Rsa Ⅰ与Sma工多态性寡核苷酸阵列检测法的建立及其与血栓性疾病的相关性研究

目的建立血管性血友病因子(vWF)基因Bsa Ⅰ、Sma Ⅰ多态性寡核苷酸阵列检测方法,对基因芯片在单核苷酸多态性(SNP)检测上的应用进行探讨;研究两位点多态性与血栓性疾病的发生有无相关关系.方法设计、合成两组寡核苷酸探针,使用3甲氧基氨基丙基硅烷、戊二醛等化学物质,实现探针与固相支持物玻片的连接.应用不对称PCR方法扩增Rsa Ⅰ、Sma Ⅰ多态性片段,在扩增体系中掺入荧光标记dUTP,获得被测片段的单链标记产物.对核酸杂交反应的温度、动力学和离子浓度变化进行研究,获得最佳的杂交鉴别条件.对20名正常人,酶切法确定多态性基因型,再用寡核苷酸阵列法检测,以验证该方法的准确性.使用该方法对50例血栓病人进行检测,探讨血栓性疾病的发生与vWF基因Rsa Ⅰ、Sma Ⅰ多态性的关系.结果寡核苷酸阵列法和酶切法对20例标本检测的符合率为100%;血栓病人与正常人Bsa Ⅰ、Sma Ⅰ两位点多态性的基因型GG、GA、AA和CC、CT、TF分别为4.0%、12.0%、84.0%和24.0%、44.0%、32.0%,正常人分别为1.4%、11.8%、86.8%和8.8%、57.4%、33.8%,血栓病人等位基因频率G、A和C、T分别为10.0%、90.0%和46.0%、54.0%,正常人分别为7.4%、92.6%和37.5%、62.5%,血栓病人与正常人之间两位点多态性的基因型和等位基因频率的差异均无显著意义(P>0.05).结论成功建立vWF基因RsaⅠ、Sma Ⅰ多态性寡核苷酸阵列检测方法,为基因芯片技术在SNP检测上的应用提供依据.未获明确证据表明Rsa Ⅰ、Sma Ⅰ多态性与血栓的发生有关.     

CAPN10基因单核苷酸多态性与西南地区人群2型糖尿病的相关性研究

目的：探讨calpainl0基因单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism,SNP）与西南地区汉族人群2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus,T2DM）遗传易感性的关系。方法：采用病例一对照研究设计,对144例T2DM患者和98例正常对照者采用双向等位特异性PCR技术（Bi—PASA）,检测calpain10基因SNP43MG位点、SNPddC／T位点和SNP56A／G位点的基因型,并进行关联分析。结果：与对照组相比,病例组SNP43的G／G等位基因型频率、SNP44的C／T等位基因型频率和SNP56的A／A等位基因型频率显著升高（分别为86．11％,73．5％;36．8％,19．36％;38．0％,9．8％）。SNP43的G等位基因频率、SNP44的C等位基因频率和SNP56的A等位基因频率在西南地区T2DM人群中显著升高（分别为93．06％,86．22;19．1％,9．69％;60．07％,44．96％）;单体型ATG、GCA、GTG频率在病例组与对照组的分布具有显著差异。结论：calpain10基因可能为西南地区汉族人群T2DM的易感基因。     

海南地区汉黎族正常人群ACE基因多态性的分布

目的了解海南地区汉族、黎族正常人群ACE基因多态性插入／缺失（I／D）频率的分布情况。方法采用聚合酶链反应（PCR）检测97例海南地区汉族正常人与146例黎族正常人血中ACE基因16内含子I／D多态标记，得到三种基因型：缺失纯合子（DD型）、插入纯合子（Ⅱ型）及插入缺失杂舍子（DI型）。并对所有普通PCR定为DD型的样本进行插入特异性PCR检测，以减少误分型率。统计各基因型频率，计算等位基因频率。结果海南地区汉族正常人DD、DI、Ⅱ基因型频率分别为15．5％、44．3％、40．2％，D及I等位基因频率分别为37，6％、62．4％；黎族正常人DD、DI、Ⅱ基因型频率分别为13．0％、43．8％、43．2％，D及I等位基因频率分别为34．9％、65．1％。两组之间DD、DI、Ⅱ基因型频率及D、I等位基因频率均无显著性差异。结论海南地区汉族、黎族正常人群ACE基因多态性（I／D）的频率分布相接近，与中国内地汉族人群ACE基因多态性（I／D）的频率分布相接近。     

宫颈癌候选抑癌基因的单核苷酸多态性

目的 :检测人膀胱癌相关蛋白 (BLACP)基因调控区的单核苷酸多态性 (SNP)及其基因型在宫颈癌高发区———湖北省五峰县土家族人群中的分布情况 ,并分析其不同基因型与原发性宫颈癌的相关性。方法 :采用病例 对照研究方法及动态等位基因杂交 (DASH)技术 ,对 30例原发性宫颈癌患者和 6 0例正常人BLACP基因调控区的 2个单核苷酸多态性 (SNP)位点进行检测。结果 :位于BLACP基因下游调控区的SNPrs3795 14 7位点存在AA、AC和CC 3种基因型 ,且与宫颈癌发病存在显著相关性 ,其中基因型CC和AC的相对危险度分别为 33.333和 3.76 1;位于BLACP基因上游调控区的SNPrs3795 14 8位点存在CC、CT和TT3种基因型 ,但其等位基因型频率和等位基因频率在宫颈癌患者与正常人群之间无明显差异。结论 :BLACP基因上SNP位点型别的不同 ,可能导致了个体对宫颈癌的易感性不同。     

INSIG1基因SNPrs9769506位点的多态性与2型糖尿病的关系

目的：探讨胰岛素诱导基因1（INSIG1）单核苷酸多态性（SNP）rs9769506位点的多态性与2型糖尿病（T2DM）的相关性,以期为 T2DM 的防治提供潜在的分子靶点。方法选择河南省南阳市中心医院2013年1月至2014年3月收治的 T2DM患者98例,另选取体检中心的健康体检者90例作为对照组,INSIG1基因 SNP rs9769506位点多态性检测使用实时荧光定量PCR（RT‐PCR）Taqman 分析。结果 T2DM 组 rs9769506位点 A 等位基因频率为54．1％,G 等位基因频率为45．9％,对照组 A等位基因频率为47．8％,G 等位基因频率为52．2％,两组之间差异无统计学意义（P ＞0．05）。 T2DM 组患者 rs9769506位点 A/A 、A /G 和 G/G 基因型频率分别为41．8％、24．5％和33．7％,对照组 rs9769506位点 A/A 、A/G 和 G/G 基因型频率分别为32．2％、31．1％和36．7％,A/A 基因型频率在对照组和 T2DM 组之间差异有统计学意义（P＜0．05）,而 A/G 和 G/G 基因型频率在对照组和 T2DM 组之间差异则无统计学意义（P＞0．05）。 T2DM 患者中三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL‐C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL‐C）表达水平在 A /A 、A/G 、G/G 基因型患者之间差异有统计学意义（P ＜0．05）,而 A/G 、G/G 基因型患者之间差异无统计学意义（P＞0．05）。结论 INSIG1基因 SNP rs9769506位点 A/A 基因型在 T2DM 患者中检出率高,对 T2DM 早期筛查及基因治疗具有临床指导意义。     

飞行人员代谢综合征患者胰岛素受体第8外显子Nsi I位点基因多态性研究

目的研究胰岛素受体（INSR）基因多态性与飞行人员代谢综合征（MS）的相关性。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR—RFLP）和基因测序技术检测38名飞行人员MS患者和50名正常健康飞行人员INSR第8外显子Nsi I位点基因多态性。结果INSR第8外显子Nsi I位点的基因型和等位基因在飞行人员MS组和正常健康对照组存在统计学差异,INSR基因N2等位基因频率在MS组高于对照组（P〈0．01）。结论INSR第8外显子Nsi I位点基因多态性与飞行人员MS相关,N2等位基因可能是一个易感基因：     

海南黎族高血压人群血管紧张素转换酶基因多态性研究

目的 观察血管紧张素转换酶（ACE）基因16内含子插入／缺失（I／D）多态性与海南黎族高血压的关系。方法 采用聚合酶链反应（PCR）检测146例黎族正常对照组与111例高血压病人血中ACE基因16内含子I／D多态标记,得到3种基因型：缺失纯合子（DD型）、插入纯合子（Ⅱ型）及插入缺失杂合子（DI型）。并对所有普通PCR定为DD型的样本进行插入特异性PCR检测,以减少误分型率。统计各基因型频率,计算等位基因频率。结果 海南黎族正常对照组DD、DI、11基因型频率分别为13．0％、43．8％、43．2％;D及I等位基因频率分别为34．9％、65．1％。海南黎族高血压组DD、DI、11基因型频率分别为10．8％、37．8％、51．4％;D及I等位基因频率分别为29．7％、70．3％。两组之间DD、DI、Ⅱ基因型频率及D、I等位基因频率均无显著性差异。结论 黎族正常人和高血压病人的D等位基因频率均比I等位基因频率低;ACE基因I／D多态性与黎族高血压无显著关联。     

MDM2基因多态性与鲁西南汉族人群食管鳞癌风险关联

目的研究MDM2基因多态性在鲁西南汉族人群中的分布并分析其与食管鳞癌的相关性。方法采用聚合酶链反应一限制性内切酶片段长度多态性（FCR—RFLP）技术分析检测132食管鳞癌患者（病例组）和132非食管癌患者（对照组）MDM2SNP309的基因多态性,并比较不同基因型与食管鳞癌发病风险的关系。结果MDM2SNP309基因座位上突变等位基因频率在正常对照组和病例组分别为37．50％和45．45％,基因频率在两组间的分布无显著性差异（P〉0．05）;SNP309基因座中突变等位基因G的纯合子G／G基因型频率在对照组和病例组分别为10．61％和18．94％,频率差异具有统计学意义（P〈0．05）;MDM2SNP309的G／G基因型可增加食管鳞癌的发病风险（OR=2．27;95％CI：1．04～4．97）。结论MDM2基因SNP309位点的G／G基因型可能与鲁西南地区食管鳞癌的发病风险增高具有相关性。     

组织激肽释放酶基因与2型糖尿病关系的研究

目的初步探讨组织激肽释放酶基因调控序列启动子多态性与中国人2型糖尿病的相关性。方法应用PCR技术结合等住基因特异寡核苷酸片段分析（ASO）方法,对30例2型糖尿病患者和40例正常人的组织激肽释放酶基因用A、B、C、D、E、F、H、I、K、P10种探针检测,比较组间的等位基因频率差异,初步分析该SNP位点与2型糖尿病的关系。结果组织激肽释放酶基因启动子A、B、H、K型在2型糖尿病组中的分布频率分别为46．67％、35．0％、15．0％、3．33％,在对照组中分别为45．0％、37．5％、17．5%、0％,两组比较有差异,但无统计学意义。结论在中国汉族人群中,该位点确实有多态性,A、B、H、K型均有分布,以A型最广。     

广西壮族人群骨桥蛋白基因的单核苷酸多态性研究

目的：分析骨桥蛋白基因单核苷酸多态性（SNP）位点 rs11728697和 rs9138的基因型和等位基因型在广西壮族人群中的分布频率,对比其在不同国家或地区人群间的分布差异。方法利用 SNaPshot SNP 分型技术检测150例广西壮族骨桥蛋白基因 SNP 位点 rs11728697和 rs9138的基因型,对比国际人类基因组单倍型图谱计划（HapMap）上4个人群（欧洲人群、非洲人群、日本人群和中国北京人群）的 SNP 分型数据,分析5个人群的骨桥蛋白基因 SNP 位点 rs11728697和 rs9138的基因型和等位基因频率差异。结果在广西壮族人群中,骨桥蛋白基因 rs11728697位点的 CC 基因型最常见,约为42．7％;C 等位基因的频率最高,约为62．7％。 rs9138位点的 CA 基因型最常见,约为51．3％;C 等位基因的频率最高,约为63．0％。骨桥蛋白基因型及等位基因频率男女组间比较差异无统计学意义（P＞0．05）。广西壮族人群骨桥蛋白基因 rs11728697位点的基因型和等位基因频率与欧洲人群、日本人群和非洲人群的差异有统计学意义（P＜0．05）,而与中国北京人群的差异无统计学意义（P＞0．05）。广西壮族人群骨桥蛋白基因 rs9138位点的基因型和等位基因频率与欧洲人群和非洲人群的差异有统计学意义（P＜0．05）,而与日本人群和中国北京人群的差异无统计学意义（P＞0．05）。结论骨桥蛋白基因 SNP 位点 rs11728697和 rs9138基因型和等位基因在广西壮族人群中的分布频率与不同国家或地区人群相比存在差异,这种差异可能是导致某些疾病在不同国家或地区间发病率和临床表现存在差异的因素之一。     

Sma I, Hha I, Msp I and Rsa I restriction fragment length polymorphisms in the von Willebrand factor gene of Chinese population

OBJECTIVE To study Sma I, Hha I, Msp I and Rsa I restriction fragment length polymorphisms in vWF gene of Chinese population.

METHODS The vWF gene from 52 unrelated individuals of Han Nationality, 44 of Yi tribe, 42 of Dai tribe was analyzed by polymerase chain reaction and digestion of the endonucleases of Sma I, Hha I, Msp I and Rsa I.

RESULTS The allele frequencies were 0.38:0.62 for Sma I+:Sma I- and 0.38:0.62 for Hha I+:Hha I-; 0.20:0.80 for Msp I+:Msp I-; 0.93:0.07 for Rsa I+:Rsa I- in Chinese Han population. The theoretical heterozygous rates were 0.46, 0.46, 0.36 and 0.13 of these polymorphisms, respectively. The allele frequencies were 0.43:0.57 for Sma I+:Sma I- and 0.43:0.57 for Hha I+:Hha I-, 0.26:0.74 for Msp I+:Msp- in Yi tribe and 0.36:0.64 for Sma I+:Sma I- and Hha I+:Hha I-, 0.17:0.83 for Msp I+:Msp I- in Dai tribe. The theoretical rates were 0.49 for Sma I and Hha I and 0.38 for Msp I in Yi tribe; and 0.45 for Sma I and Hha I, 0.28 for Msp I in Dai tribe, respectively.

CONCLUSIONS The allele frequencies and theoretical rates of these polymorphisms in vWF gene are different between Chinese populations and Caucasians. They should be useful for the carrier detection and prenatal diagnosis in vWD families of Chinese.

     

Sma Ⅰ,Hha Ⅰ,Msp Ⅰ and Rsa Ⅰ restriction fragment length polymorphisms in the von Willebrand factor gene of Chinese population

ｖｏｎＷｉｌｅｂｒａｎｄｄｉｓｅａｓｅ（ｖＷＤ）ｉｓａｎａｕｔｏｓｏｍａｌｙｉｎｈｅｒｉｔｅｄｂｌｅｅｄｉｎｇｄｉｓｏｒｄｅｒｃａｕｓｅｄｂｙｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅｄｅｆｅｃｔａｎｄ／ｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｖｏｎＷｉｌ...     

Association between estrogen receptor beta gene polymorphisms and Parkinson disease

OBJECTIVE: To investigate the association between two estrogen receptor (ER) beta gene polymorphisms and Parkinson disease (PD) as well as Parkinson disease with dementia (PDD) in Chinese people. METHODS: Peripheral blood samples were collected from 115 PD patients (including 26 PDD cases), 56 males and 55 females, aged 64 +/- 10, and 116 sex and age-matched healthy controls. Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method was used to analyze the polymorphism of the fifth exon RsaI and the eighth exon AluI of ERbeta gene. Te relationship between each genotype or allele frequencies and PD/PDD was analyzed using chi-square test. RESULTS: There was no difference in the polymorphism of ERbeta genes AluI and Rsa I between the PD group and control group and between the PDD group and control group (all P > 0.05). CONCLUSION: Genetic variations from AluI and RsaI digestion in ERbeta gene do not affect the risk of PD and PDD.     

雌激素受体β基因多态性与帕金森病的相关性

目的 探讨中国汉族人群雌激素受体(ER)β基因Alu Ⅰ、Rsa Ⅰ酶切多态性与帕金森病(PD)和帕金森病痴呆(PDD)的相关性.方法 采用病例-对照研究和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性.方法,对115例PD患者(包括26例PDD)和116名健康对照进行ERl3基因多态性分析,经卡方检验,分析各基因型、等位基因频率与PD、PDD患病的相关性.结果 (1)ERl3基因Alu Ⅰ、Rsa Ⅰ的酶切多态性在PD组和对照组问差异无统计学意义(均P>0.05).(2)PDD组与对照组相比,Erβ基因的Alu Ⅰ、Rsa Ⅰ的酶切多态性差异也无统计学意义(均P>0.05).结论 Erβ基因AluⅠ、Rsa Ⅰ的酶切多态性不影响PD和PDD的患病风险.     

维生素D受体基因FokⅠ及BsmⅠ多态性与老年男性2型糖尿病脂代谢异常的相关性

目的探讨维生素D受体（VDR）基因FokⅠ和BsmⅠ位点多态性与北京地区汉族老年男性2型糖尿病脂代谢异常的相关
性。方法采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术（PCR-RFLP）和基因测序技术,检测328例北京汉族老年男性VDR
基因FokⅠ和BsmⅠ位点基因型和等位基因频率,同时与相关临床指标进行比较。其中2型糖尿病患者（DM组）237例与正常对
照（NC组）91例。根据血脂情况将DM组分为非血脂异常组（DO组）134例和血脂异常组（DH组）103例。结果VDR基因Fok
Ⅰ和BsmⅠ位点基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡,具有群体代表性。VDR基因FokⅠ位点F等位基因频率在DM组较
NC组显著升高（χ2=3.873,P=0.049,OR=1.439,95% CI：1.001-2.071）。在显性模型下,DM组FF基因型频率较NC组显著升高（χ2=
5.057,P=0.025,OR=1.756,95% CI：1.072-2.875）;DH组FF基因型频率较NC组显著升高（χ2=6.168,P=0.013,OR=2.06,95% CI：
1.161-3.663）;其余各组组间比较,基因型及等位基因频率差异均无统计学意义（P>0.05）;与Ff+ff基因型比较,FF基因型人群的
平均舒张压水平显著降低,而餐后2 h血糖、甘油三酯、尿酸的水平显著升高,差异有统计学意义（分别是P=0.039;P=0.035;P=
0.049;P=0.031）。BsmⅠ位点基因型及等位基因频率在各组间的差异均无统计学意义（P>0.05）。bb基因型人群血肌酐水平显
著高于BB+Bb基因型,差异有统计学意义（P=0.011）。结论VDR基因FokⅠ位点多态性可能是老年男性2型糖尿病合并脂代
谢异常的危险因素,而BsmⅠ多态性可能与老年男性2型糖尿病无相关。
     

A new discovered ABCA1 gene polymorphisms and the association of ABCA1 SNPs with coronary artery disease and plasma lipids in Chinese population

Objective

Single nucleotide polymorphisms (SNP) of ATP-binding cassette transporter Al (ABCA1) gene are related to plasma lipid and susceptibility to coronary artery disease (CAD). Our first goal was to screen all 50 coding regions of ABCA1 to find new SNPs. Our second goal was to investigate the frequency distribution of R1587K and M883I polymorphisms of ABCA1 gene, which are the variant occurred most frequently, in Chinese people and to evaluate their association with the CAD phenotype and plasma lipids.

Methods

Single-strand conformation polymorphism (SSCP) and DNA sequence were used for confirming new SNP of ABCA1, and restriction fragment length polymorphism (RFLP) were applied for confirming genotypes of R1587K and M883I in 112 CAD cases and 108 healthy people.

Results

We discovered a new ABCA1 SNP in Chinese population, which converse 233 amino acids from Methionine to Valine (M233V). This new ABCA1 SNP located in exon7, and might potentially modulate the biological function of lipid metabolism. For R1587K and M883I SNPs, the K alele and I alele frequency was 28.9% and 31.1%, respectively. The K allele at R1587K conferred lower mean values of HDL-C in a dose-dependent manner in both CAD patients and healthy people. However, 883I allele was not associated with plasma lipid level. Neither 1587KK nor 883II associated with increased risk of CAD.

Conclusion

Our study finds a potential functional ABCA1 SNPs and revealed K allele of R1587K associated decreased HDL-C level in Chinese population.     

磷酸二酯酶4D基因多态性与动脉粥样硬化血栓形成性脑卒中的关系

目的采用病例对照研究探讨中国汉族人群磷酸二酯酶4D(phosphodiesterase 4D,PDE4D)基因与动脉粥样硬化血栓形成性脑卒中(atherothrombosis ischemic stroke,AIS)的关系。方法应用聚合酶链反应—限制性片段长度多态性方法,检测235例浙南地区汉族人群AIS患者和105例非脑卒中对照组PDE4D基因SNP83、32酶切多态性。结果 AIS患者PDE4D基因SNP83 C等位基因频率明显高于对照组,是AIS的危险因素(OR=1.718,95%CI:1.120～2.633;P=0.012);CC+CT基因型亦明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),(OR=1.875,95%CI=1.137～3.092);调整糖尿病、HDL-C等危险因素后,差异仍存在(OR=2.023,95%CI:1.207～3.391)。PDE4D基因SNP32位点在两组比较无统计学意义(P>0.05)。结论对于中国汉族人群,PDE4D基因SNP83是AIS的危险因素,而SNP32与AIS无关联。     

Researches on DLA-DRB1 genotyping by PCR-RFLP I. A study of serology and cellularly defined DLA haplotypes and their segregation

Summary The polymerase chain reaction based restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) method was used to study DLA class II gene in dogs. Genomic DNA from 11 DLA homozygous reference dogs representing 8 different haplotypes and 2 families with a total of 16 animals were amplified by the oligonucleotide primer pair (HLA-DRB-AMP-A/B) cross-hybriding HLA-DRB specific and fit for the amplification of DLA-DRB1 gene. The corresponding amplified DNA products were 235 base pairs^[1]. Amplified DNA was digested by 32 different restriction endonucleases, which could recognize allelic variations within DLA-DRB. After digesting only with Hae III, Hha I, Hinf I, Rsa I and Sau 96 I high polymorphism was revealed respectively and 9 distinct RFLP pattern were shown, which could be correlate to the DLA haplotypes studied. The 8 cellular established DLA-D specificities present in the reference panel were defined unequivocally by PCR-RFLP and correlated with DLADw5 and Dw6 two subtypes. The segregation pattern of four different DLA-DRB types could be demonstrated in two families. Based on these data we conclude that PCRRFLP typing utilizing the above mentioned primer pair and endonucleases is a valuable tool to define DLA class II types in the dog.     

Gq蛋白竟争性抑制肽GCIP-27质粒载体的构建及表达

目的 化学合成寡核苷酸片段克隆入pIVEX2.3质粒中,构建GCIP-27的原核表达载体并进行原核表达.方法 化学合成GCIP-27的全基因序列,定向克隆到pIVEX2.3质粒中构建含有T7启动子的pIVEX2.3-GCIP27原核表达载体并酶切及测序鉴定;pIVEX2.3-GCIP27质粒转染E coli BL21(DE3)pLysE细菌,用IPTG诱导GCIP-27多肽的表达.结果 成功构建了pIVEX2.3-GCIP27表达质粒,经测序鉴定结果与设计的完全相符;成功用BL21细菌表达了GCIP-27多肽,GCIP-27占细菌总蛋白的4.96%.结论 本实验构建并表达了GCIP-27的重组质粒,为GCIP-27的大量原核表达奠定了基础.