小鼠降钙素基因相关肽基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞的表达

目的:利用AdEasy腺病毒载体系统,构建小鼠降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)基因重组腺病毒载体,并验证其在心肌细胞中的表达.方法:采用RT-PCR方法扩增出含有小鼠CGRP全长cDNA的基因片段,并将其插入PUC57载体,经EcoRⅤ和SalⅠ双酶切,将小鼠CGRP基因亚克隆至穿梭质粒pShuttle-CMV,形成重组质粒pShuttle-CMV-CGRP.经PmeⅠ酶切线性化后,在大肠杆菌BJ5183中与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组产生重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP.重组腺病毒质粒在XL-Gold 细胞中扩增,经PacⅠ酶切线性化后,转染人胚肾293细胞进行重组腺病毒的包装,并经氯化铯纯化得到重组腺病毒AdEasy-pShuttle-CGRP.用纯化后的重组腺病毒转染原代培养的乳鼠心肌细胞,荧光显微镜下观察转染效果.通过尾静脉导入重组腺病毒7 d后,放免法测定心肌中CGRP的表达量.结果:测序证实PUC57 -CGRP重组质粒中含有小鼠CGRP基因的cDNA;重组穿梭质粒pShuttle-CMV-CGRP经双酶切鉴定后可见约7.5 kb和423 bp片段;重组腺病毒质粒AdEasy-pShuttle-CGRP经Pac Ⅰ酶切可见长约3 kb与30 kb DNA片断.转染293细胞进行包装,7 d后细胞出现病变效应,回收病毒重复感染293细胞,在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白表达.提取病变293细胞中重组腺病毒进行目的基因的PCR鉴定为阳性.构建好的重组腺病毒经纯化后具有很高的滴度,并且成功转染了原代培养的乳鼠心肌细胞.通过放免法证实,该载体可以显著增加小鼠心脏中CGRP的表达.结论:成功构建携带CGRP基因的重组腺病毒载体,该重组腺病毒载体AV-CGRP可以显著增加心脏中CGRP的表达量,为进一步研究CGRP基因治疗奠定了基础.     

人S100 A9重组腺病毒载体的构建和鉴定

目的制备人S100A9(hS100A9)重组腺病毒载体,为进一步研究人S100A9蛋白的分子生物学作用奠定基础。方法从pHAHA-hS100A9中PCR扩增hS100A9片段,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-TOX,获得重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9。酶切、聚合酶链反应(PCR)及测序鉴定正确后经PmeⅠ酶切电转入AdEasier感受态细胞,获得重组腺病毒质粒pAdhS100A9,该质粒经PacⅠ酶切后由脂质体转染至HEK293细胞中包装扩增重组腺病毒并进行滴度测定,最后通过PCR及蛋白印迹法(Western blot)鉴定重组腺病毒。结果正确扩增出hS100A9基因;重组穿梭质粒pAdTrack-TOX-hS100A9均及重组腺病毒质粒pAdhS100A9构建成功,并在HEK293细胞中成功包装且扩增后滴度为1 010 I U/mL;重组腺病毒AdhS100A9在HEK293细胞中成功转录和表达。结论用pAdEasy系统成功构建hS100A9重组腺病毒载体,为探讨其生物学作用奠定了基础。     

携带乙肝核心抗原基因复制缺陷型重组腺病毒的高效制备和表达

目的构建表达乙肝病毒核心抗原(HBcAg)的复制缺陷型重组腺病毒载体。方法扩增乙肝病毒(HBV)C基因片段,亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共同电转化到大肠杆菌BJ5183内进行同源重组,经卡那霉素抗性筛选和酶切鉴定筛选出携带HBVC区基因的重组腺病毒载体,用脂质体包裹PacⅠ酶切线性化的重组质粒,转染到293细胞内进行重组腺病毒的包装。体外转染真核细胞,通过示踪基因绿色荧光蛋白表达的观察、RT-PCR和ELISA检测目的基因的表达。结果成功获得重组腺病毒质粒pAd-HBc。重组质粒pAd-HBc导入293细胞,经过包装和二次扩大培养获得了具有感染能力的重组腺病毒颗粒Ad-HBc,其病毒滴度达5×109pfu/mL,并能在真核细胞中有效表达目的基因。结论成功构建表达HBcAg复制缺陷型重组腺病毒载体,为进一步开展HBV基因治疗研究提供实验基础。     

人HIF-1α基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建人缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因的重组腺病毒载体,并观察其对HepG2细胞的转染情况.方法 采用基因工程技术,经过亚克隆将人HIF-1α基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用pAdEasy系统进行细菌内同源重组后,经脂质体转染HEK293细胞,进行重组腺病毒的包装、扩增.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HepG2细胞感染效率的监测.结果 酶切鉴定及PCR结果证明重组腺病毒载体成功,人HIF-1α重组腺病毒滴度达1.15×1010 pfu/ml,阴性对照腺病毒的滴度为8×1010 pfu/ml,并对HepG2细胞具有很强的感染力.结论 应用细菌内同源重组法成功构建了含人HIF-1α基因的重组腺病毒载体.     

小鼠IDO基因重组腺病毒载体的构建表达和鉴定

目的 构建携带小鼠IDO基因的重组腺病毒载体,以期进一步进行研究其免疫学效应.方法 酶切含有小鼠全长IDOcDNA的PCOUS-2质粒,亚克隆至穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183细菌中和AdEasy-1进行同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确后,脂质体法转染AD-293细胞进行包装,扩增,氯化铯密度梯度离心纯化病毒并检测其滴度.RT-PCR和荧光显微镜鉴定和检测重组腺病毒转染AD-293细胞后IDO的表达,同时进行野生型腺病毒的检测.结果 经酶切及测序证实IDO基因重组腺病毒载体构建成功,RT-PCR检测到转染后AD-293细胞内IDO的表达,且无野生型腺病毒的产生.结论 成功构建了含小鼠IDO基因的重组腺病毒载体,为探讨IDO的生物学功能奠定了基础.     

人低氧诱导因子-1α重组腺病毒的构建和鉴定

目的 利用AdMax腺病毒载体系统构建人重组低氧诱导因子-1α(rhHIF-1α)基因腺病毒并在293细胞中扩增制备重组病毒. 方法 自先期构建的pcDNA4-rhHIF-1α真核表达载体中用RT-PCR法扩增出rhHIF-1α基因片段,将其克隆入线性化的pEGFP1-C1质粒中,用PCR法扩增EGFP-rhHIF-1α基因片段,将其克隆入PUC18质粒中.酶切构建好的pUC18-rhHIF-1α载体并克隆进入穿梭质粒PDC316中,将构建好的穿梭质粒PDC316-rhHIF-1α载体和骨架病毒pBHGlox△1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒.重组的病毒转染SG-7901细胞,荧光显微镜观察绿色荧光表达. 结果 经限制性内切酶检测和GFP表达证实成功地构建了携带重组人HIF-1α基因的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒. 结论 成功地构建了携带rhHIF-1α基因片段的重组腺病毒载体.     

大鼠促红细胞生成素重组腺病毒载体的构建及其在大鼠SGNs中的表达

目的构建大鼠促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)重组腺病毒载体,并转染于体外培养的大鼠螺旋神经元(spiral ganglion neurons,SGNs)。方法全基因合成大鼠EPO基因,亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV,构建重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-EPO。经酶切、PCR及测序鉴定,再经PacⅠ酶切线性化后电转化感受态细胞,获得重组腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO,经PacⅠ酶切后转染至293细胞进行包装,制备重组腺病毒,扩增后进行病毒滴度测定及RT-PCR和Western blot鉴定。并转染至体外培养的螺旋神经元,免疫荧光检测及蛋白水平检测螺旋神经元中EPO表达。结果经KpnⅠ、HindⅢ酶切与测序鉴定显示,腺病毒载体pAdTrack-CMV-EPO构建成功,重组腺病毒AdEPO在293细胞中成功包装,扩增后病毒滴度为1.17×1011U/ml;经RT-PCR和Western blot检测EPO在293细胞中成功表达。重组腺病毒载体AdEPO经鉴定均构建正确;免疫荧光及Western blot检测转染腺病毒后螺旋神经元中EPO表达显著增强。结论成功构建了EPO重组腺病毒载体,并成功转染螺旋神经元,可显著增强螺旋神经元中EPO表达水平。     

小鼠树突状细胞相关C型凝集素-1基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的树突状细胞相关C型凝集素-1(dendritic cell-associated C-type lectin-1,Dectin-1)是介导抗真菌天然免疫的重要受体之一。文中旨在构建表达小鼠Dectin-1基因的重组腺病毒载体,扩增、纯化获得高浓度的重组腺病毒。方法将PCR扩增的目的片段CLEC7A-p IRES2-EGFP重组到中间载体p DONR221上,再与腺病毒骨架质粒p AD/CMV/V5-DEST重组,获得重组腺病毒质粒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP,经Pac I线性化后转染人胚肾293(HEK293)细胞,收获重组腺病毒p AD-CLEC7A-p IRES2-EGFP;利用HEK293细胞大量扩增腺病毒;并进行重组腺病毒的滴度测定;用荧光显微镜和实时荧光定量PCR鉴定转染重组腺病毒组(Dectin-1基因重组腺病毒转染HEK293细胞)和转染空病毒组(空病毒转染HEK293细胞)中Dectin-1基因的表达。结果菌落PCR鉴定、酶切鉴定及测序结果均显示重组腺病毒含有Dectin-1基因,腺病毒滴度为5×1011IU/m L,荧光显微镜下可见绿色荧光,PCR检测到转染重组腺病毒组Dectin-1表达量是转染空病毒组的8677.25倍。结论成功构建并获得了较高浓度的Dectin-1基因重组腺病毒载体,为下一步体内外研究Dectin-1高表达在宿主抗真菌天然免疫中的作用奠定基础。     

加温对小白鼠染色体影响的研究

加温是一种对放疗中射线抵抗性细胞增敏的有效方法。加温是否对机体有损伤目前很少有人探讨。本文利用微波辐射、恒温水浴为热源对小白鼠加温,观察细胞染色体的改变,判定热疗过程对机体的损伤。     

100例子宫肌瘤与子宫腺肌病的B超图像分析

目的 探讨子宫肌瘤与子宫腺肌病Ｂ超图像特征及其鉴别诊断。方法 常规Ｂ超检查,并将子宫肌瘤子宫腺肌病两组Ｂ超图像进行比较分析。结果 ４７例肌瘤（９４．０％）有假包膜或界限清楚,。２８例腺肌病（９３．３％）界限欠清;４１例肌瘤（８２．０％）探及栅栏样图像和后方回声衰减仅各有２例（６．６７％）、１８例（６０．０％）呈高回声,两者比较差异有显著性（Ｐ〈０．０１,〈０．０５）。结论：Ｂ超对子宫肌瘤和腺肌病的     

伤立效总提取物对小白鼠骨骼肌微循环障碍的影响

实验表明,伤立效对肾上腺素所致的小白鼠骨骼肌微循环障碍具有扩张微血管口径、加快微血管的血流速度、增加血流量的作用,实验组与对照组比较,各项指标差异均非常显著(P<0.01)。     

鼻咽癌放疗后复发因素分析（附30例报告）

本文总结了1988－1993年30例鼻咽癌放疗后复发因素，包括剂量因素，边缘因素，病情估计不足及设野不合理等，其中病情估计不足造成的复发，占33．3％（10／30），克服病情估计不足，改进放疗设野布局，有进一步提高鼻咽癌的治愈率和降低复发率的可能，CT检查应列为鼻咽癌的常规检查。     

外阴部血管瘤21例治疗分析

目的：探讨女性外阴血管瘤的治疗方法及时机。方法：对1994-1999年收治的14例女性外阴部血管瘤和7例海绵状血管瘤，分别采用平阳霉素局部注射和手术切除治疗。结果：毛细血管瘤全部治愈，海绵状血管瘤复发率为28.6%(2/7)，1例出现部分皮拉坏死并发症。结论：女性外阴部毛细血管瘤不宜在观察中等其自然消退，应积极采用平阳霉素瘤内注射治疗，海绵状血管瘤单纯用平阳霉素注射治疗效果不佳，宜采用手术切除。     

胃去门静脉循环断流术犬模型的建立

目的设计胃去门静脉循环断流术的方法 ,并建立胃去门静脉循环断流术犬模型。方法应用缩窄门静脉主干1/2加丝线慢性栓塞术制作犬肝前型门静脉高压食管静脉曲张模型。然后,实施胃去门静脉循环断流术,即行脾切除后,保留贲门周围血管、食管曲张静脉及迷走神经,从根部离断胃冠状静脉等汇入门静脉系统的胃静脉血管,使胃的静脉血流经门奇间的交通支血管进入体循环。将已形成肝前型门静脉高压食管静脉曲张犬12只随机分为脾切除组、贲门周围血管离断术组、胃去门静脉循环断流术组。于开腹后、手术后即刻及术后3周末测量门静脉及食管曲张静脉压力。术前及术后3周末测定肝功能指标。结果犬模型均存活。手术后即刻及术后3周末与开腹后相比,胃去门静脉循环断流术组门静脉压力显著下降(F=7.386,q=3.503、3.121,P<0.05);食管曲张静脉压力亦显著下降(F=8.026,q=3.661、3.240,P<0.05)。手术前后肝功能指标变化不明显(t=0.268～1.325,P>0.05)。结论胃去门静脉循环断流术犬模型存活率高,制作方法简单易行,模型质量可靠,有助于研究胃去门静脉循环断流术对门静脉血流动力学参数的影响。     

手术治疗甲状腺机能亢进93例临床分析

目的：探讨我院所作甲状腺机能亢进的甲状腺次全切除术病例的经验教训。方法：将本院28年来外科施行的93例甲亢的甲状腺次全切除术病例资料进行回顾性分析。结果：男8例,女85例,发病年龄男15～56岁,平均36岁;女16～70岁,平均34岁。肿块大小为3～20厘米,16厘米以上占77.42%,病理诊断：弥漫性毒性甲状腺肿92例,双侧结节性毒性甲状腺肿1例。基础代谢率27%～73%,平均46.3%。心电图异常50例占53.76%。术后1例并发甲亢危象,1例并发甲低,房室传导阻滞,均痊愈出院。结论：甲亢的甲状腺次全切除术效果可靠,优于药物治疗,并发症少,术前准备要仔细充分,术中操作要细致,严防并发症的发生,特别是甲低、甲亢危象,旁腺和神经损伤的发生。     

不同冷冻时间对兔角膜膨胀率的影响

对不同冷冻时间（２０ｓ和３ｍｉｎ）及不同方法保存的兔角膜膨胀率进行了测定。结果冷冻２０ｓ及３ｍｉｎ，新鲜角膜组膨胀率（％）分别为２９．４５±１．９，４９．７４±１．６（Ｐ＜０．０５）；冷冻保存组为３１．６５±０．８及５４．６７±２．７（Ｐ＜０．０５）；干燥保存组为７３．８２±７．７及８６．０９±１．３（Ｐ＜０．０５）。干燥保存组角膜膨胀率与新鲜组及冷冻保存组差异均有显著性（Ｐ＜０．０１）。提示在角膜组织镜片加工时，应考虑不同保存方法和不同冷冻时间所造成的不同膨胀率对其厚度的影响，从而减少镜片加工时的屈光度误差。     

手术治疗支气管类癌30例临床观察

目的分析支气管类癌的临床特征,探讨手术治疗的方法和影响预后的因素。方法进行回顾性分析经手术切除的30例支气管类癌病的影像学特征、临床表现及影响预后的因素。结果术后病理证实,21例为典型支气管类癌,9例为非典型支气管类癌;手术治疗后21例病人存活超过5年,其中10例超过10年;4例3年内死于肝脑转移,5例术后不足5年,仍健在。结论相对于其他类型的肺癌,支气管类癌具有良好的生物学特性及预后。手术是治疗支气管类癌的主要方法,远处转移是影响预后的主要因素。     

甲状腺癌28例误诊原因分析

甲状腺癌误诊的常见原因是对其发病特点认识不足,术前临床资料不■实,术中处理不够慎重。为减少临床误诊应采取综合措施。包括提高对此病诊断的警惕性,认真行颈部触诊,综合分析各项检查结果,依靠穿刺细胞学检查和术中冰冻切片以及石蜡块组织学检查而最后确诊。