第10届原位杂交、细胞凋亡技术培训班通知

随着分子生物学特别是工因工程的发展，分子水平的研究已成为当今形态学科的前沿和主流。第二军医大学组织胚胎学教研室，自１９８９年以来，已逐步建立了一套适合我国国情的高水平的形态研究技术，曾先后举办了九届学习班，向全国２０余个省市加以推广，并向３０余所高等院校或科研单位提供了近３００套本室研制的试剂盒，使用结果良好。为了满足同行们及一些科研工作者的需求，我室拟举办第１０届的原位杂交及细胞凋亡技术学习班（１９９９年１０月中旬，学习时间７天，详见通知），包括免疫组织化学／原位杂交、组织化学双色法技术和原位…     

第二军医大学举办第五期原位杂交、组织化学光镜、电镜技术学习班

1994年10月31日～11月6日,在上海第二军医大学组织胚胎学教研室举办了第五期原位杂交、组织化学光镜、电镜技术学习研讨班.来自天津、上海、河北、山西、陕西、山东、河南、湖北、广东、广西、云南和四川等12个省、市高校的33名同志参加了学习班,其中近二分之一具有高级职称.在总结前四期学习班的基础上,本届采用了理论与实习相结合的方式进行.授课内容主要有:基因工程的基本原理及基本方法;核酸探针技术及其应用;真核细胞的原位杂交组织化学等.实习着重操作,质粒     

第二军医大学举办第七期全国原位杂交组织化学技术学习班

1995年12月11日～17日在上海第二军医大学组织胚胎学教研室举办了第七期全国原位杂交组织化学技术学习班.来自北京、河北、山西、辽宁、吉林、山东、上海、江苏、浙江、河南、湖北、广东、广西、四川和贵州等15个省市高校的教研室与研究室共25人参加.他们中有正、副教授9名,博士生及博士后4名.有留学归国和等待出国的人员.该期学习班仍采用理论与实习(操作)相结合的方式进行.授课内容主要有:基因工程的基本原理及基本方法;核酸探针技术及其应用;真核细胞的原位杂交组织比学等.实习着重操作.质粒的扩增、抽提及纯化;质粒的酶切和回收(模板的制备);反意cRNA探针制备;组织切片制备、杂交、显色等技术.通过学习与研讨,大家一致认为,在国     

胰岛素样生长因子-1对白介素-1体外诱导家兔椎间盘髓核细胞凋亡的影响

目的:利用白介素-1(IL-1)诱导培养的家兔椎间盘髓核细胞凋亡,用胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对凋亡进行干预,探讨IGF-1对髓核细胞凋亡的抑制作用.方法:分离健康家兔椎间盘髓核,Ⅱ型胶原酶消化法分离椎间盘髓核细胞.Ⅱ型胶原免疫组织化学显色和甲苯胺蓝染色对髓核细胞鉴定.培养第1代髓核细胞分为空白组、IGF-1组和IL-1组.利用Giemsa染色、原位末端标记(TUNEL)、流式细胞仪观测各组髓核细胞凋亡情况.结果:IL-1组可见大量髓核细胞凋亡,IGF-1组可见少量细胞凋亡,空白组罕见凋亡征象.原位末端标记显示,与IL-1组比较,IGF-1组细胞凋亡率明显降低.流式细胞仪检测显示IGF-1组细胞凋亡率明显降低.IL-1组与空白组比较,凋亡率明显增高.IGF-1组、IL-1组和空白组晚期凋亡百分率差异均有统计学意义.结论:IGF-1对IL-1体外诱导的髓核细胞凋亡具有抑制作用.     

挖空细胞的本质及尖锐湿疣病理诊断

目的 从分子生物学角度，寻找尖锐湿疣比较确切可行的病理诊断标准。方法 采用HE、HPV-CAg免疫组化、HPV-DNA原位杂交组化染色和超薄切片等方法检测50例尖锐湿疣；用原位末端标记TUNEL染色，对20例尖锐湿疣进行观察。结果 鳞状上皮呈尖细的乳头状增生，角化不全和乳头纤维轴索中毛细血管丛状增生，棘层中上部和颗粒层有多少不等的挖空细胞，单个散在、成群或广泛分布，胞质空亮，核皱缩成星形或毛虫样，无炎细胞反应。原位杂交组化HPV-DNA的阳性细胞比免疫组化HPV-CAg阳性细胞明显增多。原位末端标记TUNEL染色及光镜、电镜观察，显示所有的挖空细胞均呈现细胞凋亡变化。结论 尖锐湿疣挖空细胞是由HPV所引起的凋亡细胞。从形态学上确认其凋亡特征即可确定尖锐湿疣的诊断，角化不全和乳头间质血管丛状增生可作佐证。难以确认挖空细胞的疑难病例，可采用原位杂交组化技术。     

细胞凋亡和Fas/FasL表达在移植肾急性排斥时意义

目的:探讨移植肾急性排斥(AR)时细胞凋亡与Fas和Fas配体(FasL)表达的作用及其临床意义.方法:分别用原位末端标记技术 (TUNEL法)和免疫组织化学方法检测23例移植肾AR标本中细胞凋亡和Fas/FasL的表达.结果:细胞凋亡和Fas/FasL表达主要在AR移植肾小管上皮发生,且凋亡指数和Fas/FasL表达与肾组织病理损伤程度平行,与正常肾对照组和移植肾功能稳定组比较差异有统计学意义( P <0.01).结论:肾小管上皮细胞凋亡在AR所致的移植肾损伤中起重要作用,Fas/FasL系统可能参与移植肾AR,是造成肾小管上皮细胞凋亡的重要因素.TUNEL法检测细胞凋亡可作为判断移植肾病理变化和预后的重要指标.     

人胚胎大脑标本石蜡制片及免疫组织化学方法

免疫组织化学是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)的分布进行定位,在组织原位显示抗原(或抗体),抗原、抗体反应具有较高的特异性,但其结合是不可见的,必须借助可见的组织化学手段显示其反应部位,因此,免疫组织化学是目前病理学、组织学、胚胎学等多学科领域研究的重要方法.但免疫组织化学是否成功?其关键因素之一就是制作标本石蜡制片.经查阅文献,目前有关人胚胎肠[1]组织石蜡制片有少数报道,但对人胚胎大脑标本石蜡制片过程及免疫组织化学方法的操作,未见报道.现就人胚胎大脑4个月标本为例,根据本实验室工作经验,对其流程及方法进行探讨.     

TUNEL技术改良

细胞凋亡的研究已成为当今国内外形态学和分子生物学研究的新热点[1] 。检测细胞凋亡的主要方法有形态学和基因组ＤＮＡ的分析。原位检测法由于可在组织原位同时显示凋亡细胞的形态和分布而被广泛采用[2 ] 。原位检测法主要包括 :①末端脱氧核苷酸转移酶介导的ｄＵＴＰ缺口末端标记 (ＴＵＮＥＬ) ;②ＤＮＡ聚合酶Ｉ或Ｋｌｅｎｏｗ大片段介导的原位缺口平移(ＩＮＳＴ)。我们采用Ｉｎｔｅｒｇｅｎ公司生产的原位末端标记试剂盒 ,对福尔马林固定、石蜡包埋的脑组织进行ＴＵＮＥＬ染色 ,在操作手册和已有文献的基础上进行方法改进 ,旨在比较酶消…     

TUNEL法原位检测肿瘤组织细胞凋亡的改进

原位末端标记技术是当今较为流行的一类定量凋亡细胞评判方法,以脱氧核苷酸末端转移酶(TdT) 介导的核苷酸(dUTP) 缺口末端标记法(TUNEL )应用最为广泛.在对各种组织进行凋亡研究时,多数采用从各种试剂公司购买的试剂盒.虽然试剂盒使用方便,但是有时结果并不理想,如非特异性染色过多,背景染色深.对动物组织的研究更是如此.我们在TUNEL染色过程中如何更好地利用试剂盒,在避免假阳性、消除非特异性反应、降低背景染色等方面进行了探索和改进,获得了满意的实验结果,现介绍如下.     

双标忆方法检测骨肉瘤细胞增生和细胞凋亡

本研究应用ＡＰＡＡＰ和原位末端标记（ＩＳＥＬ）双标记方法，检测了８０例骨肉瘤细胞的增生和细胞凋亡，旨在建立一种同时显示细胞增生和细胞凋亡的方法，便于病理医生更好地观察肿瘤细胞增生和细胞凋亡的关系。     

应用原位杂交法检测胎盘组织HLA-G mRNA的表达

应用地高辛标记的特异性寡聚核苷酸探针原位杂交正常妊娠初期胎盘组织切片，检测母胎界面处各类细胞ＨＬＡ ＧｍＲＮＡ的表达与分布。结果显示绒毛内、外的细胞滋养层细胞表达强ＨＬＡ ＧｍＲＮＡ信号；合体滋养层细胞也有ＨＬＡ ＧｍＲ ＮＡ的表达；绒毛内间质细胞、血管内皮细胞以及蜕膜基质细胞不含任何ＨＬＡ Ｇ信号。结果表明地高辛标记的特异性寡聚核苷酸探针原位杂交方法成功显示妊娠期胎盘不同细胞ＨＬＡ ＧｍＲＮＡ转录情况，证明此方法的可行性、可靠性。     

创伤后应激障碍大鼠海马细胞凋亡中细胞色素C的表达与释放

目的:观察创伤后应激障碍(PTSD)大鼠海马神经元凋亡和细胞色素C(Cyt C)的表达与释放,探讨细胞凋亡与Cyt C的关系.方法:采用单一延长应激(SPS)方法刺激大鼠建立PTSD大鼠模型,取SPS刺激后4、 7、 14、 28d组和正常对照组.用原位末端标记法观察神经元凋亡,免疫组织化学和免疫印迹法检测Cyt C蛋白的表达,酶电镜组织化学术观察Cyt C的释放.结果:SPS刺激后4d线粒体肿胀,外膜破裂,Cyt C释放.胞质中Cyt C蛋白于SPS刺激后4d达到高峰并维持较高水平,SPS刺激后7d逐渐下降.凋亡细胞于SPS刺激后7d达高峰.结论:Cyt C从线粒体释放入胞质是引发PTSD大鼠海马神经元凋亡的关键步骤.     

双标记方法检测骨肉瘤细胞增生和细胞凋亡

本研究应用ＡＰＡＡＰ和原位末端标记（ｉｎｓｉｔｕｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇ，ＩＳＥＬ）双标记方法，检测了８０例骨肉瘤细胞的增生和细胞凋亡，旨在建立一种同时显示细胞增生和细胞凋亡的方法，便于病理医生更好地观察肿瘤细胞增生和细胞凋亡的关系。     

Livin反义寡核苷酸对人HL60细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨Livin mRNA反义寡核苷酸（ASODN）对人白血病细胞（HL60）增殖及凋亡的影响。方法 用免疫组织化学检测Livin蛋白表达,设计合成特异性的Livin硫代磷酸ASODN及其对照错义寡核苷酸（MSODN）,脂质体转染HL60细胞。用四甲基偶氮唑盐光吸收法(MTT)检测细胞增殖,反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测Livin mRNA的表达,原位末端标记技术（TUNEL）、电镜检测细胞凋亡率和形态学改变。结果Livin ASODN在终浓度为600nmol／L作用HL60细胞48h时,能明显地抑制其增殖,降低Livin mRNA的表达,HL60细胞在形态学上出现明显的凋亡改变,细胞凋亡率显著增加 (P<0.01)。结论Livin ASODN可有效抑制HL60细胞的增殖,下调Livin基因表达,并促进HL60细胞凋亡,在诱导肿瘤细胞凋亡、抑制增殖中发挥重要作用。     

TUNEL复合染色显示肝内细胞凋亡

已知肝内除肝细胞可以发生凋亡外 ,增生的小胆管上皮细胞、肝非实质细胞如星状细胞、枯否细胞等均可发生细胞凋亡。它们对维持肝内细胞间的平衡 ,胶原纤维的沉积与降解均发挥着重要的作用[1] 。为了研究肝病组织中各种细胞凋亡的发生发展及形态学改变 ,我们应用较为灵敏的ＴＵＮＥＬ法在石蜡切片中原位检测细胞凋亡。由于肝窦中细胞成分较多 ,为了同时鉴别发生凋亡细胞的类别 ,在ＴＵＮＥＬ法基础上附加显示相应细胞的特异免疫组织化学或辅以特殊染色 ,并以 2种ＴＵＮＥＬ试剂盒与免疫组织化学做对应的染色 ,选择具最佳显示效果的方法。一、…     

NS398体外对子宫内膜癌细胞的影响

目的探讨环氧合酶抑制剂NS-398对子宫内膜癌的作用机制。方法采用形态学,MTT,DNA梯度降解试验,原位末端标记及流式细胞仪等方法,对NS-398在子宫内膜癌细胞系Ishikawa中的作用进行体外研究。结果NS-398对Ishikawa细胞产生明显的生长抑制作用,且表现为浓度和剂量依赖性;原位末端标记、流式细胞仪显示NS-398诱导了Ishikawa细胞凋亡。结论NS-398对Ishikawa细胞具有显著的体外生长抑制及凋亡诱导作用。     

肝癌的细胞凋亡及其紫杉醇的诱导作用研究

目的研究肝癌发生过程中原位细胞凋亡活动以及紫杉醇对肝癌细胞系BEL-7404诱导细胞凋亡的作用。方法用脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法检测了肝细胞癌的细胞凋亡,用紫杉醇处理培养细胞BEL-7404、显微镜下进行观察并且进行琼脂糖电泳。结果癌旁组织的原位凋亡细胞增多,紫杉醇处理肝癌细胞可以诱导细胞产生典型的细胞凋亡形态学变化。DNA发生断裂,琼脂糖电泳产生梯形条带。结论在体内肿瘤细胞凋亡降低,细胞分裂可能加快,肿瘤发生。在癌旁组织中细胞凋亡增多,在体外紫杉醇可以诱导肝癌细胞系BEL-7404凋亡。     

稽留流产患者绒毛凋亡情况和IGF-Ⅱ表达情况分析

目的通过观察绒毛组织凋亡发生和胰岛素样生长因子-2(IGF-Ⅱ)表达情况,来探讨稽留流产发生的可能原因。方法分别选择30例无明显诱因导致的稽留流产患者和正常早孕要求人工流产的患者作为研究对象,采用DNA缺口原位末端标记技术(TUNEL法)检测绒毛滋养细胞的凋亡情况;采用SABC法检测绒毛组织中IGF-Ⅱ的表达情况。结果稽留流产组滋养细胞凋亡指数明显高于对照组,前者IGF-Ⅱ的表达明显高于后者。结论滋养细胞过度凋亡及IGF-Ⅱ缺乏可能是导致稽留流产的重要原因。     

胶质瘤细胞血小板源生长因子B链的纯合二聚体自分泌环活性？…

探讨胶质瘤细胞血小板源生长因子Ｂ链的纯合二聚体自体沁 活性与其细胞增殖和凋亡的关系。方法用原位杂交,原位细胞凋亡检测和免疫组化ＡＢＣ法染色观察了７３例不同级别的胶质瘤组织。     

创伤后应激障碍大鼠海马神经元凋亡的形态学变化及相关基因表达

目的 探讨创伤后应激障碍(PTSD)大鼠海马神经元Bcl-2和Bax的表达及与神经元凋亡的关系.方法 采用国际认定的SPS方法刺激大鼠建立PTSD大鼠模型,取SPS刺激后1d、4d、7d、14d组和正常对照组.应用透射电镜和原位末端标记法观察PTSD大鼠海马神经元细胞凋亡的形态学变化并检测细胞凋亡指数;应用免疫组织化学、免疫荧光双标、激光共焦显微镜技术和免疫印迹法检测Bel-2和Bax蛋白的表达. 结果 PTSD大鼠海马神经元出现细胞凋亡改变;凋亡细胞数量随时问的延长而逐渐增多,于SPS刺激后7d达高峰;Bel-2蛋白于SPS刺激后4d达高峰;Bax蛋白于SPS刺激后7d达高峰,之后逐渐下降.Bcl-2/Bax的比值于SPS刺激后一过性增加,以后随时间延长比值下降. 结论海马神经元细胞凋亡可能是PTSD大鼠海马萎缩的原因之一;Bel-2和Bax蛋白含量增加以及两者的比值失衡可能是导致PTSD大鼠海马神经元凋亡的原因之一.