腺病毒载体介导的LacZ基因在神经前体细胞的转染和表达

为了观察含报告基因 L ac Z的重组 5型腺病毒载体 ( Ad5CMVLac Z)在神经前体细胞转染和表达的量效关系并探讨用该载体构建基因修饰细胞的可能性 ,本研究用不同滴度 ( 1× 10 3～ 1× 10 1 0 PFU/ml)的 Ad5CMVLac Z转染体外培养的 SD胎鼠(胎龄 12 d)海马神经前体细胞 ,用β-半乳糖苷酶 (β-gal)免疫组化反应检测转染效率。结果显示 :当病毒滴度为 1× 10 7时 ,转染率约为 5 0 % ,当滴度增加到 1× 10 1 0时 ,转染率达 10 0 %。Ad5CMVL ac Z在神经前体细胞的转染率具有滴度依赖性的量效关系。表明高滴度的 Ad5CMVLac Z成功地转染了大部分神经前体细胞 ,Lac Z基因也得到充分表达。提示神经前体细胞是该载体转染的适宜靶细胞 ,并有可能通过该载体转导目的基因 ,构建出基因修饰细胞     

MEK5基因siRNA重组腺病毒表达载体的构建及其对MEK5的表达抑制

目的 构建人MEK5基因的小干扰RNA(siRNA)重组腺病毒表达载体,观察其在胃腺癌SGC7901细胞中对MEK5的表达抑制.方法 设计并合成针对人MEK5基因3个不同部位siRNA靶点的模板DNA序列,以MluⅠ及XhoⅠ克隆入pRNAT-H1.1/Adeno穿梭载体中,将得到的重组穿梭质粒用PmeⅠ线性化后在大肠...     

TR基因重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的 :构建含人硫氧还蛋白还原酶 (TR)基因的重组腺病毒载体 ,探讨TR的抗氧化功能与神经退行性疾病的相关性。方法 :从重组质粒pGEM TR上用内切酶切下编码 5 0 0个氨基酸的全长TRcDNA片段 ,并连接穿梭质粒pShuttle,再双酶切pShuttle TR。将带有CMV启动子的目的片段 ,插入E1、E3缺失的Adeno X病毒DNA中 ,以Adeno TRDNA通过脂质体转染HEK2 93细胞 ,获得重组腺病毒Adeno TR进行PCR鉴定及病毒滴度测定。用重组腺病毒感染CV1细胞 ,通过免疫荧光染色与Westernblot分别检测重组腺病毒感染的细胞上和裂解液中TR蛋白的表达。结果 :重组腺病毒Adeno TR的病毒滴度为 4 .4× 10 11pfu/L。PCR、荧光显微镜证实 ,以及Westernbolt分析 ,在相对分子质量 (Mr)约 5 5 0 0 0处均出现特异性条带。结论 :成功地构建了重组腺病毒载体 ,并能介导外源基因TR表达 ,为进一步研究TR的功能及其与疾病的相关性奠定了基础。     

带有CMV,CEA启动子的腺病毒载体介导TK基因在肿瘤细胞中的表达特性

ＴＫ基因－ＧＣＶ系统是最有希望在临床上用于肿瘤基因治疗的方法之一。为了提高基因靶向表达的效率,使之可以应用体内实验,我们构建重组腺病毒ＡｄＣＭＶＴＫ和带有ＣＭＶ、ＣＥＡ两个启动子的ＡｄＣＭＶＣＥＡＴＫ,在五种癌细胞中进行了体外实验。发现腺病毒介导的ＴＫ基因赋予癌细胞ＧＣＶ敏感性比对照组高２￣３个数理级,并使感染病毒和未感染病毒细胞比例为１：１０时仍产生较强的“旁观效应”。实验表明ＰＧ肺癌,ＣＡＥ结     

腺病毒载体介导gfp基因在树突细胞的转导及其影响因素的分析

目的：研究腺病毒载体介导外源基因在人树突细胞转染的有效方法。方法：绿色荧光蛋白（gfp）报告基因重组腺病毒的构建采用直接连接法。人树突细胞的制备通过分离人外周血单核细胞，然后在体外经过诱导过程再生。结果：经腺病毒介导实现了gfp基因在树突细胞的转导和表达。病毒滴度对转导效率影响较大，只有使用高滴度（MOI〉100）的重组腺病毒才能获得较高的转导效率（40％以上）；脂质体和多聚赖氨酸可以明显提高转导效率（提高50％左右）。转导效率最高可达65％左右。结论：由腺病毒介导进行树突细胞的转基因需要较高的病毒滴度；脂质体和多聚赖氨酸可以提高基因的转导效率。     

稳定表达lacZ基因的乳腺癌细胞系的建立

细菌ｌａｃＺ基因编码β半乳糖苷酶（βｇａｌ）。此酶可将显色物质５溴４氯３吲哚β半乳糖苷（Ｘｇａｌ）水解成靛蓝色产物，故可用Ｘｇａｌ监测ＬａｃＺ基因转导的细胞。在流式细胞仪法（ＦＡＣＳ）分类中转导细胞内半乳糖苷酶可将荧光素双半乳糖吡喃...     

腺病毒载体在皮肤科基因治疗中的应用

腺病毒载体是经去除腺病毒基因组的某些区而获得的，由于其诸多优点，正在成为皮肤科基因治疗中使用最多的载体之一，本文就腺病毒载体的特点及其在皮肤科基因治疗中的应用进展，作一综述。     

EBV即刻早期基因BZLF1腺病毒表达载体的构建及初步应用

目的 构建EBV即刻早期基因BZLF1的重组腺病毒表达载体，探讨其表达诱导潜伏状态EBV进入裂解期增殖的作用。方法采用AdEasy系统构建携带BZLFl的重组腺病毒载体padBz，脂质体法转染人胚肾293细胞，包装产生重组腺病毒vAd-BZ。vAd-BZ感染EBV阳性细胞NEC后，采用RT-PCR、Westemblot、流式细胞术和MTT等方法检测目的基因表达，以及目的基因表达对EBV阳性细胞的影响。结果 PCR、序列测定以及限制性酶切证实BZLFI基因正确插入穿梭质粒，并与病毒骨架质粒pAdEasy-1重组，重组腺病毒表达载体构建成功。经293细胞包装获得具有稳定感染性的重组腺病毒vAd-BZ，感染重组腺病毒的NEC靶细胞可以检测到BZLF1基因的表达，进而诱导EBV从潜伏期进入裂解期。结论 重组腺病毒vAd-BZ可有效感染EBV阳性细胞NEC，诱导潜伏状态的EBV活化．讲而特异件杀伤EBV阳件肿瘤细胞。     

AdMax系统构建腺病毒载体介导SCL基因转染Cajal样间质细胞及其表达

目的 构建含有人干细胞白血病(stem cell leukemia,SCL)基因的重组腺病毒载体,并观察其对豚鼠膀胱Cajal样间质细胞的转染及其介导SCL基因的表达.方法 采用PCR方法从含人SCL基因质粒中扩增SCL基因,连接到腺病毒穿梭质粒的多克隆位点上,构建重组穿梭质粒pDC315-EGFP/SCL,在脂质体介导下与腺病毒辅助大质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染293细胞,包装产生复制缺陷型重组腺病毒pDC315-SCL经HEK293细胞扩增,纯化后测定病毒滴度.通过观察绿色荧光蛋白的表达评估重组腺病毒对Cajal样间质细胞的转染率,RT-PCR法分析转染Cajal样间质细胞后SCL mRNA的表达.结果 PCR结果和Western blot法检测证实pDC315-SCL重组腺病毒载体构建成功,滴度达到1×1010 PFU/ml,对膀胱Cajal样间质细胞的转染率高达98%,RT-PCR法检测转染Cajal样间质细胞后SCL mRNA有表达.结论 成功构建pDC315-SCL重组腺病毒载体对Cajal样间质细胞有很强的转染能力,可介导SCL基因在Cajal样间质细胞的表达.     

IL-1β诱导体外培养的大鼠中脑黑质神经元c-jun表达

应用细胞原位杂交技术，观察经重组小鼠白细胞介素-19（IL-1β）处理后的体外培养的新生1d大鼠中脑黑质神经元c－jun基因的表达．结果显示，培养的黑质细胞多为酪氨酸羟化酶阳性神经元，IL-1β可诱导体外培养的黑质神经元c－junmRNA表达，高水平的表达出现在IL-1β处理后2～4h。说明IL－1β有兴奋黑质神经元的作用，并提示黑质神经元上可能存在IL－1β受体．     

大鼠嗅结节与黑质间的往返投射

将ＨＲＰ或ＷＧＡ－ＨＲＰ注入大白鼠一侧的嗅结节，凡注射涉及嗅结节的多形层者均在注射黑质致密部－Ａ８，Ａ９区出现标记细胞，标记细胞主要位于黑质致密部的内侧，其数量由内向外递减，黑质致密内部的标记细胞以吻侧１／３段最多，中１／３段次之，尾１／３段最少。在ＷＧＡ－ＨＲＰ注射区涉及嗅结节的多形层的各例，除看到黑质致密部中的标记细胞外，还可见密集的成串珠样和点状的标记终末，黑质致密部内的标记终末分布于吻尾方     

重组腺病毒介导GDNF基因在多种细胞的高效转移和表达

用作者等所构建的重组腺病毒AdCMVgdnf直接感染多种细胞系和大鼠中脑原代神经元细胞，多重感染复数为20PFU／ml。采用免疫组织化学染色方法检测GDNF表达，观察所构建的GDNF重组腺病毒在各种细胞中介导GDNF基因转移和基因表达的能力。结果表明在一系列神经细胞或非神经细胞中，GDNF重组腺病毒均可介导GDNF基因的高效转移和表达。提示GDNF重组腺病毒可作为帕金森氏病基因治疗的高效基因转移载体。     

大鼠纹状体,中缝核向苍白球和黑质的分叉投射

分别将DAPI和PI注入大鼠同侧苍白球和黑质后,于尾状核、伏隔核、中缝背核和中央上核内见到较多的DAPI和PI单标细胞混杂存在,其中有少量双标细胞     

MPTP诱导的褐鼠黑质基因差异表达的研究

本研究目的在于获取１－甲基－４－苯基－１,２,３,６－四氢吡啶（ＭＰＴＰ）诱导的褐鼠黑质差异表达的表达序列标签（ＥＳＴ）。通过ＭＰＴＰ腹腔注射建立褐鼠帕金森病模型,利用差别显示反转录ＰＣＲ（ＤＤＲＴ－ ＰＣＲ）技术分析ＭＰＴＰ 处理褐鼠与正常褐鼠黑质基因差异表达的状况,并筛选差异表达基因片段。结果经ＤＤＲＴ－ＰＣＲ 筛选并通过反Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 杂交去除假阳性,最终获得２ 个差异表达基因片段。对其中一个片段进行克隆、测序和同源性比较发现,该片段为一个新的ＥＳＴ 序列,并且与胰岛素原样α肽具有同源性。本研究的结果提示,差异表达序列的分析有可能为研究ＭＰＴＰ诱导的褐鼠黑质变性的分子机理提供线索。     

14-3-3蛋白各亚型在大鼠黑质和PC12细胞中的分布

本实验采用免疫组织化学、免疫荧光组织化学和免疫印迹技术对14-3-3蛋白各亚型在大鼠黑质(SN)和PC12细胞中的分布情况进行了研究。在大鼠黑质内,免疫组化和免疫荧光结果显示14-3-3蛋白的γ、ε、θ、ζ四个亚型呈阳性反应,而β和η亚型未见明显阳性反应;在PC12细胞中,6个亚型均呈免疫荧光阳性反应;在黑质中,Westernblot结果显示14-3-3各亚型蛋白表达的相对水平为ε>γ>ζ>θ;而在PC12细胞中各亚型的表达水平为γ>ε>β>ζ>η>θ。本实验的结果提示ε、γ、ζ和θ亚型可能在黑质中发挥主要作用。本研究的结果为研究14-3-3蛋白在Parkinson病中的作用提供了形态学依据。     

芳香化酶在胶质母细胞瘤细胞系SHG-44细胞中的表达及调控

目的 研究芳香化酶细胞色素P450(AROM)及雌激素受体(ER-α)在胶质母细胞瘤细胞系SHG-44细胞中的基因表达。方法 细胞培养、免疫细胞化学染色、原位杂交染色及RT-PCR技术。结果 在SHG-44细胞中分别检测到AROM及ER—α的表达,进一步发现SHG-44细胞中AROM的表达是由多个组织特异性启动子驱动基因的转录。结论 可能为中枢神经系统肿瘤发生的激素调节提供新的资料。     

MPTP对小鼠不同脑区神经递质代谢酶基因表达的影响

1-甲基 -4 -苯基 -1,2 ,3 ,6-四氢吡啶 (MPTP)能够诱发黑质纹状体系统多巴胺能神经元损伤并产生与帕金森病类似的症状。本实验通过 MPTP注射诱导 C5 7BL小鼠神经元损伤 ,利用逆转录 PCR方法检测酪氨酸羟化酶 (TH)、单胺氧化酶 B(MAO-B)以及胆碱乙酰基转移酶 (Ch AT)三种神经递质代谢相关基因的表达变化。结果发现 ,在小鼠黑质与纹状体中 ,MPTP导致 TH基因表达显著降低 ,而 MAO-B与 Ch AT基因的表达变化在黑质与纹状体则有所不同 ,在黑质 MPTP导致 MAO-B与 Ch AT基因表达的上升 ,在纹状体则略有下降。     

急、慢性铁负载大鼠黑质内铁及TH样阳性细胞变化的相伴关系

许多研究证实Parkinson病(PD)患者黑质内铁含量显著增高,并伴有铁代谢的改变,由于铁的细胞毒作用和它能够促进羟自由基产生的能力,使其在PD中的作用不容忽视。本实验用葡聚糖铁建立急慢性铁负载模型大鼠,采用酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学技术和Perls铁染色技术分别观察了黑质中多巴胺能神经元的存活情况以及黑质中铁含量的变化。结果显示:(1)急性铁负载模型组:黑质中TH阳性细胞数明显减少,而铁染色阳性细胞数明显增多,与正常对照组相比差异有高度显著性(P<0.05);(2)慢性铁负载模型组:黑质中TH阳性细胞数明显减少,铁染色阳性细胞数则明显增多,与正常对照组相比差异有高度显著性(P<0.05);(3)慢性组与急性组相比,黑质内TH阳性细胞数的减少和铁染色阳性细胞数的增多更为明显,差异有高度显著性(P<0.05)。上述结果提示,葡聚糖铁铁负载模型可引起黑质内铁增多,过量铁可导致黑质内多巴胺能神经元变性死亡,慢性铁负载对多巴胺能神经元的损伤作用大于急性铁负载损伤。