江苏省2012年柯萨奇病毒B组3型分离株全基因序列分析

目的探讨2012年江苏省手足口病（HFMD）患者临床样本中分离得到的3株柯萨奇病毒B组3型（CVB3）病毒的全基因序列特点。方法采集江苏省东海县和邳州市2012年HFMD患儿的咽拭子或肛拭子样本16份,经Vero细胞分离培养得到3株CVB3病毒,利用RT-PCR扩增CVB3全长基因。利用DNAStar软件包的MegAlign进行核苷酸序列分析,构建系统进化树,并对CVB3的毒力位点进行比较。结果扩增得到覆盖CVB3全基因组的3个片段,拼接后为CVB3全基因组,分别命名为DH09Y/JS/2012、DH16G/JS/2012和PZ23Y/JS/2012。同源性分析结果显示,该3株分离株之间同源性为87.6%~98.9%,与原型株（Nancy）的核苷酸同源性分别为80.5%、80.4%和81.2%。3个毒株均属于D2亚型。邳州市分离株和东海县2株毒株VP1区的同源性为91.8%~92.3%,分属于D2a和D2b两个不同分支。3株分离株除5′UTR的GUAA/GCAA模序和VP2的151位氨基酸外,其余毒力位点与近年引起心肌炎、无菌性脑膜炎等重症CVB3流行株一致。结论引起2012年江苏省HFMD的CVB3为D2亚型,不同地区流行D2a和D2b两个分支,此次分离株主要毒力位点与近年来CVB3流行株一致。     

一株柯萨奇病毒B组5 型(Cox.B5) 病毒的分离及VP1基因分析

目的研究2009年昆明市无菌性脑膜炎的病原柯萨奇B5(coxsackie virus B5,CVB5)分离株(KMA193-09)的VP1基因特征。方法采用RD细胞、Hep-2细胞对患者粪便标本进行病毒分离,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒VP1基因并进行序列测定,用Mega 4.0等软件分析处理。结果从无菌性脑膜炎患者粪便标本中,分离到CVB5,其VP1区的核苷酸长度均为831bp,未发现核苷酸插入与丢失。与浙江COXB5/ZHEJIANG/12/02(CFS)株、山东02336/SD/CHN/2002/CB5株及浙江COXB5/ZHEJIANG/13/02株氨基酸同源性最高为98.19%,与国外毒株的同源性为95.67%～97.83%。在进化树上与YZ081/SD/CHN/2005/CB5株显示在同一个分支上。结论分离的肠道病毒为柯萨奇病毒B组5型(CVB5),分离株(KMA193-09)VP1区变异较小。     

东莞市2015—2016年柯萨奇病毒A6型流行情况及特征分析

目的 研究东莞市2015—2016年手足口病(HFMD)病例中柯萨奇病毒A6型(CVA6)的流行情况及基因特征。方法 采用RT-PCR方法对HFMD疑似病例标本进行检测,CVA6阳性标本上送广东省疾病预防控制中心,进行病毒分离及鉴定,扩增并测定VP1基因序列。从GenBank中选取其他CVA6代表株进行参考比对,利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega4.0.2软件构建亲缘性进化树。结果 在1 145份标本中检出CVA6阳性标本580份,阳性率为50.66%(580/1 145)。序列比对显示,20株CVA6分离株VP1基因之间核苷酸同源性为93.6%~100.0%,氨基酸同源性为97.7%~100.0%。东莞市CVA6分离株VP1与近年来全球各地流行株核苷酸和氨基酸的同源性分别为93.4%~98.5%和97.0%~99.7%,与CVA6原型株Gdula以及我国山东省1996年分离株核苷酸和氨基酸相似性仅为82.5%~85.8%和94.1%~96.4%。系统进化树分析显示,2015—2016年东莞地区CVA6与近年来流行于世界各地的CVA6分离株同源性较高,而与原型株进化距离较远。结论 2015—2016年东莞市HFMD病原以CVA6为主,流行株为近年来流行于全国各地的CVA6新变种。     

河南省柯萨奇病毒A组16型VP4基因特征分析

目的分析河南省手足口病标本分离柯萨奇病毒A组16型(coxsachievirus A 16,CVA16)VP4的基因特征,并比较VP4与VP1遗传进化分析的差异。方法对分离自河南省手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)患儿的8株CVA16,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行VP4区域扩增并对扩增产物进行测序,用分子生物学软件ATGC进行序列拼接,Bioedit比对剪齐,用MEGA 4.0软件进行同源性分析,并与已报道的CVA16标准株序列构建基因进化树。结果河南省8株毒株VP4核苷酸同源性为91.3%~98.1%、氨基酸同源性为100.0%,与国际原型株CA16/G10/RSA/1951(A型)比对,VP4核苷酸同源性为79.7%~82.6%,氨基酸同源性为100.0%;与B1a、B1b和B2型代表株核苷酸同源性分别为92.3%~95.7%、92.8%~98.6%、88.9%~91.8%,氨基酸同源性均为100.0%。河南省分离的CVA16毒株均属于B1亚型,有B1a和B1b两个进化支共同存在和循环,但VP4与VP1的进化树分型不完全一致。结论 VP4基因不能作为CVA16病毒基因亚型分型的依据。     

一株引起无菌性脑膜脑炎柯萨奇B组3型病毒的分离和VP1基因分析

目的对一株从无菌性脑膜脑炎患者中分离到的柯萨奇B组3型病毒(coxsackie virus B3,CVB3)分离株KMA103-09进行VP1区的基因特征分析。方法采用Hep-2、RD细胞对患者粪便标本进行病毒分离,肠道病毒组合血清进行鉴别,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增病毒目的片段,测序后进行VP1基因分析,用Mega4.1等软件分析处理。结果肠道病毒组合血清鉴别为柯萨奇病毒B组3型(Cox.B3),从病毒性脑膜脑炎患者粪便标本中,分离到CVB3,其VP1区的核苷酸长度为849bp,未发现核苷酸插入与丢失。与山东04433/SD/CHN/2004/CB3株、山东05280/SD/CHN/2005/CB3株及山东YZ127/SD/CHN/2005/CB3株氨基酸同源,与其余国内分离株同源性高于为99.29%,与国外毒株的同源性为95.41%~96.47%。在进化树上与AM06HZ/SD/CHN/2006/CB3株显示在同一个分支上。结论分离的肠道病毒为柯萨奇病毒B组3型(Cox.B3),分离株(KMA103-09)VP1区变异较小。     

江苏省2012年柯萨奇病毒A组16型基因特征分析

目的:了解江苏省2012年柯萨奇病毒A组16型(CA16)分离株VP1区基因特征?方法:选取江苏省2012年14株CA16病毒分离株,用1对特异性引物进行VP1区核苷酸序列扩增,对扩增产物进行测序,利用生物信息学软件对序列进行分析,结果与CA16参考株序列进行同源性比较并构建基因进化树?结果:14株CA16分离株VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为90.5%~100.0%和98.7%~100.0%,与CA16国际标准株G10的核苷酸和氨基酸同源性分别为75.5%~76.7%和91.6%~92.3%?江苏省2012年的CA16分离株全部属于B1基因亚型,同时包含B1a 和B1b 两条进化分支?结论:江苏省2012年有CA16病毒的B1a与B1b两种进化分支共同存在与循环,且呈现以B1b基因亚型为优势型别?B1a基因亚型为辅助型别的传播模式;无论是优势型别还是辅助型别,均各自呈现密切的亲缘关系?     

广东省东莞市2017-2018年登革病毒E基因进化分析

目的 测定广东省东莞市2017—2018年Ⅰ~Ⅳ型登革病毒（DENV-1~DENV-4）的E基因序列,分析其系统进化情况及流行基因亚型,从分子水平探讨病毒来源。方法 收集东莞市2017—2018年140例可疑登革热患者急性期血清,用实时荧光PCR方法检测病毒核酸,阳性血清用C6/36细胞分离培养登革病毒,测定分离株E基因序列,绘制系统进化树,结合流行病学资料进行分子流行病学分析。结果 140份急性期血清中DENV核酸阳性54份,阳性率38.6%,DENV-1阳性占53.7%。分离得到17株毒株。序列比对和系统进化分析显示,10株DENV-1分离株间核苷酸同源性为90.0%~99.9%,氨基酸同源性为96.6%~99.8%,分属基因Ⅰ型和基因Ⅴ型。7株基因Ⅰ型分离株与泰国2015年、缅甸2015年、中山2015年及越南2016年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.9%),其中2018年本地株D2018078与2017年输入株D2017008核苷酸同源性达99.8%;3株基因Ⅴ型分离株与印度2014年、2017年株及新加坡2014年流行株核苷酸同源性较高(97.7%~99.1%)。4株DENV-2分离株间核苷酸同源性为91.0%~98.6%,推导氨基酸同源性为97.6%~99.8%,分属混合型和亚洲Ⅰ型,2株混合型分离株与马来西亚2014年、台湾2015年流行株核苷酸同源性较高(99.6%~99.7%);2株亚洲Ⅰ型分离株分别与越南2015年、泰国2011年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.5%)。2株DENV-3分离株间核苷酸同源性为98.4%,氨基酸同源性为99.4%,均属基因Ⅰ型,与缅甸2017年、马来西亚2015年流行株核苷酸同源性较高(99.3%~99.7%)。1株DENV-4分离株与越南2013、2016年流行株同源性较高(99.3%~99.5%),属基因Ⅰ型。结论 2017—2018年东莞市登革热的病原体主要为DENV-1,其次是DENV-2,各至少有2种基因亚型同时在流行;DENV-3和DENV-4各至少有1种基因亚型在流行。流行方式主要为南亚和东南亚国家及我国中山、台湾等地输入病例引起的本地暴发流行,存在输入引起本地感染的风险。     

河南省2010年柯萨奇病毒A组16型VP1区基因特征分析

目的了解河南省2010年柯萨奇病毒A组16型(CA16)流行株VP1区基因特征。方法对河南省2010年手足口病(HFMD)粪便和咽拭子样品中分离到的10株CA16病毒,采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行VP1编码区基因扩增,对扩增产物进行测序,利用生物信息学软件对序列分析,与已报道的CA16标准株序列构建基因亲缘关系树。结果 10株CA16毒株,其VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为90.9%~100.0%,99.3%~100.0%,与国际CA16标准株G10在VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为67.0%~69.0%,72.0%~74.0%。亲缘进化树显示全部CA16株可分为A和B两个基因型,B基因型又可分为B1和B2两个基因亚型。河南省分离的CA16毒株全部属于B1基因亚型,同时包含B1a和B1b两条进化分支在河南省共同流行。结论河南省手足口病感染CA16病毒的流行株属B1基因亚型,有B1a和B1b两个进化分支共同进化和循环。     

惠州市重症手足口病病原谱及EV71型VP1区基因特征分析

目的分析惠州市手足口病重症病例的病原谱构成,了解惠州市肠道病毒71型分离株的VP1区基因特征,为科学防治手足口病提供科学依据。方法采集300例重症手足口病(HFMD)患者标本,采用实时荧光RT-PCR检测肠道病毒核酸,并对肠道病毒71型(EV71)和柯萨奇病毒A16型(CoxA16)进行分型检测;选择8株EV71分离株进行VP1区基因全长序列测定,测序结果利用DNASTAR软件进行核苷酸、氨基酸序列分析和同源性比较,并用Mega5.0软件构建亲缘性进化树。结果通过实时荧光RT-PCR特异性检测,EV71阳性结果 154份,阳性率为51.33%;CoxA16阳性结果 38份,阳性率为12.67%。测序结果表明,8株EV71之间的VP1基因核苷酸同源性为96.9%~99.2%,氨基酸同源性为99.3%~100%。VP1区基因遗传进化分析表明,8株EV71分离株与C4基因亚型的代表株处于同一分支,均属于C4基因亚型的C4a进化分支。结论惠州市手足口病疫情主要病原EV71病毒均属于C4a基因亚型,与2004年以来的中国大陆EV71病毒流行的基因型一致,未产生明显的抗原漂移及变异。     

基于网络药理学探讨独活-羌活-细辛治疗膝骨关节炎的作用机制*

目的 基于网络药理学的方法分析和预测独活-羌活-细辛治疗膝骨关节炎可能的作用机制。方法 利用TCMSP数据库获取独活、羌活、细辛的活性成分及靶点,与CTD、NCBI等数据库获取的膝骨关节炎疾病基因靶点映射,构建药物-活性成分-疾病靶点网络。进行MCODE聚类分析,通过Omicshare云平台和DAVID数据库GO、KEGG通路富集分析。结果 从3味药中共筛选出了36个活性成分及205个靶点,主要有山柰酚、 β-谷甾醇、芝麻脂素、异紫花前胡苷等关键成分,AKT1、ESR1、JUN、CASP3等为关键靶点,核心基因有NOS3、ESR1、COX1、NR1I2,关键的生物进程和通路有类固醇激素反应性、活性氧代谢过程、AGE-RAGE通路和TNF通路。结论 独活-羌活-细辛可能通过多成分、多靶点网络来治疗膝骨关节炎。     

信号通路分子、乳头状甲状腺癌基因、锌指转录因子在不同宫颈疾病中的表达

目的：研究信号通路分子（SHH）、乳头状甲状腺癌基因（PTC1）、锌指转录因子（GLI1）在宫颈上皮内瘤变CIN1、CIN2、CIN3中的表达,探讨SHH、PTC1、GLI1在宫颈癌发生发展中的作用。方法：应用免疫组织化学方法将150例患有宫颈疾病的患者分为正常宫颈上皮组、CIN1组、CIN2组、CIN3组及宫颈癌组,每组各30例。对以上5组进行PTC1、GLI1、SHH检测。结果：SHH主要表达于腺体细胞的胞浆内,在各组的阳性表达率分别为：正常宫颈上皮组13.3%、CIN1组40.0%、CIN2组63.3%、CIN3组83.3%及宫颈癌组93.3%,且强阳性率随阳性率增高而明显增高。PTC1、GLI1在胞质及胞膜上阳性染色多呈弥漫状分布。PTC1在各组的阳性表达率分别为：正常宫颈上皮组23.3%、CIN1组40.0%、CIN2组43.3%、CIN3组63.3%及宫颈癌组73.3%。GLI1在各组的阳性表达率分别为：正常宫颈上皮组10.0%、CIN1组16.7%、CIN2组26.7%、CIN3组50.0%及宫颈癌组56.7%。结论：SHH、PTC1、GLI1介导着多种死亡受体诱导的细胞凋亡信号传导通路,与宫颈癌的癌前病变过程密切相关。     

不同种植方法下红托竹荪产量与综合评价

目的 在昭通小草坝通过比较贵州织金和福建古田红托竹荪菌种,使用同菌种,不同的种植方法和原料对红托竹荪的产量数值进行比较。方法 将荫棚分为22块试验地,其中1～10号及21号试验地为福建古田红托竹荪菌种,11～20号及22号试验地为贵州织金红托竹荪菌种,分别对不同的试验地采用不同的种植方法和原料。结果 贵州织金竹荪菌种产量占比为63%,福建古田竹荪菌种产量占比为37%。相同气候和菌种条件下,贵州织金种植方法产量占比为25.83%,菌棒覆土产量占比7.77%。贵州织金红托竹荪菌种在贵州织金种植方法下产量占比为29.20%,菌棒覆土产量占比为7.96%。结论 基于小草坝气候条件下,采用贵州织金红托竹荪菌种,使用贵州织金种植方法下产量最佳,收益最大。     

建立BioID-质谱联用技术筛选细胞内的蛋白互作

目的 通过BioID-质谱联用建立一种新的蛋白相互作用的筛选系统;通过免疫共沉淀-Western blot验证YAP1相互作用的蛋白。 方法 构建BirA*-YAP1融合表达质粒;将质粒转染进293T细胞后,在细胞培养液中加入生物素,继续培养24小时后,提取细胞总蛋白。利用YAP1特异抗体,通过Western Blot检测BirA*-YAP1融合蛋白的表达;通过HRP-亲和素,检测细胞内蛋白被生物素标记的水平;通过亲和素磁珠,对细胞内生物素化的蛋白进行亲和纯化,并多次洗涤亲和素磁珠上非特异性结合的蛋白后,对亲和素磁珠纯化的蛋白进行溶解。取40 μg总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳,通过蛋白银染试剂盒对PAGE凝胶中的蛋白进行染色,确定亲和素磁珠对生物素化蛋白的纯化效果。通过Label-free质谱法对生物素化的蛋白进行鉴定。针对鉴定得到的蛋白,通过Western Blot对生物素化的SMAD3进行验证。通过YAP1的免疫共沉淀,确定SMAD3能与YAP1相互作用。 结果 成功构建BirA*-YAP1融合表达质粒,该质粒在293T细胞中能够高效表达融合蛋白;在生物素存在的情况下,BirA*-YAP1融合蛋白能够利用生物素标记细胞内与BirA*-YAP1融合蛋白相互靠近的蛋白。在细胞裂解后,这些在细胞内被生物素标记的蛋白,能够被偶联亲和素的磁珠纯化,经过多次洗涤,能够富集生物素标记的蛋白。通过质谱鉴定,我们能够获得在细胞内与YAP1在空间上相互靠近的蛋白类型。通过免疫共沉淀-Western Blot技术,我们证明SMAD3能够与YAP1相互作用。 结论 Bio-ID-质谱联用的方法是一种用于蛋白互作筛选的简单、高效的技术,与后续的免疫共沉淀-Western Blot联合使用,可以成为一种新的蛋白互作研究体系。     

长链非编码RNA APTR、HEIH、FAS-ASA1、FAM83H-AS1、DICER1-AS1、PR-lncRNA在肺癌中的表达

  目的  探讨长链非编码RNA（Long non-coding RNA,IncRNA）APTR、HEIH、FAS-ASA1、FAM83H-AS1、DICER1-AS1、PR-lncRNA在肺癌患者中的表达。  方法  收集昆明医科大学第三附属医院肺癌手术患者的癌组织,癌旁正常组织及肺癌淋巴结转移组织,利用TRI z o l提取总 RNA,再用SYBR Green实时荧光定量 PCR检测每种基因的RNA相对表达量。  结果  APTR在淋巴组织中表达升高（P < 0.05）,HEIH在淋巴组织中表达下降（P < 0.05）,FAM83H-AS1和、PR-lncRNA在肺癌组织中表达升高（P < 0.05）。  结论  APTR在淋巴组织中高表达,可能有促进肺癌淋巴结转移的作用;FAM83H-AS1及PR-lncRNA癌组织中表达上调,可能会促进肺癌的发生发展。     

肾上腺大结节样增生一例报道

库欣综合征（CS）中15%～20%是由肾上腺原因引起的,其中约10%的患者具有双侧肾上腺增生。肾上腺性CS中皮质醇分泌有时可受肾上腺异常膜受体（包括抑胃肽受体、精氨酸加压素受体、儿茶酚胺类受体、LH/hCG受体和5-羟色胺受体等）的调节。该文报道了1例促肾上腺皮质激素非依赖性大结节样肾上腺增生引起的CS患者,并通过体内试验证实了肾上腺异常膜受体的存在。     

电针风池穴对颈性高血压模型兔血清肾素-血管紧张素-醛固酮系统指标的影响

目的:探讨电针风池穴对颈性高血压模型兔血清肾素-血管紧张素-醛固酮系统( RAAS)指标影响,明确其作用机理。方法:建立颈性高血压模型,将造模成功的12只家兔按随机数字表法分为模型组和电针组,每组6只,另选取6只健康家兔作为正常组。对电针组实验兔给予电针风池穴治疗,模型组和正常组实验兔仅给予相同时间的固定。检测各组实验兔血清血管紧张素原(AGT)、血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)、醛固酮(ALD)及去甲肾上腺素(NE)水平,检测并计算各组实验兔治疗前后平均动脉血压(MAP),进行统计分析。结果:(1)与正常组实验兔比较,模型组实验兔血清中AGT(126.82±43.95)、ALD(160.07±38.14)及NE(32.34±12.49)含量均明显高于正常组(P＜0.01,P＜0.05,P＜0.05),而模型组实验兔血清Ang II(118.67±45.62)水平与正常组比较无明显差异(P＞0.05);电针组实验兔血清中Ang Ⅱ(91.53±17.53)、AGT(95.12±26.18)、NE(23.89±8.71)及ALD(116.32±36.86)水平与正常组比较均无明显差异(P＞0.05);与模型组实验兔ALD(160.07±38.14)比较,电针组实验兔ALD(116.32±36.86)水平明显低于模型组。(2)治疗前各组实验兔MAP之间均无明显差异(P＞0.05);治疗结束后,与模型组实验兔MAP(91.50±6.86)比较,电针组实验兔MAP(81.40±4.04)出现明显降低(P＜0.05);与治疗前比较,电针组实验兔治疗后MAP(81.40±4.04)较治疗前MAP(89.40±6.19)明显降低(P＜0.05);而正常组、模型组MAP治疗后较治疗前MAP均无明显差异(P＞0.05)。结论:电针风池穴可有效改善颈性高血压模型兔血压,其降压作用可能与调控血清RAAS系统,降低实验兔血清中ALD含量,防止AGT、Ang II及NE过度分泌等存在关联。     

Common polymorphisms in GSTM1, GSTT1, GSTP1, GSTA1 and susceptibility to colorectal cancer in the Central European population

Background

Central Europe presents with the highest incidence of sporadic colorectal cancer (CRC) worldwide. As sporadic CRC represents a typical multifactorial disease, it is characterized by intense interaction of the genetic background with the environment. Glutathione S-transferases could act as attractive susceptibility genes for CRC, as they are directly involved in conjugation between glutathione and chemotherapeutics, environmental pollutants and a wide spectrum of xenobiotics.

Methods

In this study, we investigated associations of polymorphisms in glutathione S-transferases (GSTs) genes, that is GSTA1, GSTT1, GSTM1 and GSTP1, with CRC in a total of 197 cases and 218 controls originating from the Czech Central European population. Polymorphisms were assessed by polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism-based methods, allele-specific multiplex and allelic discrimination by real-time polymerase chain reaction.

Results

None of investigated polymorphisms showed any associations with CRC, with the exception of GSTP1; where the heterozygote genotype Ile105Val was associated with decreased risk of CRC (P = 0.043).

Conclusions

The frequencies observed in our study are in accordance with those from other European Caucasian populations. Based on our studies, examined variability in GST genes is not a major determinant of CRC susceptibility in the Central European population.     

应用多重PCR技术同时分析GSTM 1,GSTT 1,GSTP 1基因型

[目的]探讨同时分析GSTM1，GSTT1，GSTP1基因分型的简捷、快速且准确的方法，[方法]利用GSTM1，GSTT1基因扩增产物无BsmA Ⅰ酶切位点，GSTP1基因具有BsmA Ⅰ酶切位点的特点，采用多重PCR方法和限制性片段长度多态性技术，同时对GSTM1，GSTT1，GSTP1基因进行分型，并分别与普通PCR技术的分型结果进行比较。[结果]多重PCR技术基因分型结果与普通PCR方法完全一致，300名韩国大学生的血样分型结果示GSTM1基因缺失型占53．3％，GSTT1基因缺失型占54．7％，GSTP1基因型为lie／Ile型占62．0％，Iie／Val型占34．3％，Val／Val型占3．7％，I1e基因出现频率为79．2％，Val为20．8％。[结论]多重PCR技术可用于N时分析GSTM1，GSTT1，GSTP1基因分型。