兔胚胎关节软骨细胞体外培养的研究

目的 探讨兔胚胎软骨细胞体外培养的生物学特性。方法 对孕4周兔胚胎关节软骨用酶消化法分离培养细胞。观察细胞存活率、贴壁率、生长曲线和组织形态学改变。结果 兔胚胎软骨细胞可从胚胎软骨组织中消化分离出来，经鉴定具有软骨细胞的特性。原代兔胚软骨细胞存活率达97％以上，细胞贴壁率达80％以上，从原代到第4代都有高增殖力，到第8代时增殖力降低。到第12代时几乎丧失细胞增殖。结论 体外培养的胚胎软骨细胞前4代适合于作修复关节软骨缺损的组织工程细胞。     

人胎关节软骨细胞体外培养的生物学特性

目的 研究软骨组织工程中传代软骨细胞与原代的差异。方法 用５个月人胎关节软骨分离培养细胞,观察细胞存活率、贴壁率、生长曲线和组织形态学的改变。结果 ⑴软骨块在４℃下,３ｄ内细胞存活率可达９３．４％～９７．６％。⑵原代细胞为圆形或三角形;第４代有一半转变成梭形,到第６代全部变为长梭形。⑶传代细胞贴壁时间（２～３ｈ）短于原代（４～７ｈ）。玻璃瓶内贴壁率传代细胞为７８．７％～８５．５％,原代８．８％。⑷     

IGF1对兔关节软骨细胞增殖的影响及其形态学观察

目的了解胰岛素样生长因子1(IGF1)对体外生长的兔关节软骨细胞增殖以及细胞超微结构的影响.方法应用兔关节软骨细胞体外单层培养,对照组培养液为含10%小牛血清DMEM,实验组在培养液DMEM中加入IGFl使其终浓度为100μg*L-1,作用细胞1周, 得出细胞生长曲线,并分别测得两组DNA含量.同时观察IGFl作用后,软骨细胞超微结构的变化.结果结果显示IGFl能明显促进培养软骨细胞增殖.实验组DNA含量,与对照组相比,有统计学意义 (P<0.01).在电镜下,细胞主要表现为增殖性改变,说明细胞代谢活跃.结论IGFl可刺激软骨细胞增殖,细胞超微结构表现代谢活跃状态.     

IGF-Ⅰ对培养兔关节软骨细胞作用的实验研究

目的 了解胰岛素样生长因子I（ICF－I）对培养关节软骨细胞增残及代谢的影响。方法 体外单层培养兔关节软骨细胞,实验组以10,100,200ng/mlICF-I作用细胞2,4,6天,对照组不加IGF－I作用培养细胞。检测细胞DNA及基质中糖醛酸含量,用流式细胞仪分析在100ng/mlIGF-I作用下细胞周期亚时相。结果 IGF－I在10－100mg/ml浓度范围内,对培养软骨细胞增残和代谢有促进作用,以100ng/ml浓度作用效果最佳,细胞周期分析,实验组DNA合成前期（G1期）较对照组缩短。结论 IGF－I促进软骨细胞的增殖与代谢,且通过缩短细胞G1期而缩短的细胞周期。     

软骨生长因子对兔软骨细胞作用的实验研究

目的：探讨软骨生长因子（CDGF）对体外培养兔软骨细胞的作用。研究了CDGF,胰岛素样生长因子－I（IGF－I）及软骨细胞生长代谢三者之间的关系。方法：体外单层培养兔软骨细胞,取生长良好的第二代细胞实验,分别或共同加入不同浓度CDGF和IGF－I,利用氯胺T法和MTTI地分别观察比较细胞培养液中羟脯氨酸与能量的合成及细胞的增殖情况,结果：CDGF与IGF－I均能剂量依赖性的促进细胞外基质中羟脯氨酸的合成以及细胞的增殖与能量合成;对两种作用的最佳刺激浓度,CDGF分别为16ng/ml和32ng/ml,IGF-I为30ng/ml;二者联合应用能明显增强对软骨细胞作用。结论：CDGF可以刺激软骨细胞的增殖与胶原合成,并与IGF－I有协同作用。     

胰岛素样生长因子对体外培养豚鼠肋软骨细胞的影响

目的：了解胰岛素样生长因子(insulin-1ike growthfactor-1，IGF-1)对体外培养豚鼠肋软骨细胞分裂增殖及功能代谢的影响。方法：体外单层培养豚鼠肋软骨细胞，对照组培养液为无血流清DMEM，实验组在培养液DMEM中加入IGF-1使其终浓度分别为10ng／ml、50ng／ml、100ng／ml，作用6天后，检测细胞DNA含量和培养液中糖醛酸的含量。结果：IGF-1在10～100ng／ml浓度范围能明显增加培养软骨细胞的DNA及糖醛酸的含量，且以50ng／ml作用效果最明显，与对照组相比，有统计擘意义(P＜0．01)。结论：IGF-1对体外培养肋软骨细胞有刺激，并以剂量依赖性方式影响细胞的增殖及功能代谢。     

血清对体外培养成年人关节软骨细胞生长的影响

目的观察不同血清及血清浓度对成人关节软骨的细胞（AHAC）生长的影响，为软骨细胞移植的临床应用提供血清选择。方法用无血清、胎牛血清（FBS）和人AB血清及不同浓度血清在加或不加生长因子条件下培养成年人关节软骨细胞，比较细胞增殖和生长情况。结果对于AHAC，人AB血清培养优于FBS；合适的人AB血为10％；合适的FBS浓度为20％；无血清培养细胞增殖非常缓慢；不加因子用人AB血清培养细胞梭形化明显，加用生长因子后与使用FBS在形态上一致。结论10％浓度的人血清是AHAC体外培养的合适血清和浓度选择。     

兔关节软骨细胞体外培养的生物学特性及中药黄芪对其的影响

目的:研究兔关节软骨细胞与海藻酸钠复合体外培养的生物学特性及中药黄芪对其的影响。方法:取5个月龄兔膝关节软骨分离成软骨细胞悬液分组培养,A组只用培养液培养,B组用含2%黄芪注射液的培养液培养。分别于第2、4、6、8周进行细胞组织形态学、糖胺多糖(GAG)含量的测定及Ⅱ型胶原蛋白表达的观察。结果:①两组于第4～6周体外培养的软骨细胞合成糖胺多糖的能力及Ⅱ型胶原蛋白的表达均达高峰,6周后逐渐下降;②B组软骨细胞合成糖胺多糖及Ⅱ型胶原蛋白的能力均比同期A组增强,具有显著统计学意义(P<0.05)。结论:软骨细胞与海藻酸钠复合培养,可保持软骨细胞的表型,用其构建组织工程化软骨是可行的。黄芪有促进软骨细胞合成Ⅱ型胶原和GAG的作用。     

软骨细胞形态对其缝隙连接的影响

目的：探讨体外培养状态下新生兔软骨细胞的缝隙连接（gap junction)与软骨细胞形态、表型的关系。方法：1．向形成集落的兔膝关节软骨细胞（第5代）培养基内加入荧光染料CFDA－AM，经激光共聚焦显微镜测量不同形态的单个软骨细胞内的荧光强度。2．以激光淬灭软骨细胞内的荧光后定时测量其荧光的恢复曲线。3．将因股骨颈骨折而行人工关节置换的人股骨头关节软骨切成20um薄片，同样加入荧光染料后测定淬灭前后荧光强度。结果：1．各种形态的扁平状软骨细胞摄入CFDA－AM后平均荧光强度差异很大（范围1－274，n=30)，平均值明显低于单个球形软骨细胞（平均2057，范围340－3538，n＝30）。2．只有集落中央的球形软骨细胞才有逐渐的荧光恢复。3．人股骨头关节软骨陷窝内软骨细胞内的荧光经激光淬灭后可以恢复。结论：1．软骨细胞的形态影响其荧光染料的摄入量。2．缝隙连接只出现在球形软骨细胞之间，它与软骨细胞的特有表型同时出现。     

人负重关节软骨细胞的体外分离与培养

目的　研究人负重关节软骨细胞的分离培养技术。方法　对 10例手术切除的负重关节软骨进行0 2 %Ⅱ型胶原酶分离、10 %DMEM中培养 ,观察软骨细胞获得率、贴壁率、增殖状况及形态学改变。结果　① 0 2 %Ⅱ型胶原酶消化尽 2 0 0～ 70 0mg软骨标本需 4～ 14h ,细胞获得率 (1 82± 0 5 7)× 10 6/g ,存活率(79 4± 9 9) %。②细胞可传 6～ 12代 ,前 4代培养时间平均 (33± 10 )d ,生长倍数平均 198倍 ,倍增时间(4 13± 1 34)d。③第 3、4代细胞呈多角形、部分梭形 ,8、9代后细胞梭状铺平。结论　 30 0～ 5 0 0mg软骨标本 ,经该方法培养 3～ 4周后可达第 4代 ,细胞数可达 (0 6～ 1 0 )× 10 8个 ,可满足临床上修复 15～ 2 5cm2软骨缺损的需要。     

Effects of IGF-I,IGF-II,and PDGF on the proliferation of rabbit articular chondrocytes in culture

The effects of insulin-like growth factor (IGF)-I, IGF-II, and platelet-derived growth factor (PDGF) were examined in cultured chondrocytes derived from rabbit joint cartilage. In addition, the expression of IGF-I receptors on the cultured chondrocytes was detected with anti-IGF-I receptor antibody. IGF-I acted as a growth stimulant, but IGF-II had no effect on cell growth. Increasing the dose of IGF-I beyond 50 ng/ml resulted in decreased growth stimulation. The expression of IGF-I receptors was detected continuously during the culture period. The results also showed that PDGF acted as a growth inhibitor, in contrast to the results of other studies. Further studies are necessary to clarify the precise mechanism of the action of PDGF and the role played by different homo- or heterodimers of PDGF in the proliferation of articular chondrocytes.     

成人表皮干细胞和汗腺细胞的体外分离和培养

背景：人表皮干细胞和汗腺细胞的分离培养及鉴定,为探讨人表皮干细胞再生汗腺的可行性打下基础。目的：探讨体外分离培养人表皮干细胞及汗腺细胞的有效方法。方法：采集不同年龄段的泌尿外科患者术后包皮组织,充分清洗消毒后去除皮下组织,将其修剪成0.5cm×0.5cm的皮片,用Ⅳ型胶原纯化、富集成人表皮干细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态：使用免疫荧光染色对成人表皮干细胞表型进行分析;CCK-8检测细胞的增殖曲线;采用胶原酶消化法从人全层无损伤皮肤中分离提取汗腺细胞,并进行扩增和鉴定。结果：倒置相差显微镜下见分离培养的成人表皮干细胞呈卵圆形、细胞之间紧密相连,呈铺路石状,免疫荧光染色显示细胞表达CK19、β1整合素。倒置相差显微镜下见汗腺细胞呈扁平多角形,表达汗腺细胞标志细胞CK7、18、19及CEA。结论：本实验结果说明胶原酶消化法分离培养成人表皮干细胞及汗腺样细胞是可行的。     

Green fluorescent protein as marker in chondrocytes overexpressing human insulin-like growth factor-l for repair of articular cartilage defects in rabbits

Objective： To label the primary articular chondrocytes overexpressing human insulin-like growth factor （ IdGF-1 ） with green fluorescent protein （GFP） for repair of articular cartilage defects in rabbits. Methods： GFP cDNA was inserted into PeDNA3.1- hlGF-1 to label the expression vector. The recombinnnt vector, pcGI, a mammalian expression vector with multiple cloning sites under two respective cytomegalovirus promoters/enhancers, was transfected into the primary articular chondrocytes with the help of lipofectamine. After the positive cell clones were selected by G418, G418- resistant chondrocytes were cultured in medium for 4 weeks. The stable expression of hlGF-1 in the articular chondrocytes was determined by in situ hybridization and immunocytochemical analysis and the GFP was confirmed under a fluorescence microscope. Methyl thiazolyl tetrazolium （MTT） and flow cytometer methods were employed to determine the effect of transfection on proliferation of chondrocytes. Gray value was used to analyze quantitatively the expression of type lI collagen. Results： The expression of hlGF-1 and GFP was confirmed in transfected chondrocytes by in situ hybridization, immunocytochemical analysis and fluorescence microscope observation. Green articular chondrocytes overexpressing hlGF-1 could expand and maintain their chondrogenic phenotypes for more than 4 weeks. After the transfectton of IGF-1, the proliferation of chondrocytes was enhanced and the chondrocytes could effectively maintain the expression of type lI collagen. Conclusions： The hlGF-1 eukaryotic expression vector containing GFP marker gene has been successfully constructed. GFP, which can be visualized in real time and in situ, is stably expressed in articular chondrocytes overexpressing hlGF-1. The labeled articular chondrocytes overexpressing hlGF-1 can be applied in cell-mediated gene therapy as well as for other biomedical purposes of transgenic chondrocytes.     

酸性成纤维细胞生长因子及表皮生长因子对兔韧带细胞增殖的影响

目的：观察酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)和表皮生长因子(EGF)对内侧副韧带(MCL)和前十字韧带(ACL)细胞增殖行为的影响。方法：培养10周龄新西兰白兔内侧副韧带和前十字韧带细胞，在培养液中分别加入aFGF和EGF，以XTT方法测定细胞的增殖行为。结果：aFGF在1ng／ml时即对两种细胞具有显著的促进增殖作用，其浓度达50ng／ml时，对MCL细胞的促进作用最大，达100ng／ml时对ACL细胞的促进作用最大。EGF在0．78ng／ml时即对MCL细胞有显著的促增殖作用，在1．56ng／ml时始对ACL细胞有显著的促增殖作用，其浓度达3．125ng／ml时对2种细胞的促进作用最大。aFGF和EGF在超过其最佳浓度后，随浓度升高促进作用均下降。结论：aFGF和EGF可以促进韧带成纤维细胞增殖。     

EGF对TPN大鼠肠粘膜细胞EGFR表达的影响

利用大鼠全肠外营养(TPN)模型,探讨表皮生长因子(EGF)对TPN支持后肠粘膜细胞表皮生长因子受体(EGFR)表达的影响。方法:48只SD大鼠随机分为对照组、常规TPN组及TPN-EGF组。实验持续14天,采用免疫组化结合计算机图象分析的方法,分别测定颌下腺内EGF含量以及小肠粘膜细胞中EGF和EGPR含量。结果:TPN及TPN-EGF组大鼠颌下腺内EGF含量均明显下降(P<0.01);TPN组小肠粘膜细胞中EGF、和EGFR含量显著下降(P<0.01),而TPN-EGF组则未减少(P<0.05)。结论:内源性EGF分泌减少是TPN肠粘膜屏障损伤的重要原因之一;EGF具有促进肠粘膜细胞EGFR表达的作用。     

表皮生长因子刺激对脂肪干细胞促血管生成作用的影响

目的 探讨表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）对脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）旁分泌促血管生成因子及促进人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）小管形成的影响.方法 体外原代培养ADSCs,流式细胞术分析细胞表面标志物表达,酶联免疫吸附法（ELISA）检测不同浓度EGF刺激前后ADSCs-CM中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、肝细胞生长因子（hepatoeyte growth factor,HGF）、间质源性因子-1 （stromal-cell derived factor-1,SDF-1）含量变化;HUVEC小管形成实验检测EGF预处理对ADSCs促进HUVEC形成管样毛细血管的影响.结果 利用脂肪抽吸液成功培养出ADSCs,ADSCs具有其特异的表面标记物表达;ADSCs可分泌各种促血管生成因子,且EGF刺激可增加其分泌量;ADSCs可促进共培养的HUVEC形成管样毛细血管,用EGF预处理ADSCs后该作用显著提高.结论 体外环境下ADSCs可分泌多种促血管生成因子,并可促进共培养的HUVEC形成管样毛细血管;EGF刺激可增强该作用,15 mg/L EGF即可达到最佳效果.     

Green fluorescent protein as marker in chondrocytes overexpressing human insulin-like growth factor-1 for repair of articular cartilage defects in rabbits

Objective:To label the primary articular chondrocytes overexpressing human insulin-like growth factor (hIGF-1) with green fluorescent protein (GFP) for repair of articular cartilage defects in rabbits. Methods: GFP cDNA was inserted into pcDNA3. 1-hIGF-1 to label the expression vector. The recombinant vector, pcGI, a mammalian expression vector with multiple cloning sites under two respective cytomegalovirus promoters/enhancers, was transfected into the primary articular chondrocytes with the help of lipofectamine. After the positive cell clones were selected by G418, G418-resistant chondrocytes were cultured in medium for 4 weeks. The stable expression of hIGF-1 in the articular chondrocytes was determined by in situ hybridization and immunocytochemical analysis and the GFP was confirmed under a fluorescence microscope. Methyl thiazolyl tetrazolium ( MTT) and flow cytometer methods were employed to determine the effect of transfection on proliferation of chondrocytes. Gray value was used to analyze quantitatively the expression of type II collagen. Results: The expression of hIGF-1 and GFP was confirmed in transfected chondrocytes by in situ hybridization, immunocytochemical analysis and fluorescence microscope observation. Green articular chondrocytes overexpressing hIGF-1 could expand and maintain their chondrogenic phenotypes for more than 4 weeks. After the transfection of IGF-1, the proliferation of chondrocytes was enhanced and the chondrocytes could effectively maintain the expression of typeⅡcollagen. Conclusions: The hIGF-1 eukaryotic expression vector containing GFP marker gene has been successfully constructed. GFP, which can be visualized in real time and in situ, is stably expressed in articular chondrocytes overexpressing hIGF-1. The labeled articular chondrocytes overexpressing hIGF-1 can be applied in cell-mediated gene therapy as well as for other biomedical purposes of transgenic chondrocytes.     

部分创面外用抗菌药物与成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子、重组人生长激素对成纤维细胞生物学特性影响的实验研究

目的观察部分创面外用抗菌药物与成纤维细胞生长因子(FGF)2、表皮生长因子 (EGF)、重组人生长激素(rhGH)对成纤维细胞生物学特性的影响。方法体外培养成纤维细胞, 按所加药物不同分为对照组(常规培养)、丁胺卡那霉素(0．021、0．210、2．100 mg/L)组、庆大霉素(5、 50、500 mg/L)组、氯霉素(0．01、0．10、1．00 mg/L)组、磺胺米隆(5、10 g/L)组、FGF2(2 400 U/ml)组、 EGF(2 000 U/ml)组及rhGH(0．016、0．160、1．600 g/L)组。用噻唑蓝(MTT)法测定各组成纤维细胞增殖活性[吸光度(A)值],用流式细胞仪检测细胞周期,并于显微镜下观察细胞形态的变化。结果 (1)MTT法检测:与对照组A值0．455 3±0．021 7比较,各种剂量丁胺卡那霉素组、庆大霉素组、氯霉素组、磺胺米隆组成纤维细胞A值均明显降低(P<0．05或0．01),其中磺胺米隆(5、10 g/L)组降低最明显,分别为0．101 3±0．001 1、0．095 0±0．004 1(P<0．01)。FGF2组及0．016 g/L rhGH 组细胞A值明显高于对照组(P<0．05),而EGF组及0.160、1．600 g/L rhGH组A值与对照组接近 (P>0．05)。(2)细胞周期检测:对照组细胞增殖指数(PI)为(9．63±0．45)％,与之比较,0．210 mg/L丁胺卡那霉素组细胞PI值无明显变化(P>0．05),FGF2组、EGF组及0．016 g/L rhGH组PI值均明显升高,分别为(46．76±2．33)％、(42．30±1．41)％、(13．29±0．47)％(P<0．05或0．01)。 (3)形态学观察:对照组、EGF组及0．160、1．600 g/L rhGH组成纤维细胞数目较多,呈长条形或梭形, 轮廓不清,透明度高;丁胺卡那霉素组、庆大霉素组、氯霉素组、磺胺米隆组细胞数目较少,形态不规则,轮廓清晰,透明度低,细胞内多有颗粒样物质及空泡;FGF2组、0．016 g/L rhGH组细胞分布均匀、密集,呈长条形或梭形,核分裂相多见,轮廓不清,透明度高。结论不同创面外用药物对成纤维细胞生物学特性的影响各异,在创面修复过程中应选择合适的创面外用药物,以促进愈合并抑制瘢痕增生。     

兔脂肪干细胞体外成骨诱导培养及成骨活性鉴定的实验研究

目的体外分离培养兔脂肪干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）,在成骨诱导条件下鉴定其成骨活性。方法取4月龄新西兰大白兔腹股沟区脂肪,Ⅰ型胶原酶消化,分离、培养及传代原细胞,将第3代ADSCs消化后,加入成骨培养液中诱导分化,分别行碱性磷酸酶染色、茜素红染色、VonKoss（a钙结节）染色,以鉴定分化结果。结果体外分离培养的细胞增殖活跃,成骨诱导后碱性磷酸酶染色、茜素红染色及Von Kossa染色均呈阳性表达。结论脂肪干细胞具有成骨分化能力,是一种理想的骨组织工程种子细胞。