏呈阳性表达;流式细胞仪检测结果表明IL-27在PBC患者的CD4+T细胞表达率(72.40%±6.22%)较慢性乙型肝炎组(59.40%±7.03%,P＜0.01)和健康对照组(1.70%±0.55%,P＜0.01)明显升高,而IL-27在各研究组的CD8+T细胞、单核细胞、B细胞中的表达无明显变化;PBC患者外周血血清IL-27的表达[(126.25±36.00)pg/ml]显著高于慢性乙型肝炎组[(51.81±23.30)pg/ml,P＜0.01)和健康对照组[(34.19±9.70)pg/ml,P＜0.01],PBC患者IL-27的血清蛋白表达水平与GGT(r=0.554,P＜0.01)和TBIL(r=0.559,P＜0.01)水平呈显著正相关,与ALT、AST和ALP无相关性.结论 IL-27在PBC中表达升高,与PBC的发生发展存在一定的相关性,可能参与了PBC的发病机制.     

逆转录病毒介导IL-27基因对胰腺癌细胞在裸鼠体内的成瘤抑制作用及其机制

目的:探讨IL-27基因在人胰腺癌Aspc1细胞中的抗肿瘤作用及免疫机制。方法:以逆转录病毒为载体,采用基因转染的方法用G418梯度筛选法建立转染IL-27基因的Aspc1细胞,用RT-PCR检测其基因导入,ELISA法检测IL-27的分泌。将Aspc1/IL-27、Aspc1/LXSN和Aspc1细胞接种于裸鼠皮下,观察成瘤性、移植瘤的生长情况。10天时取3组裸鼠脾脏,用ELISA法检测3组小鼠脾细胞在Aspc1诱导下IFN-γ、TNF-α和IL-12的产生情况,乳酸脱氢酶法检测脾细胞杀伤活性。结果:成功建立稳定转染的Aspc1/IL-27细胞株,ELISA检测Aspc1/IL-27细胞培养上清中IL-27的分泌量为(121.56±6.29)pg/ml,而在Aspc1/LXSN细胞和Aspc1细胞的培养上清中未检出IL-27。IL-27基因转染组裸鼠皮下结节生长速度明显慢于接种空载体转染组及未转染组;接种Aspc1/IL-27细胞的裸鼠脾细胞可产生较水平的IFN-γ、TNF-α和IL-12等细胞因子,与接种Aspc1/LXSN细胞和Aspc1细胞组裸鼠的脾细胞相比明显增高(P0.01),接种Aspc1/IL-27细胞的裸鼠脾细胞杀伤活性显著性升高(P0.01)。结论:转染IL-27基因的裸鼠胰腺癌细胞所分泌的IL-27具有生物学活性,通过增强细胞免疫功能在裸鼠体内发挥抗肿瘤作用。     

Sphingosine-1-phosphate differently regulates the cytokine production of IL-12, IL-23 and IL-27 in activated murine bone marrow derived dendritic cells

Sphingosine-1-phosphate (S1P) modulates many cell functions such as lymphocyte trafficking and signaling as well as keratinocyte proliferation. However, less is known about the specific effects of S1P on cytokine production, particularly on the interaction between dendritic cells (DCs) and keratinocytes, cell types which are crucial for the initiation and maintenance of chronic inflammatory skin diseases like atopic dermatitis or psoriasis. Especially the cytokines of the IL-12 family play a dominant role in many inflammatory diseases as they have a significant impact on T-helper cell function. In the present study we show that S1P decreased the production of the pro-inflammatory cytokines IL-12 and IL-23 in LPS-stimulated DCs via the common subunit p40 as well as in the crosstalk with activated keratinocytes. By using specific S1P receptor agonists (SEW2871, FTY720-P) and antagonist (JTE013) we identified an important role for S1P receptor 1 in the modulation of the cytokine profile. While diminishing IL-12 and IL-23 secretion, S1P enhanced IL-27 production in DCs. To elucidate the mechanism of the different impact on the IL-12 family cytokine production, we investigated the mitogen-activated protein kinase (MAPK) and phosphatidylinositide 3-kinase (PI3K) pathways in DCs. By using specific MAPK-Inhibitors (U0126, SB202190, SP600125) we demonstrated that ERK, p38 and JNK differently regulate each pathway of each cytokine. While p38 and JNK did not seem to play a role in the modulation properties of S1P on cytokine production, ERK is at least partially involved in the S1P mediated modulation of IL-12 and IL-27. The PI3K-Inhibitor abrogated the S1P-induced decrease of IL-12 and IL-23 secretion, while it had no influence on the S1P-induced increase of IL-27 production. These data implicate, that S1P has an anti-inflammatory impact on the production of IL-12 family cytokines, indicating therapeutic potential for S1P treatment of several inflammatory diseases like psoriasis.     

Age-related increase in the fraction of CD27-CD4+ T cells and IL-4 production as a feature of CD4+ T cell differentiation in vivo.

The influence of ageing on phenotype and function of CD4+ T cells was studied by comparing young (19-28 years of age) and aged (75-84 years of age) donors that were selected using the SENIEUR protocol to exclude underlying disease. An age-related increase was observed in the relative number of memory cells, not only on the basis of a decreased CD45RA and increased CD45RO expression, but also on the basis of a decrease in the fraction of CD27+CD4+ T cells. Our observation that the absolute number of CD45RO+CD4+ T cells was increased, while absolute numbers of CD27-CD4+ T cells remained unchanged in aged donors, indicates that the latter subset does not merely reflect the size of the CD45RO+CD4+ T cell pool. The increased fraction of memory cells in the aged was functionally reflected in an increased IL-4 production and T cell proliferation, when cells were activated with the combination of anti-CD2 and anti-CD28, whereas IL-2 production was comparable between both groups. No differences were observed with respect to proliferative T cell responses or IL-2 production using plate-bound anti-CD3 or phytohaemagglutinin (PHA). The observation that IL-4 production correlated with the fraction of memory cells in young donors but not in aged donors suggests different functional characteristics of this subset in aged donors.