日本血吸虫内皮分化相关因子-1基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆、表达日本血吸虫内皮分化相关因子(endothelial differentiation-related factor)-1编码基因(SjEDF-1),并研究该基因在日本血吸虫不同发育阶段的特异性表达情况。方法制备日本血吸虫卵、尾蚴、童虫和成虫等各发育阶段的总RNA,采用RT-PCR方法 ,以管家基因SjActin为内参,根据SjEDF-1基因全长编码序列(GenBank登录号为AY336498)的开放阅读框设计引物进行RT-PCR扩增,分析日本血吸虫各发育阶段SjEDF-1基因mRNA表达情况。将SjEDF-1基因亚克隆至载体pET28a,转化至大肠埃希菌BL21(DE3),异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物,以纯化的重组SjEDF-1蛋白免疫新西兰白兔制备免疫兔血清。蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫原性及该蛋白在日本血吸虫各发育阶段的表达差异。结果 RT-PCR结果显示,除尾蚴外,在虫卵、童虫、雄虫和雌虫期均扩增出约405bp的片段。含重组质粒SjEDF-1/pET-28a的转化子细菌,经IPTG诱导,获得以不可溶的包涵体形式存在的重组蛋白,其相对分子质量(Mr)为20000,与预测的融合蛋白大小相符。Western blotting分析结果显示,纯化后的重组蛋白SjEDF-1可被日本血吸虫感染兔血清识别,在血吸虫童虫和成虫阶段检测到目的蛋白的表达。结论重组蛋白SjEDF-1具有较强的免疫原性,在血吸虫童虫和成虫期检测到该蛋白特异表达。     

日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白 基因的克隆 表达及鉴定

目的克隆、表达日本血吸虫Toll样受体相互作用蛋白（SjTollip）基因,并研究该基因在日本血吸虫各虫期的转录表达情况。方法从日本血吸虫cDNA文库中挑出Toll样受体相互作用蛋白基因进行体外扩增,并克隆入原核表达载体pET-28a,转化大肠埃希菌BL21（DE3）,异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物。制备日本血吸虫各虫期阶段总RNA和重组SjTollip蛋白免疫新西兰白兔的免疫兔血清,利用RT-PCR和蛋白质免疫印迹分析SjTollip基因在日本血吸虫各期转录表达的差异及重组SjTollip蛋白的免疫原性。结果构建了重组原核表达载体SjTollip/pET-28a,诱导获得以包涵体形式表达的不可溶重组蛋白,相对分子质量约为24000,与预测的融合蛋白相对分子质量相符。纯化后的重组蛋白rSjTollip可被日本血吸虫感染兔血清识别。虫期转录特异性分析显示,该基因在尾蚴和雄虫中转录水平较低。免疫印迹分析结果显示,在虫卵、尾蚴、童虫、雄虫、雌虫各发育阶段都检测到该蛋白,但童虫和雌虫中表达水平明显升高。结论 SjTollip基因在日本血吸虫各发育阶段转录表达水平有较大差异,其有可能成为潜在的日本血吸虫病疫苗候选抗原和药物及诊断靶点。     

日本血吸虫果糖二磷酸醛缩酶的重组表达及其在血吸虫生活史各阶段的表达分析

目的 目的 在大肠杆菌中原核表达、 纯化日本血吸虫果糖二磷酸醛缩酶 （rSjFBPA）, 观察其在血吸虫生活史各阶段 的表达。方法 方法 以日本血吸虫成虫cDNA为模板扩增rSjFBPA基因, 克隆至pET28a （+） 质粒后, 再转化入E. coli BL21。 含重组质粒的菌株经IPTG诱导后, 采用SDS?PAGE和Western blotting分析鉴定重组蛋白rSjFBPA是否表达, 用层析法纯 化rSjFBPA并用SDS?PAGE鉴定其纯度。同时, 用RT?PCR方法分析SjFBPA在血吸虫尾蚴、 童虫、 成虫和虫卵各阶段的表 达情况。结果 结果 经PCR扩增出目的基因, 含目的基因的TA克隆质粒经双酶切和测序鉴定, 证明插入片段与预期目的基 因序列相符。Western blotting结果显示, 表达后的重组蛋白可与His?tag单克隆抗体发生特异性反应。经镍亲和层析法 制备了纯化的重组SjFBPA蛋白, 纯化重组蛋白浓度达4 mg/ml。RT?PCR结果显示, SjFBPA在日本血吸虫尾蚴、 童虫、 成 虫和虫卵阶段均有表达。 结论 结论 SjFBPA基因被成功克隆和表达, 其在日本血吸虫尾蚴、 童虫、 成虫和虫卵各阶段均有表 达。     

日本血吸虫弹性蛋白酶基因的克隆、表达及虫期特异性转录

目的 克隆和表达日本血吸虫弹性蛋白酶基因（SjCE-2b），纯化表达重组蛋白，并研究该基因在各虫期的转录情况。 方法 预测SjCE-2b基因的编码序列。绘制血吸虫尾蚴弹性蛋白酶家族成员系统进化树。用RT-PCR和蛋白质印迹（Western blotting）分析SjCE-2b基因在日本血吸虫各期转录的差异。将RT-PCR扩增得到的SjCE-2b基因亚克隆至载体pET28b，在大肠埃希菌中诱导表达得到重组蛋白rSjCE-2b，用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物，Western blotting分析其免疫原性。 结果 在虫卵、子胞蚴和成虫检测到SjCE-2b基因转录本（714 bp），表达的重组蛋白rSjCE-2b，相对分子质量约为Mr 31 000，与预测的融合蛋白相对分子质量相符。构建了重组原核表达载体SjCE-2b/pET28b，并在大肠埃希菌中表达。纯化后的重组蛋白rSjCE-2b可被日本血吸虫感染的兔血清识别。 结论 在日本血吸虫虫卵、子胞蚴和成虫发现SjCE-2b基因转录本。SjCE-2b基因有可能成为潜在的日本血吸虫病疫苗候选抗原和药物及诊断靶点。     

日本血吸虫不同发育阶段抗原与抗LSA兔血清的交叉反应分析

目的　为进一步阐明水蛭与日本血吸虫抗原交叉性机理提供依据。　方法　制备日本血吸虫子胞蚴抗原、尾蚴抗原、肝期童虫抗原、雌 (雄 )成虫抗原、虫卵抗原 ,采用Westernblot方法对制备的日本血吸虫不同发育阶段抗原与水蛭可溶性抗原 (LSA)免疫兔血清分别进行免疫印迹反应 ,分析其交叉性。　结果　LSA免疫兔血清能识别日本血吸虫不同发育阶段抗原 ,且所识别的抗原成分有明显差异 ,雌性成虫抗原和雄性成虫抗原分别有 3条和 2条蛋白组分可被LSA免疫血清识别 ,而不含抗虫卵和抗尾蚴抗体。　结论　在LSA成分中与血吸虫的共同成分主要存在于成虫中 ,LSA免疫血清中含有较多的抗雌性成虫抗体 ,而雄虫次之。     

日本血吸虫TOM34基因的克隆和表达分析

目的 克隆、表达日本血吸虫线粒体外膜转运酶34基因(SjTOM34),并对其生物特性进行初步研究。方法 应用RT-PCR方法从42 d日本血吸虫成虫cDNA中扩增SjTOM34基因,并进行生物信息学分析。应用实时定量RT-PCR方法分析了SjTOM34基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达状况。构建了SjTOM34基因重组原核表达质粒,并在大肠杆菌中进行表达,Western blotting分析了重组抗原的免疫原性及该蛋白在不同发育阶段虫体中的表达情况,利用免疫组化方法观察了该蛋白在虫体内的分布情况。结果 获得了SjTOM34的基因序列,其开放阅读框(ORF)为1 083 bp。该基因在所检测的不同发育阶段童虫和成虫中均有表达,其中在35 d虫体中的表达量略高于其他时期的虫体。成功构建了重组的原核表达质粒并且在大肠杆菌中获得表达,重组蛋白在上清和沉淀中都有存在,并且具有较好的免疫原性,在所检测的各时期虫体中均可检测到该蛋白的存在,并且主要分布在虫体的实质组织中。结论 获得了日本血吸虫SjTOM34基因,初步明确了该基因在日本血吸虫童虫和成虫中的表达情况,及在成虫中的分布。     

日本血吸虫不同发育阶段抗原与抗LSA兔血清的交叉反应分析

目的为进一步阐明水蛭与日本血吸虫抗原交叉性机理提供依据。方法制备日本血吸虫子胞蚴抗原、尾蚴抗原、肝期童虫抗原、雌(雄)成虫抗原、虫卵抗原，采用Western blot方法对制备的日本血吸虫不同发育阶段抗原与水蛭可溶性抗原(LSA)免疫兔血清分别进行免疫印迹反应，分析其交叉性。结果LSA免疫兔血清能识别日本血吸虫不同发育阶段抗原，且所识别的抗原成分有明显差异，雌性成虫抗原和雄性成虫抗原分别有3条和2条蛋白组分可被LSA免疫血清识别，而不含抗虫卵和抗尾蚴抗体。结论在LSA成分中与血吸虫的共同成分主要存在于成虫中，LSA免疫血清中含有较多的抗雌性成虫抗体，而雄虫次之。     

旋毛虫成虫抗原基因的原核表达及表达产物的特性分析

目的　获得旋毛虫成虫抗原基因的原核表达产物并对其进行纯化及免疫特性分析。　方法　旋毛虫成虫Ts87基因片段亚克隆入PET-28a(+)表达载体,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达。亲和层析和电洗脱法纯化表达产物,SDS-PAGE、ELISA和Westernblotting对表达产物进行分析鉴定,并将纯化的表达产物人工免疫兔。结果　SDS-PAGE结果显示,表达产物为分子量约为40kDa的重组蛋白。纯化后免疫兔获得高滴度的抗血清。该基因重组蛋白可被感染旋毛虫的猪、兔血清及人工免疫兔血清所识别,与感染囊尾蚴、棘球蚴的患者血清或感染日本血吸虫的兔血清不发生交叉免疫反应。　结论　获得一个新的旋毛虫成虫Ts87基因重组蛋白,该蛋白具有特异的抗原性。     

日本血吸虫VCP基因的克隆表达及其在不同生活史期的mRNA表达水平

目的 目的 从原核表达日本血吸虫含缬酪肽蛋白 （VCP） 基因, 并分析其在不同生活史期的mRNA表达水平。方法 方法 提取日本血吸虫虫卵RNA, 逆转录为cDNA, PCR扩增日本血吸虫VCP基因, 亚克隆至原核表达载体pET15b; 重组质粒转 化入E. coli BL21, 异丙基硫代半乳糖苷 （IPTG） 诱导目的基因表达, 并采用包涵体纯化方法获取重组蛋白, 产物行十二烷基 硫酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS?PAGE） 进行分析鉴定。提取日本血吸虫尾蚴、 童虫、 雌虫、 雄虫、 虫卵RNA, DNase消化, 纯化后逆转录为cDNA, 采用荧光实时定量PCR分析VCP基因在上述生活史期的表达水平。结果 结果 PCR扩增获得日本血 吸虫VCP基因, 经重组质粒表达和包涵体纯化成功获得重组蛋白。荧光实时定量PCR检测发现, 日本血吸虫VCP基因在 尾蚴中的mRNA表达水平最高, 在童虫、 虫卵、 雄虫、 雌虫中表达水平较低。结论 结论 获得日本血吸虫VCP基因编码的重组 蛋白; 日本血吸虫VCP基因mRNA在尾蚴阶段表达水平最高, 在童虫、 虫卵、 雄虫、 雌虫中表达水平较低。。     

日本血吸虫促凋亡基因SjBAD的初步研究

目的了解日本血吸虫促凋亡基因Sj BAD的生物学、免疫学和转录表达特征,评估Sj BAD重组蛋白作为日本血吸虫病疫苗候选分子的潜力。方法根据Sj BAD的参考序列设计引物,应用PCR技术扩增Sj BAD基因,构建重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj BAD。采用实时定量PCR检测Sj BAD基因在日本血吸虫不同发育期及42 d雌、雄虫体内的转录水平;应用Western blotting和间接ELISA法分析Sj BAD重组蛋白的抗原性和免疫原性。用重组抗原Sj BAD免疫BALB/c小鼠,通过计算减虫率及肝脏减卵率,评估重组抗原作为血吸虫病候选疫苗分子的潜力。结果成功克隆了日本血吸虫Sj BAD基因,构建了重组表达质粒p ET-28a(+)-Sj BAD,并在大肠杆菌中成功表达,重组蛋白分子量约为22 k Da。Western blotting表明Sj BAD具有较好的抗原性和免疫原性,间接ELISA法检测表明重组蛋白免疫小鼠产生了高水平的特异性抗体Ig G。实时定量PCR检测发现Sj BAD基因在日本血吸虫的各个发育阶段均有转录,以14 d表达量最高,且在雄虫体内的表达量高于雌虫。两次动物免疫试验表明,重组蛋白Sj BAD在BALB/c小鼠体内诱导了30.82%和27.87%的减虫率,及42.52%和45.84%的肝脏虫卵减少率,均显著高于PBS对照组(P均0.05)。结论成功克隆、表达了日本血吸虫促凋亡相关基因Sj BAD,该基因在日本血吸虫不同发育期虫体内均有表达。纯化的重组Sj BAD蛋白在小鼠体内能诱导产生部分抗血吸虫感染的免疫保护效果。     

日本血吸虫肌球蛋白调节轻链的原核克隆表达及虫期转录特异性

目的在原核系统中克隆表达日本血吸虫肌球蛋白调节轻链(SjMRLC)并分析其基因的虫期转录特异性。方法根据SjMRLC的核苷酸序列(GenBank登录号为AY815219)设计特异性引物,PCR扩增目的基因,并克隆入原核表达载体pGEX4T-3;转至大肠埃希菌BL21株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达;蛋白质印迹分析(Western blotting)鉴定表达产物;提取日本血吸虫各虫期总RNA,反转录成cDNA,PCR扩增分析SjMRLC基因的虫期转录特异性。结果构建pGEX 4T-3/SjMRLC重组质粒,测序表明插入的外源基因片段正确,诱导表达获得带有GST标签的可溶性蛋白(Mr49000);虫期转录特异性分析显示该基因在日本血吸虫各个虫期均有转录,且水平一致。结论成功获得可溶性的带有GST标签的SjMRLC;SjMRLC是管家基因。     

日本血吸虫溶血磷脂酶编码基因真核表达载体的构建和表达及鉴定

目的 从日本血吸虫成虫cDNA中扩增出溶血磷脂酶编码基因(Si1539),并亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),旨在提取重组抗原进行免疫原性分析,并用于免疫学诊断.方法 提取日本血吸虫成虫总RNA,反转录生成cDNA,PCR法扩增出Sj1539基因,通过克隆载体pGEM-T连接,亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),然后转染至人宫颈癌细胞株(HeLa细胞)中表达,表达产物用Western印迹法进行鉴定.结果 Sj1539基因PCR扩增产物片段长度为684 bp.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539经BamH I、Xho I双酶切和PCR扩增鉴定,证实Sj1539基因已成功插入.重组质粒pcDNA3.1(+)-Sj1539在HeLa细胞中的表达产物经Western印迹法鉴定能够与日本血吸虫感染的兔血清反应,其相对分子质量(Mr)约为25×103.结论 成功构建了日本血吸虫Si1539基因真核表达载体,并获得了表达产物.

Abstract：

Objective Schistasoma japonicum(S.japonicum)lysophospholipase gene(Sjl539)from cDNA of S japonicum adult worms was amplified and subcloned into eukaryotic expression vector pcDNA3.1(+)for expression of recombinant antigen and immunogenicity analysis.Methods Total RNA of S.japonicum was extracted to generato cDNA by RT-PCR.The Sj1539 gent was amplified.The DNA fragment was subcloned into eukaryofic expression vector pcDNA3.1(+)following insertion and amplification in pGEM-T.The recombinant plasmid was transfected into human cervical carcinoma cell strain(Hela cells)and expression products were identified by Western blotting.Results The size of PCR product was approximately 684 bp.It was confirmed that Sj1539 gene had been inserted successfully by the recombinant plasmid digested with two enzymes and PCR.It was verified that the expression product could react with S.japonicum-infected rabbit serum by Western blotting and the molecular weight was approximately 25×103.Conclusions The eukaryotie expression vector carrying Sj1539 gene has been established and the expression product has been obtained.     

日本血吸虫组织蛋白酶L2(SjCL2)基因巴氏毕赤酵母表达载体的构建

目的　扩增SjCL2基因 ,构建巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB -SjCL2 ,为进一步研究其蛋白酶的功能奠定基础。方法　运用RT -PCR技术 ,从日本血吸虫 (中国大陆株 )成虫总RNA中扩增获得SjCL2基因 ;将其定向克隆至巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαB质粒 ;经KpnⅠ、XbaⅠ双酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序分析SjCL2基因并确定其读码框的正确插入。结果　利用RT -PCR技术从日本血吸虫成虫总RNA中扩增到约 1Kb大小的SjCL2基因 ,通过双酶切分析、PCR鉴定以及DNA序列分析确定SjCL2基因被克隆到巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB中。 结论　成功构建了含有SjCL2基因编码区序列的巴氏毕赤酵母表达载体 pPICZαB -SjCL2质粒     

日本血吸虫硫氧还蛋白编码基因的克隆和表达

目的克隆和表达日本血吸虫大陆株硫氧还蛋白(SjcTrx)的编码基因。方法根据日本血吸虫菲律宾株硫氧还蛋白基因序列设计一对引物,上游引物引入BamHI酶切位点和起始密码子ATG,下游引物引入SalI酶切位点和终止密码子TAA。以日本血吸虫大陆株成虫总RNA为模板,经反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增SjcTrx基因。经双酶切并纯化的PCR产物与同样双酶切并纯化的pET28a质粒DNA片段用T4 DNA连接酶连接,构建重组质粒pET28a-SjcTrx,转化BL21感受态菌并大量扩增。重组质粒DNA经限制性内切酶双酶切、PCR、琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列测定进行鉴定。pET28a-SjcTrx/BL21用IPTG诱导表达。结果SjcTrx编码基因RT-PCR产物约334 bp,构建的重组pET28a-SjcTrx表达质粒DNA经限制性内切酶双酶切和PCR扩增产物于琼脂糖凝胶电泳均观察到相同大小基因片段。根据核苷酸序列测序结果推导的氨基酸序列与日本血吸虫菲律宾株和曼氏血吸虫Trx分别有97%和43%的同源性。表达的重组蛋白经SDS-PAGE分析,约14kDa。Western blotting显示该重组蛋白可被日本血吸虫感染兔血清和重组抗原免疫小鼠血清所识别。结论SjcTrx基因的表达获得成功,并获得纯化蛋白,为开展动物保护性免疫试验创造了条件。     

日本血吸虫Wnt受体蛋白Fz5编码基因的克隆及其在不同发育时期虫体的表达差异

目的克隆含开放阅读框（ORF）的日本血吸虫SJCHGC08304全基因序列,分析此基因编码蛋白的Wnt受体种类,了解该基因在血吸虫不同发育阶段的mRNA表达差异。方法采用RACE技术从日本血吸虫7d肝期童虫和42d成虫组织中扩增获得日本血吸虫SJCHGG08304全基因序列,通过生物信息学工具分析该基因的完整ORF;同源性分析该基因编码蛋白的种类和功能;运用荧光定量PCR技术分析该基因在日本血吸虫不同发育阶段虫体中的表达情况。结果获得日本血吸虫新基因,该基因ORF含2604bp,编码867个氨基酸,理论分子量为98．264kD。实时定量分析该基因在18d童虫表达量最高,其他依次为14d童虫、42d雄虫、32d成虫、虫卵、23d成虫、27d成虫,而在42d雌虫中没有检测到该基因。结论该基因的氨基酸序列具有典型Wnt受体家族蛋白特征,生物信息学方法同源性分析表明与非洲爪蟾Fz5蛋白的同源性最高,通过比较分析推测为编码日本血吸虫Wnt受体Fz5蛋白基因,命名该基因为sjFz5基因（GenBank登录号：EU370926）,其在血吸虫的不同发育时期中有不同程度的差异表达。     

日本血吸虫新基因Sjnanos的克隆、表达及免疫保护效果评估

目的扩增、表达日本血吸虫Sjnanos编码基因并评估其重组蛋白诱导的免疫保护效果。方法从42d龄的日本血吸虫成虫中扩增了一个日本血吸虫性别差异表达的基因,GenBank登录号为AY814948,并对其进行生物信息学分析。将该基因亚克隆入原核表达载体pET28a,转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,用纯化的重组蛋白免疫小鼠,ELISA检测其血清特异性抗体效价,蛋白印迹分析检测其抗原性,以看家基因NADH为内参,应用荧光定量PCR技术分析该基因在血吸虫各个阶段的表达状况。结果同源性分析表明,该基因为日本血吸虫的一个新基因,其编码序列的开放阅读框(ORF)为525bp,编码174个氨基酸,理论相对分子量为19.9,PI为8.2。荧光定量PCR技术分析显示该基因在7d、13d、18d、23d、32d、42d虫体均有表达,但在18d和13d虫体的表达量明显高于其他天数的虫体,在雄虫的表达量高于雌虫。成功构建了该基因的重组表达质粒pET28a(+)-Sjnanos,并在大肠埃希菌中获得表达,Western-blot分析表明重组蛋白具有较好的免疫原性,动物免疫保护试验获得了31.4%的减虫率和53.8%的肝脏减卵率。结论获得日本血吸虫新的抗原基因Sjnanos,该基因的重组蛋白在小鼠中诱导了部分免疫保护作用。