转染血管内皮细胞生长因子骨髓间充质干细胞与牛松质骨支架复合组织工程骨的血管形成

背景:小块组织工程骨植入动物体内后,早期依靠组织液的渗透可获得营养,但大块组织工程骨的营养仅靠组织液的渗透是远远不够的,必须通过血管再生来获得。目的:观察转染血管内皮细胞生长因子表达载体骨髓间充质干细胞复合组织工程骨植入动物体内后的血管形成能力。方法:制作日本大耳白兔双侧尺骨中段骨缺损模型,左侧尺骨缺损植入转染血管内皮细胞生长因子表达载体的自体骨髓间充质干细胞复合脱钙脱脂去蛋白的牛松质骨支架组织工程骨为实验组,右侧尺骨缺损植入自体骨髓间充质干细胞复合脱钙脱脂去蛋白的牛松质骨支架组织工程骨为对照组。术后12周行X射线摄片观察、大体标本观察、苏木精-伊红染色和Masson染色组织切片观察、MiFas图像分析系统定量分析。结果与结论:实验组与对照组尺骨缺损处均有连续骨痂形成;组织切片经苏木精-伊红染色、Masson三色法染色及MiFas图像分析系统定量分析可见实验组和对照组均有大量的新生骨,但实验组新生血管明显多于对照组(P<0.01),且血管较粗大,而且与新生骨接近。说明将转染血管内皮细胞生长因子表达载体的骨髓间充质干细胞复合在组织工程骨上植入动物体内可明显促进新生血管的形成。     

转染血管内皮细胞生长因子骨髓间充质干细胞与牛松质骨支架复合组织工程骨的血管形成

背景：小块组织工程骨植入动物体内后,早期依靠组织液的渗透可获得营养,但大块组织工程骨的营养仅靠组织液的渗透是远远不够的,必须通过血管再生来获得。目的：观察转染血管内皮细胞生长因子表达载体骨髓间充质干细胞复合组织工程骨植入动物体内后的血管形成能力。方法：制作日本大耳白兔双侧尺骨中段骨缺损模型,左侧尺骨缺损植入转染血管内皮细胞生长因子表达载体的自体骨髓间充质干细胞复合脱钙脱脂去蛋白的牛松质骨支架组织工程骨为实验组,右侧尺骨缺损植入自体骨髓间充质干细胞复合脱钙脱脂去蛋白的牛松质骨支架组织工程骨为对照组。术后12周行X射线摄片观察、大体标本观察、苏木精-伊红染色和Masson染色组织切片观察、MiFas图像分析系统定量分析。结果与结论：实验组与对照组尺骨缺损处均有连续骨痂形成;组织切片经苏木精-伊红染色、Masson三色法染色及MiFas图像分析系统定量分析可见实验组和对照组均有大量的新生骨,但实验组新生血管明显多于对照组（P〈0.01）,且血管较粗大,而且与新生骨接近。说明将转染血管内皮细胞生长因子表达载体的骨髓间充质干细胞复合在组织工程骨上植入动物体内可明显促进新生血管的形成。     

猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体兔体内成骨

目的:生物衍生骨具有天然骨组织的三维立体孔隙.网架结构,有利于种子细胞的黏附、增殖.观察猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体在兔体内成骨及支架的降解.方法:实验于2005-03/2006-12在中南大学湘雅医院中心实验室完成.选择健康家兔16只,3月龄左右,其中1只提供骨髓,另15只作组织工程骨植入,分4,8,12周3个时间点,每个时间点5只.采用Ficoll密度梯度离心法得到兔骨髓基质干细胞并诱导培养:采用物理化学方法对猪松质骨进行处理得到猪松质骨支架,与经诱导培养的骨髓基质干细胞体外复合培养后植入机体内,同时植入单纯猪松质骨支架做自身对照.结果:纳入动物15只,均进入结果分析.采用X射线、苏木精-伊红染色、Masson三色染色及图像分析观察猪松质骨支架屑髓基质干细胞复合体在兔体内成骨及支架的降解.①X射线观察:猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体移植术后4周移植区周围可见少量散在分布的中密度影,8,12周时中高密度影逐渐向中心区增大.单纯猪松质骨支架移植术后各时间点移植区内均呈低密度影.②组织学观察:猪松质骨支架屑髓基质干细胞复合体植入后4周开始有新骨生成,支架开始降解;8周时新骨的形成及支架的降解都明显增加;12周时新骨继续增加,逐渐向成熟骨组织转变,可见少量哈佛系统,但骨小梁尚不典型,毛细血管增生明显,少量支架残留,未见炎症细胞.单纯猪松质骨支架植入后各时间点无新骨形成.③图像分析表明:猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体植入后新骨组织随时间延长而增加,而材料组织随时间延长而减少,但新生骨组织增加与支架材料组织减少无明显直线相关(P＞0.05).结论:猪松质骨支架与骨髓基质干细胞复合移植后新骨逐渐形成,支架逐渐降解,是一种较理想的骨组织工程支架材料.     

恒河猴体内组织工程骨血管化的监测

目的:采用X线、放射性核素骨显像、磁共振灌注成像三种不同方法监测组织工程骨血管化的情况,对比分析各种方法的优缺点。方法:实验于2005-05/08在南方医科大学南方医院动物实验中心完成。①选用13只成年雄性恒河猴的26条下肢,取1条下肢用于骨髓基质干细胞的培养,其余25条下肢分为5组:β-磷酸三钙 骨髓基质干细胞 血管束组、β-磷酸三钙 血管束组、β-磷酸三钙 骨髓基质干细胞组、单纯β-磷酸三钙组、空白对照组,5条/组。β-磷酸三钙直径12mm,长度20mm,横截面呈C型。血管束来源于恒河猴胫骨内侧皮下隐动脉分支,其外径约0.8～1.0mm。②13只恒河猴麻醉后,取胫前直切口,沿胫前肌与胫骨间隙进入。于胫骨外侧放置7孔AO重建钛钢板,除第4孔外其余孔2.5mm钻头钻孔,3.5mm丝攻攻丝后钛螺钉固定。于钢板第3～5孔之间用线锯锯断胫骨,切除该段相应骨膜,造成2cm的段缺性骨与骨膜缺损。然后根据动物分组填入各自相应材料,制备动物模型。③各组术后4,8,12周行磁共振灌注成像检查并计算信号强度-时间曲线的最大线性斜率(SSmax)及基线值(SIbaseline),拍摄恒河猴胫骨X线片并计算其透光度,同时行放射性核素骨显像检查并计算摄取比值。结果:实验选用13只成年雄性恒河猴的25条下肢,全部进入结果分析。①各组术后骨缺损区X线检查结果:各组骨缺损区透光度随着术后周数的延长均呈现不同的下降趋势。与术后4周比较,术后8,12周β-磷酸三钙 骨髓基质干细胞 血管束组均明显下降(P=0.001);与术后8周比较,术后12周β-磷酸三钙 血管束组、β-磷酸三钙 骨髓基质干细胞组均明显下降(P=0.002,P=0.021)。②各组术后骨缺损区放射性核素骨显像结果:β-磷酸三钙 骨髓基质干细胞 血管束组、β-磷酸三钙 血管束组、β-磷酸三钙 骨髓基质干细胞组、单纯β-磷酸三钙组感兴趣区同位素计数比值均为术后8周最高,术后12周最低。③各组术后骨缺损区磁共振灌注成像情况:术后4,8,12周β-磷酸三钙 骨髓基质干细胞 血管束组的SSmax值最高,且术后8周与4周相比SSmax有较大幅度的提高(P=0.003)。术后12周β-磷酸三钙 骨髓基质干细胞 血管束组5个样本的SSmax与同期X线透光度呈负相关(r=-1.0,P=0.000)。结论:信号强度-时间曲线的SSmax能够准确反映组织工程骨的血管化情况,磁共振灌注成像检查具有无创、无辐射、高灵敏度和定量分析的优点。     

骨髓间充质干细胞作为干细胞参与生物材料异位诱导成骨

背景:体内骨组织工程是在骨或非骨部位植入具有骨诱导活性的生物材料,利用机体作为生物反应器去构建组织工程骨,以修复骨缺损.骨移植物所具备的优良生物相容性和机械性能为骨移植开辟新的治疗途径.然而,其相关干细胞来源尚不清楚.目的:探索骨髓间充质干细胞作为干细胞是否参与生物材料的异位诱导成骨.方法:分离纯化雄性beagle犬的骨髓间充质干细胞.将培养至第3代骨髓间充质干细胞移植入雌性beagle犬体内,建立同种异体骨髓移植模型,同期将双相钙磷陶瓷植入受体犬竖脊肌内.6周后,获取骨构建物标本,利用原位荧光杂交技术对骨移植物Y染色体进行示踪.结果与结论:原位荧光杂交结果显示Y染色体在骨构建物中有荧光信号表达,表明骨髓间充质干细胞可通过血液循环途径募集到异位生物材料处,形成骨组织.结果提示骨髓间充质干细胞参与生物材料异位诱导成骨,是生物材料异位诱导成骨干细胞来源之一.     

骨髓基质干细胞复合煅烧骨的皮下成骨

背景：研究证明骨髓基质干细胞与煅烧骨支架材料结合后可形成组织工程化骨,但在动物体内的生物相容性及皮下诱导成骨的能力国内报道较少. 目的：观察骨髓基质细胞复合异种煅烧骨植入BALB/c裸鼠背部皮下的成骨性能及煅烧骨材料作为组织工程骨支架材料的可行性. 方法：选用经脱脂及脱蛋白处理后高温煅烧形成的骨支架材料与梯度密度离心法分离培养至第3代的羊骨髓基质干细胞构建细胞-煅烧骨复合物植入 BALB/c 裸鼠背部皮下,选同期对侧背部皮下植入单纯煅烧骨为对照组. 结果与结论：煅烧后的松质骨块为白垩色,表面呈蜂窝状多孔结构,保留了天然松质骨的多孔状空间结构.骨小梁结构完整,孔隙相互连通.骨髓基质干细胞接种到煅烧骨后24 h可见大量细胞黏附于支架上,7 d后细胞分泌大量细胞外基质,细胞与基质分界不清,细胞能在材料上良好地黏附、增殖与生长,细胞活性未受到支架材料的影响.植入4周后,两组均可见煅烧骨边缘出现少量残片,细胞-煅烧骨复合物组煅烧骨孔隙周边可发现骨细胞,对照组煅烧骨表面可见纤维结缔组织包绕.植入后8周,两组均可见到煅烧骨部分降解为片状类骨质,周围有成纤维细胞包绕,排列紧密,形态多样,细胞-煅烧骨复合物组煅烧骨孔隙内可见煅烧骨表面有排列成行的成骨细胞,孔隙间有散在淋巴细胞浸润.对照组标本可见孔隙内有大量结缔组织长入,未见明显成骨迹象.结果说明,经高温煅烧后的松质骨材料,具有良好的生物相容性和生物安全性,可作为骨髓基质干细胞的良好载体,复合后植入体内能够诱导新生骨组织形成,可作为骨缺损组织工程修复的支架材料.     

异种脱蛋白松质骨支架构建组织工程骨用于脊柱横突间融合

背景:异种脱蛋白松质骨来源广泛且具有独特的生物学特性,若能解决其免疫原问题,将有望利用异种脱蛋白松质骨开发出一种新型植骨材料.目的:探讨异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程支架的性能,及其在山羊脊柱横突间融合中的作用.设计、时间及地点:细胞-支架学体内实验,于2008-02/10在黑龙江省纤维化生物治疗重点实验室完成.材料:6～8月龄健康雄性山羊12只,由牡丹江医学院动物中心提供.方法:取成年猪股骨远端松质部分,通过理化方法制成脱蛋白松质骨支架,对其形态结构、组成成分、生物力学特性以及材料对种子细胞生物学行为的影响进行检测分析.羊髂骨穿刺取骨髓,梯度密度离心法分离获得第3代骨髓间充质干细胞.将支架材料复合一定量的自体骨髓间充质干细胞、重组人骨形成蛋白2构建组织工程骨.12只羊建立L3、4双侧横突间植骨模型,修复组于左侧植入组织工程骨,对照组于右侧植入相同体积的自体髂骨.主要观察指标:分别于植入后4,8,12周行X射线片和组织学观察对比分析.结果:采用脱蛋白处理后的松质骨可见大小不等、相互交通、开放孔隙的网架结构:孔径200～500 μm,孔隙率60%左右,其无机成分为羟基磷灰石,有机成分为胶原,力学性能保存良好,细胞相容性良好.X射线片结果显示:植入第4周,横突桥接处部分区域模糊,以内侧明显,此时修复组材料密度略低于对照组;第8周上下桥接部间隙变小,大量连续骨痂生成;12周后完全融合,两组材料密度接近.移植区组织学观察结果显示:修复组植入后第4周以多点方式形成新骨,第8周岛状生成的骨组织贯穿整个移植材料,12周编织骨交错排列,髓腔形成,成骨活性接近自体髂骨移植;对照组植入后4周有较多新骨形成,8周时出现大量胶原纤维,周边成骨明显,至12周纤维组织减少,成骨活跃.结论:以异种脱蛋白松质骨为支架材料,复合骨髓间充质干细胞、重组人骨形成蛋白2构建组织工程骨,体外X射线衍射分析及力学测试与体内成骨实验均证明其具有良好的组织相容性和较强的成骨能力,是一种良好的组织工程骨支架材料.     

新型组织工程化骨材料植入动物体内的成血管效应

背景:以生长因子、种子细胞、载体支架为基础的骨组织工程研究取得的成功,向人们展示了再造骨组织器官的美好前景,然而在临床应用方面往往效果不理想.其中很重要一个原因是组织工程骨很大程度上受制于移植物血管网缺乏造成的细胞供养障碍而导致失效.目的:新型组织工程骨修复材料植入新西兰兔桡骨缺损处观察其成血管作用.方法:将聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物包裹碱性成纤维细胞生长因子制备成微球囊,然后与磷酸钙骨水泥混合,并与体外培养的同种异体骨髓间充质干细胞共培养制备新型组织工程骨修复材料.60只成年新西兰兔建立15 mm桡骨缺损模型后随机分成2组,实验组植入新型组织工程骨修复材料,对照组植入复合骨髓间充质干细胞的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物与磷酸钙骨水泥的混合材料.于术后4、8、12周,通过组织细胞形态学观察、核素骨扫描等手段,观察各个时期血管形成情况.结果与结论:光镜下组织形态学观察结果及核素骨扫描结果示血管化程度是实验组优于对照组.结果显示聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物-成纤维细胞生长因子/磷酸钙骨水泥材料复合骨髓间充质干细胞构建的新型组织工程骨修复材料在动物体内有较好的成血管效果.     

新型组织工程化骨材料植入动物体内的成血管效应

背景：以生长因子、种子细胞、载体支架为基础的骨组织工程研究取得的成功,向人们展示了再造骨组织器官的美好前景,然而在临床应用方面往往效果不理想。其中很重要一个原因是组织工程骨很大程度上受制于移植物血管网缺乏造成的细胞供养障碍而导致失效。目的：新型组织工程骨修复材料植入新西兰兔桡骨缺损处观察其成血管作用。方法：将聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物包裹碱性成纤维细胞生长因子制备成微球囊,然后与磷酸钙骨水泥混合,并与体外培养的同种异体骨髓间充质干细胞共培养制备新型组织工程骨修复材料。60只成年新西兰兔建立15mm桡骨缺损模型后随机分成2组,实验组植入新型组织工程骨修复材料,对照组植入复合骨髓间充质干细胞的聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物与磷酸钙骨水泥的混合材料。于术后4、8、12周,通过组织细胞形态学观察、核素骨扫描等手段,观察各个时期血管形成情况。结果与结论：光镜下组织形态学观察结果及核素骨扫描结果示血管化程度是实验组优于对照组。结果显示聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物-成纤维细胞生长因子/磷酸钙骨水泥材料复合骨髓间充质干细胞构建的新型组织工程骨修复材料在动物体内有较好的成血管效果。     

恒河猴体内组织工程骨血管化的监测

目的：采用X线、放射性核素骨显像、磁共振灌注成像三种不同方法监测组织工程骨血管化的情况，对比分析各种方法的优缺点。 方法：实验于2005—05／08在南方医科大学南方医院动物实验中心完成。①选用13只成年雄性恒河猴的26条下肢，取1条下肢用于骨髓基质干细胞的培养，其余25条下肢分为5组：β-磷酸三钙＋骨髓基质干细胞＋血管束组、β-磷酸三钙＋血管束组、β-磷酸三钙＋骨髓基质干细胞组、单纯β-磷酸三钙组、空白对照组，5条／组。β-磷酸三钙直径12mm，长度20mm，横截面呈C型。血管束来源于恒河猴胫骨内侧皮下隐动脉分支，其外径约0．8-1．0mm。②13只恒河猴麻醉后，取胫前直切口，沿胫前肌与胫骨间隙进入。于胫骨外侧放置7孔AO重建钛钢板．除第4孔外其余孔2．5mm钻头钻孔，3．5mm丝攻攻丝后钛螺钉固定。于钢板第3-5孔之间用线锯锯断胫骨，切除该段相应骨膜，造成2cm的段缺性骨与骨膜缺损。然后根据动物分组填入各自相应材料，制备动物模型。③各组术后4，8，12周行磁共振灌注成像检查并计算信号强度-时间曲线的最大线性斜率（SSmax）及基线值（SIbaseline），拍摄恒河猴胫骨X线片并计算其透光度，同时行放射性核素骨显像检查并计算摄取比值。 结果：实验选用13只成年雄性恒河猴的25条下肢，全部进入结果分析。①各组术后骨缺损区X线检查结果：各组骨缺损区透光度随着术后周数的延长均呈现不同的下降趋势。与术后4周比较，术后8，12周β-磷酸三钙＋骨髓基质干细胞＋血管束组均明显下降（P=-0．001）；与术后8周比较，术后12周β-磷酸三钙＋血管束组、β-磷酸三钙＋骨髓基质干细胞组均明显下降（P=-0.002，P=-0.021）。②各组术后骨缺损区放射性核素骨显像结果：β-磷酸三钙＋骨髓基质干细胞＋血管束组、β-磷酸三钙＋血管束组、β-磷酸三钙＋骨髓基质干细胞组、单纯β-磷酸三钙组感兴趣区同位素计数比值均为术后8周最高，术后12周最低。③各组术后骨缺损区磁共振灌注成像情况：术后4，8，12周β-磷酸三钙＋骨髓基质干细胞＋血管束组的SSmax值最高，且术后8周与4周相比SSmax有较大幅度的提高（P=0.003）。术后12周β-磷酸三钙＋骨髓基质干细胞＋血管束组5个样本的SSmax与同期X线透光度呈负相关（r=-1.0，P=-0.000）。 结论：信号强度-时间曲线的SSmax能够准确反映组织工程骨的血管化情况，磁共振灌注成像检查具有无创、无辐射、高灵敏度和定量分析的优点。