丙型肝炎病毒C蛋白片段的表达及免疫反应性

我们用聚合酶链反应技术,将长度为201ｂｐ、402ｂｐ及591ｂｐ的丙型肝炎病毒(ＨＣＶ)核心抗原编码区ｃＤＮＡ片段在ｐＵＣ19ＵＫＨＣＶＣＯＲＥ中扩增,在内套引物两端分别引入ＢａｍＨⅠ和ＥｃｏＲⅠ酶切位点,ＰＣＲ产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后,用ＱＩＡｐｒｅＳｐｉｎ?..     

乌鲁木齐市部分高危人群庚型肝炎病毒感染现状及5′ UTR区基因序列分析

新疆地处我国西部边陲 ,存在着各型肝炎散发流行的危险因素 ,庚型肝炎病毒在乌鲁木齐市的流行现状尚未见报道。在新疆医科大学第一附院收集了2 67份各类人群的血清 ,用酶标法检测血清中庚型肝炎病毒抗体 (抗 ＨＧＶ) ,再以庚型肝炎病毒ＮＳ3区为引物运用ＲＴ ＰＣＲ法对抗 ＨＧＶ(阳性 )血清进行庚型肝炎病毒核酸 (ＨＧＶＲＮＡ)的扩增检测 ,阳性扩增产物为 83ｂｐ。最后 ,选择该病毒 5′非编码区为引物对第一次ＲＴ ＰＣＲ扩增ＨＧＶＲＮＡ(阳性 )血清 ,再次进行163.ｃｏｍ)ＲＴ ＰＣＲ扩增 ,阳性扩增产物为 1 90ｂｐ ,对第二次扩增ＨＧＶ…     

PT—PCR检测庚型肝炎病毒和GB病毒感染

ＨＧＶ和ＧＢＶ是近二年发现的新肝炎病毒，引起非Ａ￣Ｅ肝炎。目前实验室检测ＨＧＶ和ＧＢＶ感染主要靠ＲＴ－ＰＣＲ。本文就ＲＴ－ＰＣＲ检测ＨＧＶ和ＧＢＶ ＲＮＡ的临床标准处理、引物、扩增条件、产物检测和目前临床应用研究予以介绍。     

PCR-RFLP-SSCP及测序用于霍乱弧菌ctx-AB基因多态性的研究

建立ＰＣＲ ＲＦＬＰ ＳＳＣＰ及测序方法 ,用于分析霍乱弧菌肠毒素ＡＢ(ｃｔｘ ＡＢ)基因多态性。针对ｃｔｘ ＡＢ基因设计引物 ,扩增片段为 5 2 8ｂｐ ,包括ｃｔｘ Ｂ编码基因375ｂｐ ,引物序列为 5′ ＧＧＴＧＴＡＡＡＡＴＴＣＣＴＴＧＡＣＧ 3′和 5′ ＧＧＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＧＣ 3′。ＰＣＲ产物经ＲｓａⅠ酶切为317ｂｐ和 2 11ｂｐ 2个片段。对酶切产物进行单链构象多态性 (ＳＳＣＰ)分析 ,银染作者单位 :5 10 5 15广州 ,第一军医大学流行病学教研室 (芮勇宇 ,俞守义 ,王红 ) ;广东省卫生防疫站 (蔡初的 ,李建基 ,钟豪杰 )…     

庚型肝炎病毒NS3蛋白在大肠杆菌中的表达

目的　获取具备免疫反应原性的庚型肝炎病毒ＮＳ３ 抗原。方法　从重组质粒Ｉｗｑ２利用ＰＣＲ 反应扩增出ＧＢＶＣ／ＨＧＶ ＮＳ３ 基因片段,克隆至表达载体ｐＰＲＯＥＸ ＨＴａ 后进行核苷酸序列测定,待鉴定正确后经ＩＰＴＧ 诱导重组工程菌,用ＳＤＳＰＡＧＥ 和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 对重组蛋白进行鉴定。结果　酶切鉴定和核苷酸序列测定结果表明成功地构建了重组工程菌ｐＨＴＮＳ３／ ＤＨ５α且克隆的基因片段为ＧＢＶＣ／ＨＧＶ ＮＳ３ 基因片段。ＳＤＳＰＡＧＥ 分析诱导表达产物发现在相对分子质量约４３ ８１０处有一条明显的蛋白表达带,占菌体总量的１７ ．７ ％ 。用ＮｉＮＴＡ 亲和层析柱快捷地获得了纯化的重组蛋白。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 鉴定发现重组蛋白可与ＧＢＶＣ／ＨＧＶ ＲＮＡ 阳性病人血清发生抗原抗体反应。结论　获得了具备免疫反应原性的ＧＢＶＣ／ＨＧＶ ＮＳ３ 抗原,该重组蛋白可用于ＧＢＶＣ／ＨＧＶ 感染的检测。     

肝细胞肝癌组织中丙型肝炎病毒核心区基因及其表达 …

目的 采用多种方法检测丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心区基因和表达产物在肝细胞肝癌（ＨＣＣ）组织中的分布及其在ＨＣＣ发生和发展中的作用。方法 对３９例ＨＣＣ患者进行免疫组化和原位杂匀的检测。ＩＳ－ＲＴ－ＰＣＲ法用于检测并定位ＨＣＶ－ＲＮＡ。微切组织的ＲＴ－ＰＣＲ法分别检测癌与癌旁组织中的ＨＣＶ－ＲＮＡ,以便能够控制扩增产物的来源。同时还进行 血清学ＥＬＩＳＡ和ＲＴ－ＰＣＲ的检测。结果 血清ＥＬＩＳＡ的阳     

深圳地区小儿肠道病毒感染的核酸检测分析

为了解深圳地区肠道病毒 (ＥＶ)的感染流行情况和病毒分型特征 ,我们采用检测ＥＶ的套式逆转录聚合酶链反应(ＲＴ ｎＰＣＲ)方法进行ＥＶ感染检测 ,并对临床分离株 5′端非编码区 ( 5′ＵＴＲ)基因序列进行分子进化树分析。采用ＴＲＩＺＯＬ ＬＳＲｅａｇｅｎｔ试剂从疑诊ＥＶ感染儿童大便、咽拭子和脑脊液中提取ＥＶ ＲＮＡ ,根椐ＥＶ 5′ＵＴＲ保守的基因序列设计两对特异性引物 ,引物序列分别为ＥＶＰ1 60 :5′ＣＡＡＧＣＡＣＴ(ＴＡ)ＴＴ(ＣＡ)ＣＣＣＣＧＧ3′,ＥＶＰ2 50 :5′ＴＡＣＴＴＧＡ(ＧＡ)ＣＣ ＴＡＧＴＡ3′,ＥＶＰ50 0 :5′…     

抗人红细胞血型B抗原单链抗体基因的构建表达

我室曾建立分泌抗Ｂ血型抗原ＩｇＭ类单克隆抗体的5Ｄ12杂交瘤细胞株[1] ,本文应用基因工程技术 ,分离和克隆了 5Ｄ12株单抗的ＶＨ 和ＶＬ 基因 ,采用重叠延伸拼接ＰＣＲ(ＳＯＥＰＣＲ )技术[2 ] 体外成功构建 5Ｄ12单链抗体基因 ,获得较高水平的表达。1　材料和方法1 1　细胞和载体　Ｅ ｃｏｌｉＴＧ1为英国Ｗｉｎｔｅｒ教授惠赠 ;质粒ｐＧＥＸ 4Ｔ 2购自Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司 ;含十五肽接头质粒ｐＳＴＥ 2 15由德国Ｄｕｂｅｌ教授惠赠。1 2　引物和试剂　用于扩增重链可变区的一对引物为ＶＨＢａｃｋ (5 ＡＧＧＴ (Ｃ/Ｇ )ＣＡＧＣＴＧ…     

利用多组套式引物检测庚型肝炎病毒RNA

利用庚型肝炎病毒（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ）ＮＳ３～５区序列合成了四组套式引物，建立了灵敏、特异的庚型肝炎病毒ＲＮＡ双扩增聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测方法。用此方法检测了１０份庚型肝炎病毒抗体阳性患者血清及１０份阴性的健康人血清。前者不同组引物的检出率为ＮＳ３（１）引物９份阳性，ＮＳ３（２）引物８份阳性，ＮＳ４引物４份阳性，ＮＳ５（１）引物５份阳性，ＮＳ５（２）引物９份阳性；后者各组引物检测均为阴性。结果表明，庚型肝炎病毒不同区域引物用于ＲＴ－ＰＣＲ检出率差异较大。ＮＳ３（１）及ＮＳ５（２）这两组引物检出率最高，更适合用于ＲＴ－ＰＣＲ检测庚型肝炎病毒ＲＮＡ。     

HBsAg中蛋白与IL-18联合核酸免疫HBsAg转基因小鼠的实验研究

对乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)转基因小鼠鼠系所进行的ＨＢＶ核酸疫苗免疫转基因小鼠的实验研究〔1,2〕 提示核酸疫苗有治疗潜力。本研究的目的是研究在白细胞介素 18(ＩＬ 18)的辅助作用下 ,ＨＢＶ表面抗原中蛋白核酸疫苗免疫ＨＢｓＡｇ转基因小鼠的效果。材料与方法质粒构建 :引物设计 :上游引物 :5′ ＧＴＡＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＴＧＣＡＧＴＧＧＡＡＴＴＣＣ 3′ ;下游引物 :5′ ＧＴＡＧＡＴＣＴＧＡＧＡＧＴＡＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＴＴＧ 3′。ＰＣＲ法扩增ＨＢｓＡｇ中蛋白基因序列 ,将ＰＣＲ产物亚克隆至ｐＧＥＭＴｅａｓｙ载体 (Ｐｒ…     

RT-PCR检测不同人群庚型肝炎病毒感染

为了解成都地区ＨＧＶ感染情况 ,我们采用逆转录 聚合酶链反应 (ＲＴ ＰＣＲ)对职业献血员、健康自然人群和急慢性肝炎病人进行了检测。1　材料和方法1.1　对象　成都职业献血员 16 5名 ,各项体检均合格。成都健康自然人群 40 6名 ,Ａ～Ｅ肝炎血清标志均阴性 ,ＡＬＴ正常。肝炎病人包括急性甲型肝炎 32人 ,急性乙型肝炎 87人 ,慢性乙型肝炎 95人 ,慢性丙型肝炎 2 3人 ,非Ａ～Ｅ肝炎18人 ,这些病人均用酶联免疫吸附试验(ＥＬＳＡ) (上海科华试剂 )测定血清病毒抗原 /抗体证实。1.2　ＨＧＶ引物　据 5′ ＮＣＲ和ＮＳ5α区设计引物和捕获探针[…     

肝病患者中庚型肝炎病毒感染的检测

目的探讨临床肝病病人中庚型肝炎病毒（ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ）感染情况及临床特点。方法应用庚型肝炎病毒基因组５’ＵＴＲ两对寡核苷酸作为引物，建立逆转录套式聚合酶链反应，检测１６９例不同肝病患者血清标本中ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶＲＮＡ，并对其中１例ＰＣＲ扩增产物进行克隆及测序。结果１６９例各型肝病病人ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶＲＮＡ总的检出率为９５％（１６／１６９）。在２９例有手术输血史患者中，３１０％（９／２９）ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶＲＮＡ呈阳性，明显高于无手术输血史组（５％，Ｐ＜００１）。序列分析显示１株庚肝病毒５’ＵＴＲ部分基因片段与已知庚肝病毒株核苷酸同源性在８９１４％～９８９１％之间。结论ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ感染普遍存在于临床肝病患者中，病人感染ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ的临床表现未发现有特殊性，ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶ可能不是非甲～戊型肝炎的主要致病因子。     

抗家鼠型HFRS病毒McAb13E2VH基因的克隆及序列分析

从分泌高亲和力抗家鼠型ＨＦＲＳ病毒型特异性ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系１３Ｅ２中提取细胞总ＲＮＡ，经逆转录合成ＣＤＮＡ，并以之为模板，用特异性引物进行ＰＣＲ，扩增出约３６０ｂｐ产物，将之克隆入ＰＵＣ１８质粒中。序列分析表明，所克隆的基因符合编码小鼠抗体ＶＨ的特征。１３Ｅ２ＶＨ基因由２６６个ｂｐ组成，编码１２２个氨基酸，隶属于小鼠重链ⅡＡ亚组。     

多重引物聚合酶链反应扩增丙型肝炎病毒基因及基 …

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术对丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）的５’－非编码区（５’－ＮＣＲ）、Ｃ及ＮＳ４基因区的３对引物分别及同时扩增，检测８０例抗－ＨＣＶ阳性患者的血清ＨＣＶ ＲＮＡ，并进行了ＨＣＶ基因分型研究。各不同引物所介导的ＰＣＲ检出ＨＣＶ ＲＮＡ的结果为：５’－ＮＣＲ基因区６０％（４８／８０），Ｃ基因区３７％（３０／８０），ＮＳ４基因区３０％（２４／８０）。以上３对引物同时扩增仅４２％（３４／     

急性白血病患儿脑脊液PCR扩增HCMV－DNA的研究

应用多聚酶链式反应（ＰＣＲ）扩增和洋地黄探针杂交的方法，对５３例急性白血病（ＡＬ）患儿脑脊液（ＣＳＦ）样本进行了检测。经过ＰＣＲ扩增，可见明显的人巨细胞病毒ＤＮＡ（ＨＣＭＶ－ＤＮＡ）４００ｂｐ扩增带；经洋地黄探针特异性杂交鉴定，ＡＬ患儿ＣＳＦ标本ＰＣＲ扩增产物的ＨＣＭＶ－ＤＮＡ阳性检出率为８３．０２％。本实验为ＡＬ病人ＣＳＦ的ＨＣＭＶ检测提供了一个简便方法。     

PCR和ELISA检测单纯疱疹病毒的比较

依据ＨＳＶ ＤＮＡ多聚酶基因核苷酸序列设计并合成一对引物，建立了ＰＣＲ方法。用ＰＣＲ和ＥＬＩＳＡ平行检测ＨＳＶ－１，ＨＳＶ－２标准毒株感染的细胞，拟诊ＨＳＶ脑炎患者脑脊液（ＣＳＦ）及多种对照标本。结果表明，两方法特异性完全一致；ＰＣＲ检测阳性率高，比ＥＬＩＳＡ敏感近２０倍，更适用于ＨＳＶ脑炎的早期诊断。     

乙型肝炎病毒前C/C基因准种与变异特点的研究

近年来的研究提出ＨＢＶ感染者体内存在有准种的假说 ,我们以前Ｃ/Ｃ基因为研究靶区域 ,应用多聚酶链反应(ＰＣＲ)技术扩增慢性乙型肝炎患者血清中的靶序列 ,随机选择克隆测序 ,比较其结果 ,证明了ＨＢＶ准种的存在 ,并发现多种基因突变形式。试验用 4例患者诊断为病毒性肝炎 ,乙型、慢性 ,临床检测ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ、抗 ＨＢｃ阳性。提取 2 0 0 μｌ血清中的ＨＢＶＤＮＡ ,用于多聚酶链反应 (ＰＣＲ)。以甘人宝等发表的ＨＢＶａｄｒ亚型序列为依据 ,设计引物序列。其上游引物为 :5′ＡＣＴＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡＴＧＣＡＡＣＴＴＴＴ…     

庚型肝炎病毒E2抗体的检测及其临床意义

目前多采用逆转录聚合酶链反应(ＲＴ ＰＣＲ)扩增方法检测肝炎病人血清中的庚型肝炎病毒 (ＨＧＶ) ,此技术需要病毒在血液中存在时才会出现阳性结果 ,同时临床也需要通过特异性免疫测定方法来跟踪感染及恢复过程。由于ＧＢＶ Ｃ在培养中不能成功地获得 ,没有天然抗原可供血清学检测之用 ,近年来国外一种ＧＢＶ ＣＥ2蛋白被克隆并在ＣＨＯ细胞中成功地表达 ,这种分泌型Ｅ2蛋白被纯化后在固相ＥＬＩＳＡ中应用 ,可用于确定人群血清ＧＢＶ ＣＥ2抗体水平、探讨这种抗体的产生在庚型肝炎临床流行病学中的意义。我们对 18例庚型肝炎病毒感染患者…     

简并引物在扩增GBV-C/HGV NS3高度变异区的应用

目的试图比较简并引物扩增ＧＢＶ－Ｃ／ＨＧＶＮＳ３变异较大的区域的作用。方法设计了简并引物和减温（ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ）ＰＣＲ扩增程序以对目的基因进行扩增，并对阳性ＰＣＲ产物进行克隆及测序。结果该方法能够检测基因变异约达２１％的区域。结论提示该法是一项有效的了解基因家系的技术。     

HGV／GBV—C与HCV混合感染者HGV／GBV—C复制中间体的研究

目的 关于ＨＧＶ／ＢＧＶ－Ｃ组织亲和性的研究尚无结论性资料。我们研究了ＨＧＶ／ＧＢＶ－Ｃ与ＨＣＶ混合感染者ＰＢＭＣ和肝脏中ＨＧＶ／ＧＢＶ－Ｃ复制中间体（负链ＲＮＡ）的存在状况。方法 应用逆转录－巢式ＰＣＲ技术,检测了３２例肝炎患者ＨＧＶ／ＧＢＶ－Ｃ和ＨＶＣ正、负链ＲＮＡ。结果 有２６例ＨＧＶ／ＧＢＶ－Ｃ与ＨＣＶ混合感染者ＰＢＭＣ和肝脏中均未检测到ＨＧＶ／ＧＢＶ－Ｃ负链ＲＮＡ;而在９份ＰＢＭＣ和１５