丁酸盐诱导人类珠蛋白基因表达的实验研究

目的 :研究丁酸盐对人类珠蛋白基因表达的影响。方法 :选用K5 6 2细胞为体外模型 ,采用联苯胺染色和RT -PCR技术 ,比较丁酸盐诱导前后联苯胺染色阳性率和 7种珠蛋白基因mRNA改变。结果 :丁酸盐诱导后联苯胺染色阳性细胞率 (BZ % )增加 3～ 6倍 ;Gγ -mRNA增加 2 .2 6± 0 .2 2倍 (P <0 .0 5 ) ,α、ζ、ε、δ、Aγ -mRNA均有增加但增加不显著 (P >0 .0 5 ) ;诱导前后K5 6 2细胞均未检测到 β -RNA。结论 :丁酸盐可诱导珠蛋白基因表达并选择性地刺激γ基因转录增加 ,尤其是Gγ ;丁酸盐具有与阳性对照羟基脲相似的诱导珠蛋白基因表达的作用     

黄芪的含药血清诱导K562细胞表达^Gγ-mRNA和合成HbF

目的研究黄芪对K562细胞的^Gγ-珠蛋白基因表达的作用。方法以K562细胞为体外模型，用联苯胺染色方法来确定黄芪的含药血清诱导K562细胞向红系分化的作用；用RT—PCR方法研究黄芪的含药血清诱导K562细胞^Gγ-珠蛋白mRNA的表达；用Western Blot方法研究黄芪的含药血清诱导K562细胞HbF的合成。结果黄芪的含药血清作用于K562细胞5d后联苯胺染色阳性率达19．8％；同时伴有^Gγ-珠蛋白mRNA的表达的增加（最高可达3．6倍）和HbF的合成的增加，与丁酸钠组比较，黄芪组诱导K562细胞^Gγ-珠蛋白基因mRNA的表达可以持续3～5d，而丁酸钠组只有1d。结论黄芪有望成为一种有效的γ蛋白基因诱导剂。     

N-ras基因在K562细胞中的表达研究

目的探讨N-ras基因突变及表达水平与慢性粒细胞白血病发病的关系。方法以慢粒细胞株K562细胞为研究对象，采用RT-PCR和直接测序的方法对N-ras的表达水平及突变进行检测。结果RT-PCR结果示N-ras基因在K562细胞中表达升高，直接测序结果表明N-ras基因在K562细胞中不存在突变。结论N-ras基因在K562细胞中高表达，而其高表达机制与突变无关。     

新的白血病相关基因LRP15真核表达载体构建及在K562细胞中的表达

 目的构建LRP15基因开放阅读框架(ORF)序列的真核表达载体,并观察其在K562细胞中的表达情况.方法采用RT-PCR方法自1例白血病患者中克隆LRP15cDNA片段,将目的基因LRP15克隆入pGEM-T载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定.将鉴定过的DNA片段插入真核质粒pcDNA3.1(+),构建真核表达载体pcDNA-LRP15.脂质体介导法将其转染K562细胞,72 h以RT-PCR方法检测转染细胞中LRP15基因的表达情况.结果酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有人LRP15基因ORF序列;转染实验表明LR15基因能在K562细胞中表达.结论成功构建LRP15基因真核表达载体,并在K562细胞中获得表达,为进一步研究LRP15基因的功能奠定了基础.     

实时定量PCR检测GDNF基因转染大鼠BMSCs后的转录水平

目的 了解外源性胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因在大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)中的转录水平.方法 体外分离培养大鼠BMSCs,将其随机分为GDNF基因转染组、空质粒转染组和未转染组3组;GDNF基因转染组和空质粒转染组分别用GDNF基因和空质粒重组腺病毒感染BMSCs,并按感染后培养时间的不同(3、6、9和12天)又分为4个亚组.采用实时定量PCR技术检测GDNF基因在BMSCs中的转录水平.结果 空质粒转染组和未转染组无GDNF mRNA的表达,GDNF基因转染组在转染后3～12天的GDNF mRNA相对表达量为0.007 51±0.000 67.结论 腺病毒介导的基因转染技术将GDNF基因转染至骨髓间充质干细胞中,有外源性基因GDNF mRNA的表达,这为进一步研究以GDNF基因转染的BMSCs治疗中枢神经系统疾病奠定了基础.     

人类多药耐药基因转录调控研究进展

多药耐药(MDR)是肿瘤化疗失败的主要原因之一，而人类多药耐药基因(hmdrl)及其编码产物P—糖蛋白(P—gp)的超表达，是引起MDR表型的主要原因。研究表明P—gp的超表达主要在转录水平上进行调控。最近的研究主要集中在明显hmdrl启动子中新的未了解区域以及相应的信号传导通路。这些研究为了解MDR的机制提供了新思路。故就hmdrl的调控研究进展做一综述。     

SHIP基因真核表达载体的构建、鉴定及对白血病细胞系K562的抑制作用

目的 构建真核表达质粒pCAC-IRESSHIP-GFP,并观察其在K562细胞中的表达. 方法 将SHIP基因的RT-PCR产物克隆入载体pCAG-IRES-GFP,经酶切、鉴定及测序分析,构建pCAG-IRESSHIP-GFP重组真核表达质粒.实验设置3个组:K562组(未转染)、K562/IRES组(转染宅载体pCAG-IRGA-GFP),K562/SHIP)组(转染重组质粒pCAC-IRES-SHIP-GFP).荧光显微镜和流式术榆测重组质粒的转染效率;Western blotting检测各组SHIP蛋白的表达及Akt磷酸化水平变化;MIT法和流式术分析SHIP基凶转染对细胞增殖的影响. 结果 重组质粒pCAG-IRESSHIP-GFP已成功载人SHIP的全长编码基凶,序列测定的结果与预期设计完全一致.荧光显微镜在K562/SHIP组町见绿色荧光,转染效率为4&2%±6.6%.Westem blotting显示K562/SHIP组有明显的SHIP蛋白表达,且p-Akt-308和p-Akt-473的水平(分别为0.182和0.381)较K562/IRES组(0.361和0.716)和K562组(0.365和0.725)明显下降(P＜0.01).流式术分析显示K562/SHIP组细胞生长减慢,G0/G1期细胞增多、G2/M期细胞减少,增殖指数降低. 结论 成功构建了3 585bp的SHIP基因真核表达质粒pCAG-IRES-SHIP-GFP,并在K562细胞中表达.外源性SHIP基因转染能使K562细胞增殖受抑,原因可能与Akt的磷酸化下调有关.     

应用逆转录病毒载体转染K562细胞株的实验研究

目的:探讨多种细胞因子联合刺激下,逆转录病毒载体对K562细胞的基因转移效率。方法:以PA317-GCGPXSN细胞制备病毒上清,NIH3T3细胞测定病毒滴度后,取经过SCF、IL-3、IL-6预培养刺激后的K562细胞,实施基因转移,流式细胞仪及PCR方法测定基因转移效率。结果:①病毒滴度为1.9×105CFU/m l;②对照组K562细胞测定的荧光强度数值为0.56%,实验组为77.16%,两者差异有统计学意义(P<0.01)。PCR方法扩增到了NeoR基因的特异性片断。结论:细胞因子预刺激后实施基因转移,可有效地将外源基因转移进入K562细胞基因组中。     

体外筛选抑制K562细胞生长的放线菌代谢物

目的：建立一种适合较大量微生物代谢物抑制K562细胞生长的体外筛选方法，筛选对K562细胞具有抑制作用，而对正常细胞Vero无明显抑制作用的土壤放线菌提取物。方法：放线菌培养液加入乙醇后，置于96孔板中。经过减压除去溶剂后，用MTT法检测各样品对K562及Vero细胞的抑制作用。结果与结论：从446种土壤放线菌提取物中筛选获得5种提取物对K562细胞具有明显的抑制作用，而对Vero细胞生长抑制作用较弱。     

黄芪不同提取物对K562细胞向红系分化的诱导作用研究

目的探讨黄芪不同提取物对K562细胞向红系分化的影响。方法用超声醇提水提法从黄芪根中获取富含黄芪总苷(AST)的醇溶部分和富含黄芪多糖(APS)的水溶部分并分别作用于K562细胞,联苯胺染色法观察K562细胞向红系分化的情况,MTT法测定细胞活性。以丁酸钠(BA)处理的K562细胞作为阳性对照。结果以不同浓度(1、2、4、8mg/ml)APS作用于K562细胞后显示其有诱导后者向红系分化的作用,以4mg/ml为最适浓度,而AST诱导作用不明显。4mg/ml APS、AST及0.5mmol/L BA作用后K562细胞的联苯胺染色阳性率(BZ%)峰值分别为13.2%、2.9%及17.5%。以4mg/ml APS作用于K562细胞24、48、72h后,其BZ%显著低于同时点BA组(P<0.01),但72、96h的联苯胺染色阳性细胞总数明显高于BA组(P<0.01)。MTT测定结果显示,APS、AST对K562细胞的生长无明显抑制作用,而BA对细胞生长有明显抑制作用(P<0.01)。结论黄芪可诱导K562细胞向红系分化,其有效成分在富含多糖的水溶部分(APS),以4mg/ml浓度的诱导作用最强。黄芪提取物对K562细胞的生长无明显抑制作用。     

89Sr诱发K562癌细胞凋亡及其相关基因表达研究

目的 探讨^89Sr诱发K562癌细胞凋亡放射毒理效应的分子机理。方法 采用分子病理和定量病理技术研究^89Sr内照射诱导的K562癌细胞凋亡，剂量效应关系和重要相关基因bcl-和bax在其中的表达。结果 K562细胞经^89Sr内照射6和24h，提取DNA，琼脂糖凝胶电泳图谱上出现典型的“阶梯状”区带，伴有“拖尾”，而对照组未见“阶梯状”区带，荧光双标记流式细胞仪法定量检测，^89Sr内照射6，9，12，24和48h后，K562细胞凋亡率和坏死率均较对照组有明显升高（P＜0．01），随着^89Sr内照射时间的延长，累积剂量的提高，均无显著变化（P＞0．05），免疫组织化学染色显示，对照组K562细胞中bcl-2和bax蛋白均有表达，bcl-2蛋白表达阳性细胞率82．8％，bax为44.4%,bcl-2/bax比值1.86;^89Sr内照射24h后的K562细胞中，bcl-2蛋白表达阳性细胞率31.4%,bax为38.2%,bcl-2/bax比值0.82，与对照组相比，差异显著（P＜0．05）；RT－PCR显示bcl-2 mRNA在对照组K56细胞中高表达；^89Sr内照射12h后已有明显的下调，24h后则非常显著。结论 ^89Sr内照射K562细胞后，细胞凋亡与细胞坏死并存，且^89Sr诱导K5622细胞的凋亡可能是通过bcl-2 mRNA及其蛋白表达降低，bcl-2/bax比值下降而调控的。     

长春新碱载体红细胞的体外抗肿瘤作用

目的探讨长春新碱(VCR)载体红细胞的体外抗肿瘤活性。方法采用改良低渗预膨胀技术制备VCR载体红细胞,并将VCR载体红细胞与人红白血病细胞株K562共培养,MTT法检测K562细胞增殖,PI/Rhodamin123染色,流式细胞分析K562细胞周期和细胞凋亡情况,Hoechest33258细胞核染色观察凋亡K562细胞核形态。结果VCR载体红细胞可明显抑制K562细胞增殖并促其凋亡,且该作用随剂量增高而加强。与载体红细胞混合培养24h后,S+G2/M期K562细胞明显增多,G0/G1期细胞减少,与VCR原药作用一致,与未载药红细胞的作用相比差异显著(P<0.01)。结论经红细胞载药并释放出来的VCR在体外具有与原药相同的抗肿瘤活性。     

The role of Beclin 1 in SDT-induced apoptosis and autophagy in human leukemia cells

Abstract

Purpose: To prove the occurrence of autophagy after treatment by protoporphyrin IX (PpIX)-mediated sonodynamic therapy (SDT) of human chronic myelogenous leukemia K562 cells as well as its relationship with apoptosis.

Materials and methods: The 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenylter-trazolium bromide tetrazolium (MTT) assay was adopted to examine cytotoxicity of different treatments. Nuclear morphology changes were observed under a fluorescence microscopy with 4?-6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) staining. Western blotting was used to analyze the expression of caspase-3, Beclin 1 (BECN 1) and the conversion of LC3- phosphatidylethanolamine conjugate/a cytosolic form of LC3 (LC3 II/I). Fluorescence microscope was used to identify the formation of autophagic vacuoles (AVO) during autophagy.

Results: Under optimal conditions, SDT was shown to induce autophagy in K562 cells, which caused the up-regulation of Beclin-1 and the formation of AVO. In addition, pre-treatment of cancer cells with Beclin 1-targeted short hairpin RNA (Beclin 1 shRNA) was shown to reduce the level of LC3-II accumulation and staining with punctate spots of monodansylcadaverine (MDC) staining. Besides, the cytotoxic effect of SDT was significantly increased by Beclin 1 shRNA. Furthermore, studies showed a marked effect on the apoptosis of cells by Beclin 1 shRNA to sonodamage with increased DAPI staining and caspase-3 cleavage.

Conclusions: These results demonstrated that SDT significantly induced autophagy of K562 cells, probably to protect the K562 cells from sonodamage.     

诱导K562细胞向红系分化的中药血清药理学方法探讨

目的对K562细胞向红系分化的中药血清药理学方法进行探讨。方法以K562细胞为体外模型,采用联苯胺定性技术检测细胞内血红蛋白,比较不同条件下的含药血清诱导K562细胞前后的阳性率;测量波长为414的A值。结果10％的含药血清培养诱导K562细胞向红系分化的作用最强;灭活血清对：K562细胞向红系分化的诱导作用强于未灭活血清;大鼠qd连续7d和bid连续3d,2种方法所得血清均以10％的浓度培养K562细胞,二者诱导其向红系分化的作用无明显差异;临床等效剂量ig所得血清比2倍、4倍剂量要好。结论含药血清的制备和含药血清在体外的合理应用对实验结果有很大的影响。     

辐射后造血细胞表面IL-11受体表达的变化

目的 探讨体外照射后造血细胞表面IL-11受体(IL-11R)蛋白和基因表达水平的变化,为临床更合理有效地应用rhIL-11治疗急性放射病提供理论和实验依据。方法 采用流式细胞术及RT-PCR法检测了不同照射剂量和照射后不同时间K562细胞表面IL-11R蛋白和基因表达水平的变化。结果 随着照射剂量的升高,K562细胞表面IL-11Rα蛋白的表达量逐渐升高,其中5Gy和10Gy照射组照射后24h IL-11Rα蛋白表达水平较正常显著增高。结论 照射后24h IL-llRα蛋白及基因表达水平升高可能是机体自我保护的一种适应性反应,为早期应用IL-11提供了物质基础。