核激素受体等对乙型肝炎病毒转录与复制的影响

目的 建立乙型肝炎病毒（HBV）在非肝源细胞复制体系,观察核激素受体等对HBV基因转录和复制的调控作用。方法 用复制型FIBV重组质粒pHBV4．1与核激素受体HNF4、和RXRa／PPARa以及HNF3的表达质粒,分别共转染非肝源细胞株NIH3T3;用Northern吸印杂交检测HBV3．5kb、2．4／2．1kb、0．7kbmRNA的转录情况。Southern吸印杂交检测HBV DNA复制中间体水平。结果 复制型FIBV重组质粒pHBV4．1在肝癌细胞中,能检测到3．5kb HBV RNA转录产物和HBV DNA复制中间体;用pHBV4．1转染NIH3T3细胞后,在没有核激素受体表达质粒共转染时未能检出3．5kb HBV RNA等转录产物。也无HBV DNA复制中间体;当用核激素受体HNF4和RXRa／PPARa共转染时,能够激活3．5kb HBV RNA转录和HBV DNA复制,而HNF3未能激活HBV复制,但在核激素受体HNF4或RXRa／PPARa介导的病毒复制体系中,同时共转染FINF3时,均可见3．5kh HBV mRNA的转录和HBV DNA复制水平下降。结论 利用核激素受体等成功地建立HBV在非肝源细胞中的转录与复铡。且显示FINF4和RXRa／YPARa可支持HBV在非肝源细胞中转录与复制;HNF3抑制HBV肝特异性基因转录与复制。     

VPS4B显性负性突变体抑制乙型肝炎病毒复制

摘要：目的：观察细胞液泡蛋白质分选因子4B（VPS4B）显性负性突变体VPS4B-K180Q在体外抑制乙型肝炎病毒（HBV）复制的效应。 方法：用不同剂量野生型VPS4B真核表达质粒pXF3H-VPS4B和K180Q突变型真核表达质粒pXF3H-K180Q与pHBV1.3共转染Huh7细胞,时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）定量检测细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg含量,Southern blot分析细胞内HBV核衣壳相关DNA水平,实时定量PCR检测HBV相关mRNA水平变化。 结果：野生型VPS4B可抑制HBsAg和HBeAg的分泌,对细胞内HBV核衣壳相关DNA和mRNA的抑制作用较弱;低剂量突变型VPS4可显著抑制HBsAg和HBeAg的分泌,对细胞内HBV核衣壳相关DNA和mRNA的抑制作用较强,且均呈剂量依赖的抑制效应。 结论：VPS4B及其显性负性突变体可在体外表现出抗HBV的作用,突变型VPS4B抑制HBV能力高于野生型VPS4B。     

定量检测乙型肝炎病毒cccDNA的临床意义

在感染乙型肝炎病毒(HBV)的肝细胞核内可检测到一种不同形式的病毒DNA-共价闭合环状DNA(covalentlyclosed circular DNA,cccDNA).cccDNA是乙肝病毒基因组的复制中间体,是病毒mRNA和前基因组RNA转录的模板,它的存在是病毒复制的一个重要指标.应用荧光定量PCR方法检测慢性乙肝患者肝组织HBV cccDNA水平,同时检测肝组织、血清HBV DNA,肝细胞HBcAg表达及肝功能等,以探讨HBV cccDNA与病毒复制、肝实质损害的关系及在抗病毒治疗中的意义,为确定抗病毒治疗的最佳方案、治疗终点等提供理论依据.     

乙型肝炎病毒X蛋白在HBV复制中作用的研究进展

乙型肝炎是全球范围的严重公共卫生问题之一,而我国是乙型肝炎的高发区,全球3·7亿乙型肝炎病毒(HBV)携带者中,中国即占1/3。HBV属嗜肝DNA病毒家族,研究表明,HBV诱导机体免疫反应,直接或间接地改变肝脏细胞的结构和功能,引发肝脏细胞的凋亡、坏死或癌变。由HBV编码众多蛋白中,乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)的作用相对不是很明确。目前研究认为,它是一种多功能调节蛋白,可反式激活多种细胞及病毒基因,在HBV致病和致癌机制中具有重要作用,从而引起广泛关注。1 HBV基因组结构及其转录与复制的特点HBV为含3·2kb部分双链环状DNA的包膜病毒,其基因组含有4个重叠的开放读码框架,分别称为S、C、P和X区。此外,还包括4个启动子(SP1,SP2,XP,CP)和2个增强子(EnhⅠ,EnhⅡ),是HBV基因组的顺式活化元件。HBV感染过程中产生3·5kb、2·4kb、2·1kb、0·7kb等4种转录产物,分别编码HBcAg、HBeAg、DNA多聚酶、HBsAg及HBxAg。HBV的生活周期包括附着、侵入、脱壳、HBV RNA转录、HBV DNA复制、HBV病毒的包装与释放等过程。HBV进入肝细胞后脱去核壳,HBV基...     

肝细胞核因子4α在肝脏再生中的研究进展

<正>肝细胞核因子4(HNF4)是从大鼠肝脏中发现的,属类固醇激素受体超家族成员,其DNA结合活性与α1-抗胰蛋白酶、载脂蛋白A1和丙酮酸激酶基因转录调控有关。HNF4α与大鼠肝脏提取物中transthyretin(TTR)和apolipoprotein CⅢ(APOCⅢ)转录所需要的位点结合。在小鼠肝脏发育过程中,HNF4α在胃泌素分泌前的原发性和胚胎外内脏内皮细胞中     

HepG2.2.15细胞系中HBV复制相关抑制因素的变化

目的:研究HBV对其自身复制相关抑制因素的影响,为今后探索提高抗病毒治疗的疗效提供基础.方法:采用实时荧光定量RT-PCR技术检测原蛋白转化酶(PCs)、肝细胞核因子(HNF)3*9茁和转化生长因子(TGF)*9茁1等HBV复制相关抑制因素的mRNA表达,采用Western印迹技术检测部分PCs的蛋白表达,通过比较模型细胞HepG2.2.15和其前体细胞HepG2的表达差别来判断HBV对其自身复制相关抑制因素的影响.结果:HepG2.2.15和HepG2细胞均相对高表达furin和PACE4,但HepG2细胞还高表达PC1/2.与HepG2细胞相比,HepG2.2.15细胞的PC1/3和PC7/8在mRNA水平显著被下调(均P ＜ 0.05),且PC1/3在蛋白水平的表达也显著减少.HepG2.2.15细胞的HNF3β和TGFβ1的mRNA表达水平也发生了显著改变,分别增加到5.22倍和降低到0.35倍.结论:HBV的存在对其自身复制相关抑制因素可产生显著影响.下调部分PCs和TGF*9茁1表达可能有利于HBV自身复制,但上调HNF3*9茁的意义值得深入研究.     

核基质蛋白22对尿路上皮癌的初步评价

核基质是细胞核内的一种结构万分,1974年被首次揭示,核基质充盈于细胞内,是细胞核内除核膜、核仁、染色质以外的一个蛋白系统,其主要成分为RNA并对DNA的复制、转录和RNA的合成起重要作用[1-3].     

RNA干预法特异性抑制核激活因子受体配体诱导破骨细胞的形成

目的:使用RNA干预来特异性减少核激活因子受体配体的表达从而抑制破骨细胞的形成。方法:实验于2005-01/2006-10在解放军第四军医大学全军骨科研究所完成。①构建由U6启动子引导产生小干预RNA的质粒载体mU6pro-dsRANKL。②按0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0μg的梯度将质粒mU6pro-dsRANKL及对照质粒mU6pro转染大鼠骨髓基质细胞,48h后提取细胞总RNA。③采用Northern blot法检测,以核激活因子受体配体与内参β-肌动蛋白扩增产物的吸光度比值来反映核激活因子受体配体mRNA的表达情况。④再将质粒mU6pro-dsRANKL按0,1.0,2,3μg转染破骨细胞,抗酒石酸染色显微镜下观察。结果:①Northern blot结果:显示转染骨髓基质细胞后细胞中核激活因子受体配体mRNA的表达量随着质粒载体量的增加而减少。②破骨细胞抗酒石酸染色显示:破骨细胞的数量也随着质粒载体量的增加而减少。结论:U6启动子引导产生小干预RNA的质粒载体能有效的减低核激活因子受体配体的表达从而抑制破骨细胞的形成。     

lncRNA在乙型肝炎病毒复制调控中的研究进展

全世界有超过2.4亿人感染乙型肝炎病毒(HBV),15%~40%的未接受治疗的慢性HBV感染者可进展为肝硬化,最终导致肝衰竭和肝癌[1-2]。HBV是大小约为3.2 kb的部分环状双链DNA,其在DNA聚合酶作用下可转化形成共价闭合环状DNA(cccDNA)。肝细胞中的两个高活性启动子EnhancerⅠ(En1)、EnhancerⅡ(En2)与肝细胞表面表达的特异性受体蛋白及细胞内富集的各类转录调控因子共同决定了HBV的嗜肝特性[3]。     

乙肝病毒相关肝病患者肝移植后外周血单个核细胞及肝组织中乙型肝炎病毒cccDNA的检测

背景:肝移植后受者体内绝大部分病毒负荷被清除,植入新肝后其复发性肝炎病原体从肝外进入肝内的途径及其复制规律目前尚无定论.目的:检测肝移植前后外周血单个核细胞和肝组织中乙型肝炎病毒cccDNA及血清中乙型肝炎病毒DNA的表达.方法:采用淋巴细胞分离液从乙肝病毒相关终末期肝病37例患者外周血中分离出单个核细胞,采用荧光定量PCR检测肝移植前后及移植后乙肝复发3个时期外周血单个核细胞和肝组织中cccDNA及血清乙型肝炎病毒DNA表达.结果与结论:肝移植前,单个核细胞cccDNA阳性12例,肝组织cccDNA阳性6例,检出率分别为32%和16%,单个核细胞、肝组织中cccDNA拷贝范围分别为(3.028～6.508)×104,(4.158～6.234)×104 拷贝/mL.肝移植后,单个核细胞cccDNA阳性1例,无血清乙型肝炎病毒DNA检测阳性病例.6例肝移植后乙肝复发病例中外周血单个核细胞cccDNA阳性4例,肝组织活检cccDNA阳性1例,6例血清乙型肝炎病毒 DNA均为阳性.提示乙肝病毒相关终末期肝病患者肝移植后乙肝复发途径可能是残留乙肝病毒在外周单个核细胞中以cccDNA为模板复制,然后再迁移到肝脏.     

乙型肝炎病毒阿德福韦酯耐药株(RT A181T)感染性克隆的构建及在Huh7细胞中的表达

目的利用重叠延伸聚合酶链反应(SOE-PCR)快速构建乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韦酯耐药株(RT A181T)感染性克隆,观察重组质粒在Huh7细胞中的表达,建立HBV阿德福韦酯耐药株(RT A181T)的体外研究细胞模型。方法设计保守引物,从慢性乙型肝炎阿德福韦酯耐药患者血清中扩增全长HBV基因组,利用SOE-PCR技术构建1.3倍基因组长度的感染性克隆质粒pHBV1.3,转染肝癌细胞系Huh7,采Western Blot、Real-time PCR检测感染性克隆复制以及表达情况,同时用抗病毒药物拉米夫定以及阿德福韦酯验证对感染性克隆复制及表达的抑制情况。结果成功构建了HBV阿德福韦酯耐药株感染性克隆质粒pHBV1.3(RT A181T),该质粒在Huh7细胞系中能有效复制、转录和表达。拉米夫定能有效抑制该感染性克隆的复制和表达,阿德福韦酯不能抑制该感染性克隆的复制和表达。结论构建的HBV阿德福韦酯耐药株感染性克隆质粒pHBV1.3(RT A181T)在体外能高效复制及表达蛋白,其转染细胞可用于HBV复制机制及抗病毒研究。     

靶向C区基因的M1GS RNA核酶胞内抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的探讨靶向作用于乙型肝炎病毒C区基因的M1GS RNA核酶胞内抗乙型肝炎病毒的作用。方法设计并应用PCR技术合成M1RNA核酶，应用pEGFP-C1载体构建M1GSRNA核酶的真核表达质粒，应用脂质体Lipofectamine TM 2000转染HepG2．2．15细胞，以ELISA法检测细胞培养液中病毒抗原，以反转录-聚合酶链反应法（RT-PCR）检测细胞内病毒mRNA，以荧光定量PCR法检测分泌入培养液的HBVDNA含量，用MTT法检测核酶对细胞增殖活性的影响。结果质粒载体表达的M1GS RNA核酶能明显抑制细胞培养液中HBeAg的表达及病毒mRNA的表达，抑制率分别为31．58％，32．5％。但M1GS RNA核酶对培养液中的HBV DNA含量无明显影响，亦不影响HepG2．2．15细胞的增殖活性。结论M1GS RNA核酶能特异性抑制HepG2．2．15细胞内HBV C区基因表达，是一种很有潜力的抗HBV基因治疗方法。     

Long-term suppression of hepatitis B virus replication by short hairpin RNA expression using the scaffold/matrix attachment region-based replicating vector system pEPI-1

Since the emergence of viral resistance of hepatitis B virus (HBV) during treatment is becoming an important issue even with newer drugs, there is a need for alternative treatment options such as, for example, RNA interference (RNAi) technology. While short-term suppression of HBV replication is easily achieved with small interfering RNA oligonucleotides, this is not the case for long-term suppression due to the lack of an optimal vector system. Based on the nonviral scaffold/matrix attachment region (S/MAR)-based vector system pEPI-1, which is free of common side effects and is stably retained as an episome even in the absence of selection, we designed a short hairpin RNA (shRNA) expression vector called pEPI-RNAi for HBV suppression. HBV-replicating HepG2.2.15 cells were transfected with pEPI-RNAi, and the intracellular status of the plasmid was followed by PCR and Southern analysis. HBV replication was measured on the DNA, RNA, and protein level. HBV RNA expression was reduced by almost 85% 3 months posttransfection with pEPI-RNAi. At 8 months posttransfection in the absence of antibiotic selection pressure, the suppression level was still 70% and the vector was retained as an episome. The reduction of total intracellular HBV DNA at this point was 77%, showing a marked suppression of HBV DNA replication. At a comparable level, secretion of viral antigens, as well as progeny HBV virions, was inhibited. The S/MAR-based vector system pEPI-1 allows long-term suppression of HBV replication by the expression of suitable shRNAs. Due to its unique properties compared to commonly used vectors, it provides an interesting option for the treatment of chronically HBV-infected individuals.     

白细胞介素-35对乙型肝炎病毒复制的影响研究

目的探讨白细胞介素(IL)-35对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。方法将HBV感染性克隆pHBV1.3及其启动子pHBV-Luc分别转染HepG2细胞,加入不同浓度的重组人IL-35蛋白,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞上清液中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型肝炎e抗原(HBeAg)水平;荧光定量聚合酶链反应检测细胞闭合环状DNA(cccDNA)的水平;采用Luminometer荧光检测仪分析HBV启动子活性的变化。结果 IL-35能够抑制细胞上清液中HBsAg和HBeAg的水平及细胞内HBV cccDNA的拷贝数,并下调HBV启动子的活性。结论 IL-35能够在HepG2细胞中抑制HBV的复制。     

The short hairpin RNA driven by polymerase II suppresses both wild-type and lamivudine-resistant hepatitis B virus strains

BACKGROUND: Chronic infection with hepatitis B virus (HBV) is widespread because of the limited availability of therapeutic treatments. Although previous reports have suggested that RNA interference has promise as a treatment for HBV infection, further studies of long-term and off-target drug effects on HBV, especially on drug-resistant strains of HBV, are needed. Therefore, seven vectors that express short hairpin RNAs (shRNAs), driven by the polymerase II promoter, pSilencer4.1/HBV, were constructed to target open reading frames (ORFs) of the HBV C and S genes from wild-type and drug-resistant strains. Treatment efficiency was also assessed. METHODS: The pSilencer4.1/HBV vectors were investigated in HepG2.2.15 cells and transgenic mice that consistently produce wild-type HBV. Additionally, vectors that produce a lamivudine-resistant strain of HBV were developed and cotransfected, along with pSilencer/HBV, into both HepG2 cells and mice. The effects of polymerase-II-driven pSilencer4.1/HBV were compared with those of polymerase-III-driven pSilencer3.1/HBV at both the gene and protein level. RESULTS: pSilencer4.1/HBV inhibited the expression of viral protein, DNA and HBV subtype ayw mRNA in both HepG2.2.15 cells and transgenic mice. Toxicity, as well as off-target effects, did not occur after a short- to medium-term examination. Moreover, an HBV strain resistant to lamivudine, subtype adr, was suppressed by shRNA in both HepG2 cells and mice. In contrast to polymerase III, vectors that used polymerase II could drive efficient silencing without off-target effects. CONCLUSIONS: Silencing by shRNA dramatically inhibited HBV expression and replication regardless of strain type. ShRNA could therefore be a promising treatment for HBV infection.