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1.
筛选日本血吸虫童虫早期诊断抗原的研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的筛选日本血吸虫童虫早期诊断抗原及其表位.方法制备日本血吸虫可溶性童虫抗原(SSA),经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot后分别与日本血吸虫感染后10、21、42天兔血清进行酶联免疫印迹试验(EITB),筛选出能被早期感染血清所识别的抗原组分.用日本血吸虫感染后21天血清从噬菌体12随机肽库中筛选、富集、纯化、扩增与早期感染兔血清有高亲和力的噬菌体克隆,经动物实验初步评估其对日本血吸虫感染的早期诊断效果.结果SDS-PAGE显示SSA的总条带数多于可溶性成虫抗原(SAWA),但大多为共同抗原.EITB结果显示SSA共出现12条早期反应抗原带,其中97 kDa和47 kDa抗原分子只能被感染后10天兔血清特异性识别;SAWA仅出现7条反应带,未显示只能被感染后10天兔血清识别的期特异性抗原分子.挑选出3个与感染后21天兔血清具有高亲和力的单克隆噬菌体,混合后分别用于检测感染日本血吸虫10、21 d鼠血清中IgG特异性抗体,阳性检出率分别为48.8%和64.4%.结论SSA中的97 kDa和44 kDa抗原分子及3个噬菌体随机12肽抗原模拟表位可能具有日本血吸虫感染早期诊断价值.  相似文献   

2.
目的在原核系统中克隆表达日本血吸虫肌球蛋白调节轻链(SjMRLC)并分析其基因的虫期转录特异性。方法根据SjMRLC的核苷酸序列(GenBank登录号为AY815219)设计特异性引物,PCR扩增目的基因,并克隆入原核表达载体pGEX4T-3;转至大肠埃希菌BL21株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;蛋白质印迹分析(Western blotting)鉴定表达产物;提取日本血吸虫各虫期总RNA,反转录成cDNA,PCR扩增分析SjMRLC基因的虫期转录特异性。结果构建pGEX 4T-3/SjMRLC重组质粒,测序表明插入的外源基因片段正确,诱导表达获得带有GST标签的可溶性蛋白(Mr49000);虫期转录特异性分析显示该基因在日本血吸虫各个虫期均有转录,且水平一致。结论成功获得可溶性的带有GST标签的SjMRLC;SjMRLC是管家基因。  相似文献   

3.
用双向电泳分析日本血吸虫雌虫和雄虫抗原   总被引:5,自引:0,他引:5  
目的 研究日本血吸虫雌虫和雄虫的可溶性抗原,方法 用SDS-PAGE和双向电泳方法,对日本血吸虫两性成虫全虫可溶性抗原进行分析。结果 用SDS-PAGE分析日本血吸虫雌虫和雄虫分别有10条和17条蛋白带,其中有9条相同蛋白带;用双向电泳分析雌雄虫体多肽斑点分别有111个(主多肽斑点有19个)和132个(主多肽斑点有28个),分子量范围在27kD-100kD,而pI范围为3.20-8.15 ,两性有35个相同多肽点,但其多肽含量略有差异。结论 日本血吸虫雌、雄成虫存在许多共同蛋白带和多肽斑点(其中有些蛋白和多肽含量差异明显),而且还各有牧民的蛋白带和多肽斑点。  相似文献   

4.
血清学抗体检测因检测成本低,操作易掌握,方法较成熟,被广泛应用于日本血吸虫病的辅助诊断和疫情监测。为提高检测的敏感性和特异性、区分病程、考核疗效,已有大量研究用以探索短程抗体及诊断抗原。本文将日本血吸虫特异性抗体、诊断抗原的应用研究进展综述如下。  相似文献   

5.
血吸虫病仍然是我国重要的公共卫生问题,诊断抗原一直是血吸虫病诊断研究热点。随着免疫学和分子生物学技术的发展,血吸虫病的诊断抗原已由最初的粗抗原发展为组分抗原及由基因重组的方法生产合成的重组抗原。本文谨综述近年来血吸虫免疫诊断抗原和重组抗原的研究进展,进一步分析诊断抗原存在的问题及将来发展的趋势。  相似文献   

6.
日本血吸虫肺期童虫收集方法的实验研究   总被引:1,自引:1,他引:0  
目的建立一种收集纯净肺期童虫的方法。方法用日本血吸虫尾蚴感染昆明小鼠,分别于感染后第1、2、3、4、5、6、7、10、12、14、21天解剖,从皮肤、肺脏、肠系膜静脉及肝门静脉处收集童虫。结果肺期童虫出现的高峰期为感染后第3天,获得最佳收获肺期童虫的时间,建立了回收大量纯净童虫的方法。  相似文献   

7.
目的筛选日本血吸虫童虫外分泌蛋白,对日本血吸虫感染进行早期诊断。方法连续收集日本血吸虫感染后不同时间的动物血清,采用生物信息学方法确定血吸虫童虫外分泌蛋白基因,构建重组基因表达质粒,纯化外分泌蛋白,对重组蛋白的免疫原性进行分析,研究其特异性和敏感性。结果日本血吸虫童虫外分泌蛋白基因被插入到真核表达载体pAPtag2中,初步筛选获得了外分泌蛋白分子基因;重组蛋白的特异性为90.0%,敏感性为53.3%。结论重组血吸虫童虫外分泌蛋白,对日本血吸虫早期感染具有诊断价值。  相似文献   

8.
目的 克隆和表达日本血吸虫弹性蛋白酶基因(SjCE-2b),纯化表达重组蛋白,并研究该基因在各虫期的转录情况。 方法 预测SjCE-2b基因的编码序列。绘制血吸虫尾蚴弹性蛋白酶家族成员系统进化树。用RT-PCR和蛋白质印迹(Western blotting)分析SjCE-2b基因在日本血吸虫各期转录的差异。将RT-PCR扩增得到的SjCE-2b基因亚克隆至载体pET28b,在大肠埃希菌中诱导表达得到重组蛋白rSjCE-2b,用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物,Western blotting分析其免疫原性。 结果 在虫卵、子胞蚴和成虫检测到SjCE-2b基因转录本(714 bp),表达的重组蛋白rSjCE-2b,相对分子质量约为Mr 31 000,与预测的融合蛋白相对分子质量相符。构建了重组原核表达载体SjCE-2b/pET28b,并在大肠埃希菌中表达。纯化后的重组蛋白rSjCE-2b可被日本血吸虫感染的兔血清识别。 结论 在日本血吸虫虫卵、子胞蚴和成虫发现SjCE-2b基因转录本。SjCE-2b基因有可能成为潜在的日本血吸虫病疫苗候选抗原和药物及诊断靶点。  相似文献   

9.
日本血吸虫可溶性尾蚴抗原早期诊断价值的研究   总被引:4,自引:4,他引:4  
目的 确定日本血吸虫可溶性尾蚴抗原作为血吸虫病早期诊断检测用抗原的应用价值。方法 从感染日本血吸虫的钉螺收集尾蚴 ,制备可溶性尾蚴抗原 (SCA) ,建立应用 SCA为抗原检测家兔血清抗体的 ELISA法 ,并以此法检测 2 8只低度感染日本血吸虫家兔的感染前和感染后不同时期的血清 ,并与常规 SEA-ELISA法比较。结果 用 SCA检测时 ,感染后 15 d有 2 /2 8只家兔血清开始出现抗 SCA抗体阳性 ,2 0 d已有 2 0只阳性 ,阳性率为 71.4% ,3 0 d 2 8只全部阳性 ,阳性率为10 0 % ,而抗 SEA抗体在感染后 2 0 d开始出现 ,3 4d有 2 1只阳性 ,阳性率为 75 .0 % ,3 7d阳性率为10 0 %。平均出现抗体的时间 SCA-ELISA和 SEA-ELISA分别为 (2 1.2 5± 4.0 7) d和 (3 1.5 0±5 .12 ) d,前者比后者早 10 d。结论 用日本血吸虫可溶性尾蚴抗原检测血吸虫病具有早期诊断的价值  相似文献   

10.
目的克隆、表达日本血吸虫内皮分化相关因子(endothelial differentiation-related factor)-1编码基因(SjEDF-1),并研究该基因在日本血吸虫不同发育阶段的特异性表达情况。方法制备日本血吸虫卵、尾蚴、童虫和成虫等各发育阶段的总RNA,采用RT-PCR方法 ,以管家基因SjActin为内参,根据SjEDF-1基因全长编码序列(GenBank登录号为AY336498)的开放阅读框设计引物进行RT-PCR扩增,分析日本血吸虫各发育阶段SjEDF-1基因mRNA表达情况。将SjEDF-1基因亚克隆至载体pET28a,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物,以纯化的重组SjEDF-1蛋白免疫新西兰白兔制备免疫兔血清。蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫原性及该蛋白在日本血吸虫各发育阶段的表达差异。结果 RT-PCR结果显示,除尾蚴外,在虫卵、童虫、雄虫和雌虫期均扩增出约405bp的片段。含重组质粒SjEDF-1/pET-28a的转化子细菌,经IPTG诱导,获得以不可溶的包涵体形式存在的重组蛋白,其相对分子质量(Mr)为20000,与预测的融合蛋白大小相符。Western blotting分析结果显示,纯化后的重组蛋白SjEDF-1可被日本血吸虫感染兔血清识别,在血吸虫童虫和成虫阶段检测到目的蛋白的表达。结论重组蛋白SjEDF-1具有较强的免疫原性,在血吸虫童虫和成虫期检测到该蛋白特异表达。  相似文献   

11.
日本血吸虫硫氧还蛋白编码基因的克隆和表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
目的克隆和表达日本血吸虫大陆株硫氧还蛋白(SjcTrx)的编码基因。方法根据日本血吸虫菲律宾株硫氧还蛋白基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入SalI酶切位点和终止密码子TAA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SjcTrx基因。经双酶切并纯化的PCR产物与同样双酶切并纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接,构建重组质粒pET28a-SjcTrx,转化BL21感受态菌并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcTrx/BL21用IPTG诱导表达。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334 bp,构建的重组pET28a-SjcTrx表达质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段。根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,约14kDa。Western blotting显示该重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清和重组抗原免疫小鼠血清所识别。结论SjcTrx基因的表达获得成功,并获得纯化蛋白,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。  相似文献   

12.
目的 表达、纯化重组日本血吸虫铁蛋白 ,观察其免疫小鼠后抗日本血吸虫的免疫保护作用。方法 用基因重组技术 ,将日本血吸虫铁蛋白基因亚克隆至表达载体 pGMC上 ;在IPTG诱导下 ,重组日本血吸虫铁蛋白得到高效表达 ;用电泳层析法分离纯化日本血吸虫铁蛋白 ;用SDS -PAGE和Western -blot鉴定表达纯化产物 ;用纯化的重组铁蛋白免疫小鼠三次 ,分别在 0、2、4周进行。第 6周每鼠经腹部感染 4 0± 1条日本血吸虫尾蚴。 4 2天后剖杀冲虫 ,计数虫数及肝卵数。结果 纯化的重组铁蛋白分子量为 4 0kD ,具有较好的免疫原性 ,能被日本血吸虫感染兔血清识别。与对照组相比 ,纯化重组铁蛋白免疫小鼠组的减虫率为 2 4 5 % ,减卵率为 4 5 8%。结论 重组日本血吸虫铁蛋白不仅在大肠杆菌中得到高效表达 ,而且纯化的铁蛋白分子能诱导抗日本血吸虫病的保护性免疫。  相似文献   

13.
目的扩增日本血吸虫的酪氨酸羟化酶(Schistosoma japonicum Tyrosine Hydroxylase,SjTH)编码基因,构建pcDNA3.1(+) SjTH真核表达载体,并检测其在COS 7细胞中的表达情况。方法以日本血吸虫成虫cDNA为模板,RACE PCR扩增SjTH编码基因,并与pGEM T连接进行亚克隆,双酶切后回收目的基因,并与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,PCR和双酶切初步鉴定后测序,纯化无内毒素重组质粒pcDNA3.1(+) SjTH,转染入COS 7细胞,G418筛选阳性克隆,RT PCR和Western blot鉴定重组SjTH蛋白的表达。结果RACE PCR 扩增出SjTH编码基因,大小约1 392bp,经双酶切鉴定、测序及Blast分析鉴定重组真核质粒构建成功。脂质体介导无内毒重组真核质粒pcDNA3.1(+) SjTH转染入COS 7细胞,G418筛选出阳性克隆,RT PCR证实阳性单克隆细胞带有SjTH编码基因,Western blot鉴定单克隆细胞表达重组SjTH蛋白,大小约54kD。结论真核表达载体pcDNA3.1(+) SjTH构建成功,G418筛选出阳性克隆,真核表达重组SjTH蛋白,为后续研究SjTH蛋白功能奠定基础。  相似文献   

14.
目的克隆并表达日本血吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白(SLP),并对其免疫原性进行分析。方法根据华支睾吸虫鞘脂激活蛋白样蛋白序列,采用tblastn法比对,在基因库中找出与之同源的日本血吸虫EST片段,并经过DNAStar、Sig-nalP3.0分析获得Sj-SLP基因序列,经PCR扩增从日本血吸虫cDNA中获得的目的基因克隆入原核表达载体pET15b,转化至大肠埃希菌BL21,异丙基巯基半乳糖诱导表达并纯化;采用Westernblot分析其抗原性;用纯化的SLP重组蛋白免疫兔,ELISA检测免疫原性。结果 PCR扩增获得Sj-SLP基因,约296bp,并成功地进行了原核表达,纯化的表达产物重组Sj-SLP(rSj-SLP)能被感染兔血清识别,而不能被正常兔血清识别。rSj-SLP免疫兔可产生1∶12800的特异性抗体。结论日本血吸虫存在鞘脂激活蛋白样蛋白,rSj-SLP具有较强的免疫原性和抗原性。  相似文献   

15.
目的 克隆和表达日本血吸虫钙磷蛋白基因,纯化表达产物。 方法 从日本血吸虫cDNA文库中挑出钙磷蛋白基因进行体外扩增,将目的基因亚克隆至原核表达载体pET-28a中进行表达,组氨酸标签亲和柱层析法纯化表达产物,并用蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫原性。然后用生物信息学方法对其结构域和功能作用位点进行分析和预测,并绘制该蛋白的进化树。 结果 构建了重组原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得了表达。纯化的重组蛋白可以被日本血吸虫感染的兔血清识别。经生物信息学分析发现该基因的编码蛋白含有4个EF手型(exchange factor hand,EF-hand)功能结构域,另外具有3种潜在的功能作用位点,即2个蛋白激酶C磷酸化位点、8个酪蛋白激酶II磷酸化位点和1个N-肉豆蔻酰化位点,属于II型(type-II)钙磷蛋白。 结论 日本血吸虫钙磷蛋白基因编码蛋白为钙结合蛋白,有可能成为潜在的日本血吸虫病疫苗候选抗原和药物及诊断靶点。  相似文献   

16.
目的 克隆并表达日本血吸虫肌醇单磷酸酶(SjIM)编码基因cDNA,评估该重组抗原抗血吸虫感染的免疫保护效果.方法 以日本血吸虫42d虫体cDNA为模板,经PCR扩增编码SjIM蛋白的开放阅读框(ORF)基因片段.采用荧光实时定量PCR分析该基因在童虫和成虫的表达情况.以pET28a(+)为载体构建重组表达质粒,经异丙基- β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导,制备重组SjIM蛋白.Western blotting检测重组蛋白的抗原性与免疫原性,利用重组SjIM抗原免疫小鼠评估其免疫保护效果.结果 获得了编码SjIM基因ORF的cDNA片段,ORF长度为834 bp,编码278个氨基酸.荧光实时定量PCR显示该基因在35 d虫体中表达量最高.获得了SjIM重组蛋白,其具有良好的免疫原性.免疫组小鼠获得48.76%的减虫率和41.29%的肝脏减卵率.结论 获得了日本血吸虫SjIM基因ORF的cDNA序列,并制备了重组SjIM蛋白,该重组抗原在小鼠体内能诱导产生部分抗血吸虫感染的免疫保护效果.  相似文献   

17.
目的扩增、表达日本血吸虫Sjnanos编码基因并评估其重组蛋白诱导的免疫保护效果。方法从42d龄的日本血吸虫成虫中扩增了一个日本血吸虫性别差异表达的基因,GenBank登录号为AY814948,并对其进行生物信息学分析。将该基因亚克隆入原核表达载体pET28a,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠,ELISA检测其血清特异性抗体效价,蛋白印迹分析检测其抗原性,以看家基因NADH为内参,应用荧光定量PCR技术分析该基因在血吸虫各个阶段的表达状况。结果同源性分析表明,该基因为日本血吸虫的一个新基因,其编码序列的开放阅读框(ORF)为525bp,编码174个氨基酸,理论相对分子量为19.9,PI为8.2。荧光定量PCR技术分析显示该基因在7d、13d、18d、23d、32d、42d虫体均有表达,但在18d和13d虫体的表达量明显高于其他天数的虫体,在雄虫的表达量高于雌虫。成功构建了该基因的重组表达质粒pET28a(+)-Sjnanos,并在大肠埃希菌中获得表达,Western-blot分析表明重组蛋白具有较好的免疫原性,动物免疫保护试验获得了31.4%的减虫率和53.8%的肝脏减卵率。结论获得日本血吸虫新的抗原基因Sjnanos,该基因的重组蛋白在小鼠中诱导了部分免疫保护作用。  相似文献   

18.
目的 观察日本血吸虫感染过程中巨噬细胞数量及其凋亡动态变化,并探讨血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)诱导巨噬细胞凋亡的可能机制。方法 将C57BL/6小鼠(6~8周龄)随机分为4组,其中3组作为实验组,另1组作为正常对照组。实验组每只小鼠均经腹部皮肤感染(12 ± 1)条日本血吸虫尾蚴,于感染后3、5周和8周各处死1组小鼠;正常对照组小鼠不感染血吸虫,于实验组小鼠感染当天处死。取各组小鼠肝组织和腹腔渗出细胞,检测肝脏和腹腔巨噬细胞数量及其凋亡动态变化。此外,体外用SEA、PBS及卵清蛋白(ovalbumin,OVA)处理纯化的小鼠腹腔巨噬细胞,流式细胞术检测巨噬细胞凋亡;以实时定量PCR和Western blotting技术检测巨噬细胞中BCL⁃2家族成员mRNA和蛋白表达水平;以流式细胞术和Western blotting技术检测caspase 3活化水平。同时,体外在caspase抑制剂、H2O2或N⁃乙酰⁃L⁃半胱氨酸(NAC)存在时用SEA处理巨噬细胞,以流式细胞术检测巨噬细胞凋亡水平。结果 感染日本血吸虫尾蚴后3、5周和8周,小鼠肝脏[(0.873 ± 0.106)× 106、(2.737 ± 0.460)× 106个和(3.107 ± 0.367) × 106个;F = 81.900,P < 0.01]和腹腔中巨噬细胞总数[(5.282 ± 1.136) × 105、(7.500 ± 1.200) × 105个和(12.800 ± 0.800) × 105个;F = 55.720,P < 0.01]不断增加,且感染小鼠肝脏[(0.092 ± 0.018) × 106、(0.186 ± 0.025) × 106 个和(0.173 ± 0.027)× 106 个;F = 57.780,P < 0.000 1]和腹腔中凋亡的巨噬细胞数量[(0.335 ± 0.022)× 105、(0.771 ± 0.099) × 105个和(1.094 ± 0.051) × 105个;F = 49.460,P < 0.01]亦不断增加。经SEA体外处理的巨噬细胞凋亡比例[(24.330 ± 0.784)%]高于PBS [(18.500 ± 1.077)%]及OVA[(18.900 ± 1.350)%]处理组(P均 < 0.01)。经SEA和PBS处理的巨噬细胞中,Bcl⁃2 [(1.662 ± 0.943) vs. (1.00 ± 0.00);t = 1.215,P > 0.05]、Bax [(0.711 ± 0.200) vs. (1.00 ± 0.00);t = 2.507,P > 0.05]、Bak [(1.255 ± 0.049) vs. (1.00 ± 0.00);t = 0.897,P > 0.05]、BCL⁃2 [(0.068 ± 0.004) vs. (0.070 ± 0.005);t = 0.699,P > 0.05]、BAX [(0.089 ± 0.005) vs. (0.097 ± 0.003);t = 2.232, P > 0.05]、BAK [(0.439 ± 0.048) vs. (0.571 ± 0.091) ; t = 2.231,P > 0.05]表达水平差异均无统计学意义。在caspase抑制剂存在时,SEA仍能诱导巨噬细胞凋亡(F = 0.411,P > 0.05);而在H2O2或NAC存在时,SEA不能诱导巨噬细胞凋亡(F = 11.880、9.897,P均< 0.05)。结论 在日本血吸虫感染过程中,SEA可能通过促进活性氧表达而诱导巨噬细胞凋亡。  相似文献   

19.
日本血吸虫三个新跨膜蛋白基因的克隆和分析   总被引:5,自引:0,他引:5       下载免费PDF全文
目的 克隆并分析日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新的抗原基因 ,为血吸虫病防治提供有效的疫苗候选分子。方法 以旋毛虫感染鼠血清为探针 ,筛选Sj成虫cDNA文库 ,对获得的阳性克隆进行PCR鉴定及测序。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析 ,并预测新基因编码蛋白质的结构与功能。结果 共筛选出 9个阳性克隆 ,其插入SjcDNA片段大小在 0 .6~ 2 .1kb之间。测序分析获 5个新基因 ,其中Sj Ts1,Sj Ts3及Sj Ts5 (登录号为AY0 0 5 816 ,AF2 990 80 ,AY0 2 4 35 2 )分别编码 83,83,2 33个氨基酸组成的跨膜蛋白。Sj Ts1蛋白含 1个潜在的跨膜区 ,2个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和 1个N 肉豆蔻酸化位点。Sj Ts3蛋白含两个跨膜区 ,1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。Sj Ts5蛋白为具有 5个跨膜区的跨膜蛋白 ,含 1个N 糖基化位点、2个cAMP与cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和 1个N 肉豆蔻酸化位点。结论 Sj Ts1、Sj Ts3与Sj Ts5基因编码的蛋白质均为受磷酸化激活控制的跨膜蛋白 ,可能为潜在的血吸虫病疫苗候选分子  相似文献   

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