棘阿米巴土壤分离株CB/S1的18S rDNA基因型鉴定

目的鉴定从北京市区土壤中分离的棘阿米巴分离株Acanthamoeba sp．CB／S1的18S rDNA基因型。方法从土壤分离的CB／S1株中提取基因组18SrDNA，应用棘阿米巴属特异性引物PCR扩增18S rDNA序列。将扩增产物测序后用分子生物学软件Clustal X进行序列分析，与基因库中已有T1至T12型序列进行比较并构建进化树。结果与结论从北京市区土壤中分离的的棘阿米巴分离株CB／S1的18S rDNA全基因序列分别为2291bp，其基因型属于T5型。     

自延吉市自来水分离的棘阿米巴18S rDNA基因型鉴定

目的对吉林延吉市自来水中分离的棘阿米巴分离株Acanthamoeba sp.CJY/W1 18S rDNA基因型鉴定。方法从本地区自来水分离的Acanthamoeba sp.CJY/W1虫株中提取基因组18S rDNA,应用棘阿米巴属特意性引物PCR扩增。将扩增产物测序后用Clustal X和Genedoc软件进行序列分析,与基因库中已有T1至T12型序列进行比较并构建进化树。结果分离的棘阿米巴分离株CJY/W1的18S rDNA全基因为2 252bp,18S rDNA基因分型最接近于T1型,但与T1型之间的基因差异为8%。结论分离的CJY/W1株是不属于T1-T12的新的18S rDNA基因型,接近于T13(Acanthamoeba sp.UWC9,AF132134)。     

从土壤中分离的棘阿米巴属CJY/S1和CJY/S2株的18S rDNA基因型鉴定

从吉林延边地区土壤中分离的棘阿米巴属CJY/S1和CJY/S2株中提取基因组18S rDNA，PCR扩增、克隆、测序后用分子生物学软件Clustal X进行序列分析，与基因库中已有T1至T12型序列进行比较并构建进化树。结果棘阿米巴土壤分离株Acanthamoeba sp. CJY/S1和CJY/S株的18S rDNA全基因序列分别为2 255 bp和2 252 bp，均属T4基因型。     

嗜肺军团菌感染多噬棘阿米巴及其增殖的实验观察

目的　初步建立国内嗜肺军团菌感染原生动物自由生活阿米巴的实验感染模型。方法将多噬棘阿米巴和嗜肺军团菌进行实验室共同培养 ,于 8h、2 4h、4 8h、72h后将预置盖玻片上生长的虫体Giemsa染色后作油镜观察 ,各阶段的培养物作透射电镜观察 ,研究嗜肺军团菌感染多噬棘阿米巴后形态学的变化。结果　共同培养 2 4h后Giemsa染色显示阿米巴内出现明显的细菌菌体 ,后期菌体布满整个胞浆 ;透射电镜下阿米巴滋养体和囊胞中都充满健康完整的军团菌菌体 ,并观察到不同阶段的二分裂现象。结论　嗜肺军团菌能在自由生活阿米巴内生长并增殖 ,初步证实了阿米巴可能是军团菌在自然界的贮存宿主。     

棘阿米巴原虫全长cDNA文库的构建

目的快速构建棘阿米巴滋养体全长cDNA文库,为棘阿米巴滋养体抗原的筛选和基因结构研究奠定基础。方法以棘阿米巴滋养体分离株总RNA为模板,以经修饰的SMART寡聚核苷酸引物逆转录合成单链cDNA,采用长距PCR(long-Distance PCR,LD PCR)方法扩增得到双链cDNA,经蛋白酶K消化和SfiⅠ酶切后通过色谱柱CHROMA SPON-400按分子质量进行分离,进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收纯化0.4~2.5kb分离产物。取1μl PCR产物与λ噬菌体连接,以XL1-BLUE为受体菌扩增得到cDNA文库,分别用梯度法和随机测序法检测文库滴度与重组率。结果成功构建棘阿米巴cDNA文库,文库滴度为3.85×107pfu/ml,插入片段大小在0.4~2.5kb之间,重组率为100%(20/20)。结论棘阿米巴滋养cDNA文库构建成功,为棘阿米巴滋养体抗原的筛选和基因结构研究奠定了基础。     

H_2O_2体外抗棘阿米巴作用研究

目的检测H_2O_2的抗棘阿米巴(Acanthamoebaspp.)作用。方法自角膜炎患者角膜刮片分离获得棘阿米巴复合体(AcanthamoebaLugdunensis-Acanthamoebaquina)。于培养基(PYG)培养传代。实验前将棘阿米巴用新鲜的PYG培养1d使其活化,配成2.5×10~6/ml细胞悬液加入细胞培养板,实验组各孔分别加入不同浓度H_2O_2,对照组加等量PYG,28℃24h后实验组更换新鲜PYG继续培养3d。取细胞悬液滴片,瑞氏染色,观察细胞形态变化。用定量培养法作棘阿米巴生长曲线,观察其增殖速率。用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法,观察H_2O_2对棘阿米巴成活率的影响。用乳酸脱氢酶(LDH)测定法测定H_2O_2对棘阿米巴的损伤。结果棘阿米巴滋养体在0.125％H_2O_2作用下,不可逆转地成为包囊,20～120h增殖率为0;1％H_2O_2可使其破裂。结论H_2O_2具有较强的抗棘阿米巴作用,有可能成为预防棘阿米巴角膜炎的理想药物。     

塞罕坝自然保护区硬蜱调查及分子鉴定

目的掌握河北省承德市塞罕坝自然保护区内硬蜱种类及其分子特征,明确该地区蜱类的分类地位,为相关蜱媒传染病的防控制提供参考。方法 2018年4-9月间,采用布旗法捕捉该地区森林、草地、灌丛3种生境内自由生活的蜱类;提取蜱基因组,PCR扩增2种硬蜱的线粒体16S rDNA和COⅠ基因片段,并进行同源性分析。基于邻接法和最大简约法,用Mega 7.0软件分别构建系统发生树,进行遗传进化分析。结果在植被上共采集蜱231头,分为1科2属2种,其中全沟硬蜱212头,嗜群血蜱19头。PCR扩增嗜群血蜱标本(QS11)16S rDNA和COⅠ扩增基因片段长度分别是434 bp和712 bp,全沟硬蜱标本(QG13)16S rDNA、COⅠ基因片段长度是445 bp、735 bp。嗜群血蜱标本和全沟硬蜱标本的16S rDNA序列、COⅠ序列与GenBank中已登录的2种硬蜱对应基因聚类,且在一个进化分支上;嗜群血蜱标本16S rDNA、COⅠ序列与已登录嗜群血蜱相同基因序列的同源性分别为98.2%和98.1%,遗传距离分别为0.035和0.028;全沟硬蜱2个基因与已登录基因的同源性分别为98.3%和97.4%,遗传距离分别为0.067和0.104。结论塞罕坝自然保护区内优势蜱种是全沟硬蜱且存在嗜群血蜱。两蜱种16S rDNA、COⅠ与序列存在多样性和地域差异性。     

常见三种类型胆结石胆汁中细菌群落的检测

目的 探讨常见三种类型胆结石胆汁中所含微生物群落的差异性.方法 采用末端限制性片断长度多态性(T-RFLP)技术对50例三种类型胆结石患者的胆汁细菌群落进行基因序列分析.结果(1)细菌16S rDNA基因片段的阳性检出率为76％(38/50),三组之间阳性检出率差异无统计学意义;(2)三组细菌16S rDNA基因片段分析,纯胆固醇组的细菌群落主要以肺炎克雷伯氏菌和金黄色葡萄球菌为主;胆色素结石组主要包括普通变形杆菌、厌氧消化球菌等;混合性结石胆汁组主要为厌氧消化球菌、丙酸杆菌,其中还包括了胆色素结石胆汁组中未检测到的黄微杆菌和希氏短杆菌.结论 胆结石患者胆汁标本中细菌检出率较高,但各组细菌群落构成各有不同,且成分较为复杂.     

快速诊断早期棘阿米巴角膜炎qPCR方法的建立及应用

目的建立检测棘阿米巴18srDNA的TaqMan探针实时荧光定量PCR(Real-time PCR or qPCR)方法,为无创早期诊断棘阿米巴病提供基因诊断标准方法。方法提取分离自土壤和水中的5株棘阿米巴DNA,测序后与GenBank中搜索到的棘阿米巴67条序列进行比对,在物种保守区域设计Real-time引物和TaqMan探针,通过T克隆载体制作标准品并测序,建立方法的标准曲线,测定最低检测浓度,同时用该方法检测其他病原微生物及临床疑似棘阿米巴角膜炎病人眼分泌物,实验数据通过JMP5.0.1和测评软件进行棘阿米巴角膜炎F检验和诊断测试评估。结果qPCR和培养法检测180例疑似棘阿米巴角膜炎病人眼分泌物,阳性率分别为(5±1)%和(2.9±1.2)%,差异有统计学意义(F=13,P<0.01)。以qPCR法测定的标准品CT值为纵坐标(Y),以标本浓度的对数为横坐标(X)建立标准曲线:Y=-3.24X+40.74,R>0.99。用建立的qPCR方法测定棘阿米巴18srDNA最低浓度为10拷贝/UL。用qPCR检测其他病原微生物,结果均为阴性。通过诊断测试评估软件比较两种方法检测临床疑似病人眼分泌物结果,95%置信区间内qPCR方法的灵敏度为100%,传统实验室培养法为62.5%。结论棘阿米巴18srDNA Real-time PCR基因检测方法具有无创伤性、高效、特异、经济等特点,适用于疑似棘阿米巴角膜炎病人的筛查。     

Cardiobacterium valvarum临床分离株的生物学特性研究及16S rRNA鉴定

目的 采用不同的方-法描述Cardiobacterium valvarum(C. valvarum)临床分离株的生物学特性,利用16S rRNA基因测序技术进行分子鉴定。 方-法 转种阳性血培养标本到血琼脂平板上进行细菌培育,革兰染色涂片镜检,用VITEK 2 Compact全自动微生物鉴定分析仪对临床分离株进行细菌鉴定,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)对分离株的蛋白质进行高通量测定,E-test法对分离株作药敏试验。提取分离株的DNA,采用16S rRNA基因测序技术对PCR的产物进行测序,在NCBI的BLAST网站上与GenBank数据库上的序列做相似性比较,用MEGA7.0.26软件构建该分离株的系统进化树。结果 经细菌培养发现小而圆、光滑、不透明,灰色的菌落;经革兰染色后镜下见到小、两端圆形、革兰阴性的多形性杆菌;VITEK 2 Compact上机、MALDI-TOF-MS技术均未得到该分离株的鉴定结-果;16S rRNA基因测序技术测得该菌株基因全序列约为1 450 bp,与C. valvarum F0432的16S rRNA同源性为99.59%,鉴定为C. valvarum。结论该菌的形态、生化反应均无代表性,采用16S rRNA基因测序技术可以对C. valvarum进行鉴定,对该疾病的诊断具有重要意义。     

Occurrence of fragmented 16S rRNA in an obligate bacterial endosymbiont of Paramecium caudatum.

The phylogenetic position of Caedibacter caryophila, a so far noncultured killer symbiont of Paramecium caudatum, was elucidated by comparative sequence analysis of in vitro amplified 16S rRNA genes (rDNA). C. caryophila is a member of the alpha subclass of the Proteobacteria phylum. Within this subclass C. caryophila is moderately related to Holospora obtusa, which is another obligate endosymbiont of Paramecium caudatum, and to Rickettsia. A 16S rRNA targeted specific hybridization probe was designed and used for in situ detection of C. caryophila within its host cell. Comparison of the 16S rDNA primary structure of C. caryophila with homologous sequences from other bacteria revealed an unusual insertion of 194 base pairs within the 5'-terminal part of the corresponding gene. The intervening sequence is not present in mature 16S rRNA of C. caryophila. It was demonstrated that C. caryophila contained fragmented 16S rRNA.     

16S rDNA序列在诺卡菌菌种鉴定中的价值研究

目的评价16S rDNA序列在诺卡菌菌种鉴定中的应用价值。方法对 13种49株诺卡菌(43株标准株和6株临床株)16S rDNA序列片段进行PCR扩增,将扩增片段进行纯化后测序,从GenBank上下载32株诺卡菌(包括星形诺卡菌,少食诺卡菌,短链诺卡菌等)及3株棒状杆菌(Corynebacterium,C.),3株弗兰克氏菌属(Frankia,F.),3株分支杆菌(Mycobacterium,M.),3株链霉菌(Streptomyces,S.)的16S rDNA序列。对所测得的诺卡菌序列及GenBank所报道的诺卡菌序列用DNASTAR程序分析处理,计算种内及种间相似性,用Mega6.06构建诺卡菌菌种系统进化树。结果在81条受试诺卡菌16S rDNA序列中,16S rDNA能将诺卡菌大致可分为11群,除了不能将亚种分离外,诺卡菌其他种属均能得到很好的分离。诺卡菌16S rDNA种内及亚种内相似性为99.1% ~ 100%;种间相似性在95.7% ~ 98.8%之间。结论16S rDNA序列分析是一种快速,简单,特异性较好的诺卡菌菌种鉴定方法,能将诺卡菌鉴定至种的水平。     

16S～23S rDNA内转录间隔区序列分析及其在分支杆菌鉴定中的应用价值

目的：研究16S－23SrDNA内转录间隔区（internal transcribed spacr,ITS)序列在分支杆菌鉴定中的应用价值。方法：应用PCR－直接测序法对22例30株分支杆菌参考菌株和16株分支杆菌临床分离菌株16S－23SrDNA ITS测序。对所测定序列以及GenBank所报道的有关序列用Clustal程序（MegAlign Package[Windows Version4.01]；DNASTAR，Madson,Wis)处理分析，计算种间相似性，用PHYLIP Package构建分支杆菌菌种聚类分析树状谱。结果：除结核分支杆菌复合群（MTC）菌种（结核分支杆菌、牛分支杆菌、非洲分支杆菌和田鼠分支杆菌）16S－23SrDNA ITS序列完全一致外，其它分支杆菌菌种间核苷酸排列顺序及长度变异较大，种间相似性为30．4％－86．5％，聚类分析树状谱能将各分支杆菌菌种相分离，结果表明16S－23SrDNA ITS序列分析能将MTC与非结核分支杆菌（NTM）相鉴别，能将NTM鉴定至种的水平。结论：16S－23SrDNA ITS可做为分支杆菌鉴定的靶基因。     

应用16S rDNA克隆文库筛查腹泻病暴发病原体及特异毒力基因验证

目的以16S rDNA克隆文库筛查某地腹泻病暴发的病原体,并验证筛查结果的可靠性。方法收集12份暴发期内腹泻患者的粪便标本,抽提粪便中总细菌基因组,随机抽取3例患者,应用中国传染病预防控制国家重点实验室建立的16S rDNA克隆文库方法筛查可能的致腹泻病原菌,根据筛查结果,设计致腹泻病原菌特异性毒力基因的引物进行PCR验证,同时对其它9份粪便标本进行该致病菌的PCR检测,根据致病菌的检出比例,确定可能导致本次腹泻病暴发的病原体。结果用16S rDNA克隆文库在3例患者标本中筛查到2例可能存在志贺菌或大肠杆菌,用针对志贺菌的特异性毒力基因ipaH对该2例患者标本进行PCR检测为阳性。在其它9例腹泻患者粪便标本中6例检测到志贺菌,志贺菌在腹泻病例中的总检出率为66.7%(8/12)。16S rDNA克隆文库筛查结果与志贺菌ipaH基因的验证结果均显示,3号病例的志贺细菌基因组在粪便总细菌基因组中所占的比例比2号病例高,两种检测结果具有一致性。结论志贺菌可能是导致某地本次腹泻病暴发的主要病原体。16S rDNA基因克隆文库法能快速筛查到可能的病原菌,其筛查结果比较可靠,因此,该方法对于不明原因疾病暴发流行的病原体筛查具有指导作用。     

分支杆菌临床分离株的16S rRNA基因序列分析

目的　建立分支杆菌的 16SrDNA序列分析的方法 ,采用该方法鉴定临床结核分支杆菌分离株。方法　用PCR从重庆某医院的肺部感染病人的痰标本中分得的 2 9株分支杆菌菌株中扩增 16SrRNA基因 (16SrDNA)的 5′端片段 (～5 0 0bp) ,并测定所得到片段的DNA序列。用DNA分析软件将所获得的序列与GenBank的分支杆菌序列相比较 ,计算种间相似性 ,并用序列构建分支杆菌菌株的系统发育树 ,对分离株进行分类与鉴定。结果　有 14株的 16SrDNA序列分别与已知结核分支杆菌复合群 (Mycobacteriatuberculosiscomplex ,MTC)、戈登分支杆菌、新金色分支杆菌、氯酚红分支杆菌、龟分支杆菌或脓肿分支杆菌的序列完全相同。依据完全一致的序列可以准确鉴定这些临床分离株为相应的种 ;部分分离株的 16SrDNA在GenBank序列检索中无完全一致的匹配序列。用临床分离株的 16SrDNA序列与已知的分支杆菌 16SrDNA序列构建的系统发育树 ,结果提示某些菌株可能是与已知分支杆菌密切相关的新种或是它们的亚种。结论　 16SrDNA序列分析鉴定分支杆菌是一种快速、可靠、成本较低的方法 ;重庆地区非结核分支杆菌感染的种类与其它地区的报告有明显不同     

16s rDNA序列分析在腹泻粪便标本菌群分析应用

目的应用16s rDNA序列分析方法,对临床实验室没有分离到已知病原菌的腹泻病人粪便标本进行菌群分析,为腹泻病人的病原学诊断提供线索。方法根据细菌16s rDNA保守区序列设计通用引物,以腹泻病人粪便标本中的总DNA为模板,PCR扩增16s rDNA片段。将获得的片段克隆入T载体进行测序,与数据库中发表序列的进行比对,判断标本中细菌的种类和比例;PCR扩增常见的五类致病性大肠杆菌的特征基因应用于排除诊断。结果在3份粪便标本中,大肠杆菌为优势菌群(所占比例分别为84%、65%和81%);其他种群细菌为拟杆菌属(Bacteroides)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和普雷沃氏菌属(Prevotella)等;实验室常规培养方法没有分离到常见的五类致病性大肠杆菌;PCR扩增没有发现常见的五类致病性大肠杆菌的特征基因。结论引起三例病人腹泻的病原菌可能是一种新的大肠杆菌;16s rDNA序列分析方法可应用于腹泻粪便标本菌群分析,为常规的病原培养方法提供补充,对疾病的诊断提供线索。     

Detection of ehrlichial DNA in small rodents captured in a woodland area of Hokkaido, the northernmost island of Japan, where Lyme disease is endemic

The ehrlichial gene was detected in small rodents trapped in a Lyme disease-endemic area in Hokkaido, the northernmost island of Japan. Primer pairs of 16S rDNA targeting the genus Ehrlichia and other regions of the 16S rDNA specific for E. chaffeensis and E. muris were used for identification. The DNA fragment specific for 16S rDNA of Ehrlichia spp. was detected in 4 of 94 Apodemus speciosus mice (positive rate: 4.3%) and 5 of 73 Clethrionomys rufocanus bedfordiae mice (positive rate: 6.8%). The nucleotide sequence of the amplified 16S rDNA fragment was most similar to those of E. muris-like Ehrlichia, Ehrlichia spp. HF565 and Shizuoka-36, originating in the northern and central parts of Japan. In phylogenetic analysis based on 16S rDNA sequences, the northern, central and western groups of E. muris-like Ehrlichia from a cluster with microorganisms of the E. muris group. These results suggest that there are a group of E. muris microorganisms and a group of E. muris- like microorganisms in Japan.