白纹伊蚊和埃及伊蚊防御素(defensin)成熟肽基因克隆及结构推测

应用PCR技术从白纹伊蚊和埃及伊蚊基因组中扩增出defensin成熟肽基因并对其分子生物学特性进行分析 ,发现埃及伊蚊 (BoraBora株、海口株 )、白纹伊蚊 (成都株、宜兴株、广州株 )推导的氨基酸序列与埃及伊蚊defensinA相同 ;通过Chou Fasman预测法对defensinA成熟肽的二级结构进行预测 ,可以看出在defensin成熟肽氨基酸序列的 15～ 2 3位有一个α 螺旋 ,35～ 39位有一个 β 折叠 ,32～ 34位有一个转角 ;通过同源性比较推测蚊虫defnsinA的三级结构     

云南省边境地区埃及伊蚊和白纹伊蚊孳生特征调查

埃及伊蚊和白纹伊蚊是登革热的主要传播媒介,蚊虫孳生情况的持续调查和分析,有助于对种群变化进行实时监控,从而为登革热的防治提供理论依据.2017-2020年,每年9-10月在云南省西双版纳州(勐腊县、景洪市、勐海县),临沧市(镇康县南伞镇、耿马县孟定镇),德宏州(瑞丽市)共6个市(县)调查埃及伊蚊和白纹伊蚊孳生地类型并捕捞幼虫,对4龄幼虫分类鉴定以观察两种伊蚊特征.结果 显示,此次在所调查的6个市(县)均发现两种伊蚊孳生地,共560个.孳生地类型以家用水桶类最多,占比44.82％.边境各地区居民区调查发现埃及伊蚊孳生地占比33.64％,商业区埃及伊蚊占比48.89％,两种调查地埃及伊蚊数量差异存在统计学意义,在商业区埃及伊蚊占比高于居民区.2017年西双版纳州和瑞丽市白纹伊蚊孳生地占比分别为75.51％和67.44％,2020年为36.67％和38.10％,说明两地白纹伊蚊构成比下降.两地区埃及伊蚊孳生地占比由2017年的18.37％和16.28％增长为2020年的43.33％和42.85％,说明埃及伊蚊构成比上升.结果 表明,由于埃及伊蚊比白纹伊蚊传播登革热的能力更强,2020年的西双版纳州和瑞丽市较2017年,商业区较居民区暴发登革热的潜在风险更高.     

实验感染登革Ⅱ型病毒的2种蚊媒RT-PCR检测defensin A结果分析

白纹伊蚊和埃及伊蚊在经口大剂量感染登革Ⅱ型病毒1天、2天、3天和11天后,用RT-PCR方法都未能在其体内检测到defensin A的mRNA的表达,提示登革Ⅱ型病毒感染其有效媒介宿主白纹伊蚊和埃及伊蚊后并不诱导defensin A的表达,或者表达量极低用RT-PCR方法不能检测到.     

埃及伊蚊钠通道基因克隆与序列分析

电压依赖性钠离子通道是许多神经毒性药物的作用靶标。本研究采用RT PCR技术 ,利用简并引物从埃及伊蚊中扩增的钠通道基因片段为460 9bp ,编码 1 5 3 6个氨基酸 ,经Clustal软件分析发现与黑尾果蝇钠通道基因 (para)和家蝇钠通道基因 (Vssc1 )有很高的相似性 ( 80 % ,78% )。     

白纹伊蚊气味结合蛋白的研究进展

气味结合蛋白（OBPs）是昆虫嗅觉系统的一类重要蛋白分子,可能与蚊虫的吸血、寻偶和产卵等生理行为密切相关,本文就白纹伊蚊的OBPs的研究进展、研究前景和意义进行综述。     

白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6基因全长cDNA的快速扩增

根据本室已获得的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6家族成员cDNA序列片段，设计一对特异性引物．以上述蚊株总RNA为模板，分别进行5’-cDNA末端快速扩增(5’-RACE)和3’-cDNA末端快速扩增(3’-RACE)，所获得的产物经1．2％琼脂糖凝肢电薄，显示：5’-RACE产物达I.5kb，3’-RACE产物达500bp，扣陈两重叠部分的已知cDNA片段(250bp)，则该CYP6家族成员生长cDNA长度达1．75kb，与其它昆虫中已知的CYP6家旅全长cDNA长度相似；然后再分别切胶回收，并以此(RACE产物)为模板，用上述双引物进行PCR鉴定，结果显示2个RACE产物均包含有已知的250bp cDNA片段，提示所得的RACE产物为该CYP6家族成员生长cDNA。     

白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株4龄幼虫cDNA文库的构建

目的 :构建白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫cDNA文库。方法 :抽提、纯化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫总RNA ,进行反转录合成第 1链cDNA ;用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒进行长距离PCR ,合成全长双链cDNA ;PCR产物经蛋白酶K消化、提纯后 ,进行SfiI酶切 ;用ChromaSpin 40 0柱将酶切产物进行分级分离 ,然后经 1 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 ,回收 40 0bp以上的组分 ,并与λTriplEx2载体连接 ;连接产物经体外蛋白包装 ,产生未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库的扩增 ,并测定扩增文库的滴度 ;随机挑取 9个噬菌体 ,用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增 ,以检测所构建的cDNA文库的质量。结果 :经检测 ,未扩增文库滴度达 2 0× 10 7pfu mL ,重组效率在 10 -4 稀释度时每块平板约 2 10～ 2 5 5个噬菌斑中均未发现任何蓝色噬斑 ,扩增文库滴度达 1 75× 10 9pfu mL ;用载体克隆位点两端的引物进行PCR鉴定 ,结果显示 :所选 9个噬菌体中均含有重组的cDNA ,并且均在 5 0 0bp以上 ,其中 1kb以上的有 2个、 70 0bp的有 5个、 5 0 0bp的有 2个。结论 :已成功地获得一高质量的白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株 4龄幼虫cDNA文库。     

白纹伊蚊唾液抗血小板凝集因子Apyrase基因片段的克隆测序

抗血小板凝集因子Apyrase是吸血昆虫唾液的重要功能因子 ,能水解被吸血宿主血液中血小板释放的ATP、ADP而抑制血小板凝集 ,以利吸血过程的顺利进行。本研究针对我国的白纹伊蚊 ,用兼并引物PCR法扩增了抗血小板凝集因子Apyrase的基因片断 ,并克隆入T载体进行了测序 ,经Clastal比较发现与埃及伊蚊相应序列有很高的同源性 ,为进一步的研究打下基础。     

广州地区农村登革热旧疫点白纹伊蚊密度消长特点分析

目的探索广州农村登革热旧疫点白纹伊蚊密度特点及消长规律。方法在农村设立监测点对自然环境中白纹伊蚊幼虫及成蚊密度进行长期连续监测。结果农村中白纹伊蚊幼虫孳生地以室外环境为主,全年皆可在积水容器中检出幼虫,白纹伊蚊幼虫和成蚊密度消长与季节密切相关。结论以室外孳生地为主的农村地区白纹伊蚊种群易受气候因素影响,幼虫密度高峰与成蚊密度高峰之间存在一定的时间差,其规律性有待于进一步研究。     

2011～2015年宁波地区白纹伊蚊孳生调查分析

本研究通过对2011 ～2015年4～11月每月上、下旬对不同生境中的积水容器进行调查,分别计算容器指数、房屋指数和布雷图指数,分析不同月份及生境密度指数变化趋势.经研究,2013年各指数相对较低,各年不同指数随月份变化趋势明显,6～9月为指数相对较高的月份.居民区和城乡结合部容器指数最高,分别为10.86％和9.84％.总体上,宁波市以白纹伊蚊为媒介暴发蚊媒传染病疫情的风险较低,但应加强对7～9月的风险监测,环境条件对密度指数影响较大,应重视在6月份开展爱国卫生运动及对人员密集场所的环境消杀工作,加强宣传教育.     

埃及伊蚊唾液腺激肽SialokininI基因的克隆

唾液腺激肽是埃及伊蚊唾液中的舒血管物质 ,不仅在蚊虫吸血过程中有重要作用 ,还可能具有调节宿主细胞免疫的功能。本研究用PCR方法从基因组DNA扩增出唾液腺激肽的基因并进行了克隆测序 ,发现与报道的埃及伊蚊相应基因序列有几个碱基的差异 ,同源性 97 8% ,但成熟肽部分序列未发现差异 ,这一部分基因序列人工合成克隆入硫氧还蛋白融合表达载体进行了融合表达 ,为进一步的研究打下基础     

白纹伊蚊基因组中CYP6家族新成员基因片段的克隆与分析

目的获得白纹伊蚊CYP6基因家族中新成员的基因片段。方法根据家蝇CYP6A1、CYP6D1以及致倦库蚊CYP6E1同源区氨基酸序列,设计1对简并引物,分别以白纹伊蚊敏感品系和抗性品系基因组DNA为模板进行PCR,产物经T-A克隆转化至JM109大肠杆菌中,经筛选后测序,获得与设计的细胞色素P450基因片段大小相符合的5个基因片段,并将推导的氨基酸序列进行同源性分析。结果在白纹伊蚊敏感品系中获得了2个基因片段(AEDG-S1,AEDG-S2),核苷酸序列长度分别为240bp和236bp;在白纹伊蚊溴氰菊酯抗性品系中获得了3个基因片段(AEDG-R2,AEDG-R3,AEDG-R4),核苷酸序列长度分别为236bp、236bp和239bp。所得序列与昆虫CYP6家族的同源性在23.1%～53.8%之间,与CYP3家族的同源性在25.6%～43.9%之间,而与CYP4家族同源性较低,为13.9%～24.4%。结论所得5个序列为CYP6家族中5个新成员的基因片段。     

白纹伊蚊(广州株)唾液Aalb_56 ku基因克隆表达与免疫原性分析

探讨Aalb_56 ku基因在白纹伊蚊(广州株)不同组织中的表达差异;对唾液腺中Aalb_56 ku基因进行克隆表达并探索其免疫原性。采用实时荧光定量RT-PCR法对雌蚊中肠、脂肪体、唾液腺不同组织中Aalb_56 ku基因的表达差异进行分析。针对Aalb_56 ku基因序列设计特异性引物,以唾液腺RNA为模板获得56 ku全长基因序列,构建重组质粒并测序,将测序序列进行生物信息学和抗原表位预测分析。IPTG诱导表达,亲和层析法纯化重组蛋白;制备小鼠特异性抗Aalb_56 ku蛋白抗血清。结果显示,Aalb_56 ku在白纹伊蚊(广州株)唾液腺(SG)中高表达。克隆所获唾液腺56 ku基因全长1 593 bp,可编码530个氨基酸,信息学分析提示该基因含有信号肽序列,等电点为8.40,抗原表位预测提示含有23个表位。p ET30a(+)-56 ku重组质粒可表达约56 k Da大小的融合蛋白,且呈包涵体形式表达,Western blotting鉴定具有His标签。纯化蛋白免疫Balb/c小鼠后可获得1∶100效价的特异性抗血清,提示该重组蛋白具有一定的免疫原性。     

白纹伊蚊T7噬茵体展示cDNA文库的构建

为筛选白纹伊蚊与相关蚊媒病毒相互作用的基因,本文构建了白纹伊蚊Aedes albopictusT7噬菌体展示eDNA文库,分离与纯化白纹伊蚊mRNA,所得mRNA经反转录合成双链cDNA后,在双链cDNA末端加上定向EcoRI／HindIn接头使其两端分别带EcoRI和Hind11I黏性末端;接着用MiniColumn纯化收集300bp以上的双链cDNA片段连接于T7 Select 10—3b载体;经体外包装后,以BLT5403为受体菌构建1v7噬菌体展示cDNA文库。所建文库的库容量经测定为1．7×10’pfu／mL,扩增后文库滴度为2．5×10^（15）pfu／mL。对从原始文库中随机挑取的50个噬菌斑进行PCR鉴定,重组率为95％以上;阳性克隆片段长度分布在200～2000bp,其中有90％的插入片段大于300bp。本文所构建的白纹伊蚊T7噬菌体展示cDNA文库,满足cDNA文库的基本要求,可以用于筛选白纹伊蚊与相关蚊病毒相互作用的基因。     

埃及伊蚊腺苷脱氨酶相关基因的鉴定和表达分析

为了筛选和鉴定埃及伊蚊全基因组中腺苷脱氨酶相关基因,并分析其在蚊虫不同发育时期、雌蚊不同组织中的表达差异,本文运用模式昆虫黑腹果蝇Dm-ADA基因的ADA结构域序列在NCBI埃及伊蚊全基因组数据库中筛选并鉴定埃及伊蚊ADA相关基因,采用ExPASy在线相关工具包分析其理化性质和结构域,运用Signal P4.0预测信号肽,结合使用Gene Doc和Mega6.0软件包进行同源性比对和构建系统进化树构建。首先提取埃及伊蚊不同发育时期(卵、Ι~Ⅳ龄幼虫、蛹、未吸血雌蚊、雄蚊)、雌蚊不同组织(唾液腺、中肠、脂肪体和卵巢)RNA并逆转录为cDNA,利用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)方法对埃及伊蚊不同发育时期和雌蚊不同组织表达谱进行相对定量分析。结果显示,从埃及伊蚊全基因组中获得3条具有完整开放阅读码框的ADA相关基因(Aa-ADAL、Aa-ADGF-A、Aa-ADGF-B);尽管不同物种ADA基因家族成员间相似性较低,但8个酶活性位点高度保守。Aa-ADAL在2龄幼虫期(7.88)、卵巢(8.05)高表达;Aa-ADGF-A在3龄幼虫期(7.25)高表达;Aa-ADGF-B在雌蚊唾液腺(10.07)显著高表达。经分析,2条属于ADA2/ADGF亚家族,1条属于ADAL亚家族。