皮下恶丝虫病1例

<正> 恶丝虫病是一种人畜共患的寄生虫病。文献记载可在人体寄生的恶丝虫属线虫有犬恶丝虫Drofilaria immitis结膜恶丝虫D.conjunctive、匐行恶丝虫,D.repens和纤细恶丝虫。我国1980年黄舜毅等首次发现了匐行恶丝虫人眼部寄生的病例。本例为黑龙江省第二例恶丝虫感染病例。现介绍如下。 (一)病例简介 患者男性,66岁,农工,现住鹤立河农场。自诉1981年11月发现头顶部左侧有一玉米粒大结节,局部     

多聚酶链反应检测肺炎病人尿样及血清中军团菌DNA

现行的军团菌检测直接荧光测定法(DFA)敏感性差,痰培养耗时长仅能做回顾性诊断。作者用多聚酶链式反应(PCR)法,设计了一对20-mer引物L5SL9(5′-ACTATAGCGATTTGGAA-3′)和L5SR93(5′-GCGATGACCTACTTTCACAT-3′)扩增55rRNA基因编码区104bp片段,首次快速检测出肺炎病     

土库曼居民中首次发现匐行恶丝虫

恶丝虫病是由恶丝虫属的两种丝虫——犬恶丝虫与匐行恶丝虫引起的。成虫通常寄生在眼部、臀部及胸肌的蜂窝组织内,成熟或未成熟的微丝蚴寄生在血液中。中间宿主及传播媒介为库蚊属及按蚊属的蚊种,终宿主     

应用PCR技术早期诊断白色念珠菌菌血症

念珠菌是医院感染常见的病原菌,据Fraser等报道,1988～1989年比1976～1979年念珠菌血症发病率增加20倍,死亡率为60％。念珠菌引起的感染中,白色念珠菌(简称白念)居首位,可达50％以上。迄今,系统性念珠菌菌血症的诊断仍很困难,血培养耗时长且检出率低(34％)。本实验室较早开展PCR技术检测念珠菌的研究,本文在此基础上将PCR技术用于临床白念菌血症的诊断。本研究使用的引物1:5′-CATAACTCAATATGGCTATT-3′,引物2:5′-CTTTTGACGACATGATTCGA-3′。研究表明DNA扩增具有特异性,不扩增细菌(如金黄     

淋巴丝虫病的抗原血症

犬恶丝虫病的丝虫抗原血症研究结果提示,抗原检测应用于人体丝虫病诊断的可能性。以对热稳定犬恶丝虫成虫产物为靶抗原的McAb进行酶免疫试验(EIA)检测狗血清中丝虫抗原,对犬恶丝虫感染具有特异性,     

ACT1-qPCR定量分析弓形虫内参引物的筛选与鉴定

目的运用PCR对刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH、PRU、VEG株速殖子和HFF、Vero细胞系以及SPF级昆明鼠脑组织所得DNA样品进行特异性扩增,鉴定并筛选出适合用作弓形虫实时荧光定量PCR(q PCR)分析的内参引物。方法体外培养并无菌收集HFF、Vero细胞系及弓形虫RH、PRU、VEG株速殖子,SPF级昆明鼠经颈椎脱臼处死无菌采集脑组织,并提取基因组DNA。合成弓形虫MIC6基因(Toxo DB:TGME49_218520)特异性引物P1/P2,经PCR扩增鉴定所得样品是否含有弓形虫DNA成分,设空白对照。依照Toxo DB数据库弓形虫ACT1基因参考序列(Toxo DB:TGME49_209030)设计引物,经NCBI Primer-BLAST比对分析后进行合成特异性引物P3/P4、P5/P6、P7/P8、P9/P10和P11/P12,预期片段大小均为121 bp。以弓形虫RH DNA为模板,采用梯度PCR优化ACT1基因内参引物的退火温度。运用已优化条件对待检DNA样品进行PCR特异性扩增和琼脂糖凝胶电泳分析,鉴定出适合用于弓形虫q PCR定量分析的内参引物。结果 PCR扩增弓形虫RH、PRU和VEG株DNA MIC6基因时均出现一条长度约为1 050 bp的条带,且空白对照和其他样品无此条带,与预期结果一致,表明所得DNA样品可用。优化退火温度时发现,除P7/P8外其他引物均不受退火温度影响,56℃适合用于PCR或q PCR扩增ACT1基因目的片段的退火温度。以56℃为退火温度对待检DNA进行检测时发现,扩增弓形虫阳性样品时所有引物均能产生1条大小约为121 bp的条带,空白对照无此条带,与预期结果一致。此外,引物P7/P8、P9/P10扩增Vero细胞系和引物P3/P4、P5/P6、P9/P10扩增昆明鼠脑组织DNA样品时均有杂带出现,且有杂带大小约为121 bp;引物P11/P12扩增弓形虫阴性DNA样品时均无杂带出现。结论引物P11(5′-TCGGTGACGAAGCCCAAA-3′)和P12(5′-AGTTCGTTGTAGAAGGTGTGA-3′)适合分别用作弓形虫q PCR定量分析时扩增ACT1靶基因的上游和下游引物。     

鉴别布鲁属、吴策属、犬恶丝虫和Breinlia属微丝蚴的组织化学方法

从实验感染匐行恶丝虫、彭亨丝虫或马来丝虫夜间周期型、亚周期型及白昼亚周期型的5只猫,分别取新鲜末梢血制成薄涂片,同样从自然感染犬恶丝虫的一只狗、感染Breinlia sergenti 的一只蜂猴、感染 Breinliabooliati 的一只大鼠以及感染马来亚班氏丝虫乡村株的一例病人取血制片,另外,还人为地制作混合血片(特别是马来丝虫3种不同株),便于进行细致、更准确的比较。血膜晾干,置水中脱血色素2分钟,晾干,在4C 纯     

四种腹腔丝虫与匐行恶丝虫各期幼虫形态的比较观察

本文报告叶氏腹腔丝虫与唇乳突腹腔丝虫各期幼虫的形态鉴别特征,两者感染期幼虫头端均有两圈小乳突,前者每圈为4个,后者内圈为6个、外圈4个;叶氏腹腔丝虫感染期幼虫尾端钝圆,末端有6个小乳突呈弧行分布,唇乳突腹腔丝虫尾端呈指状,末端有3个乳突成一横排。黎氏腹腔丝虫与马腹腔丝虫的感染期幼虫头端均有两圈小乳突,每圈为4个,前者尾端基部窄,延伸如柳叶状,3个乳突均呈球形;后者尾端圆锥状,末端1个乳突球形,亚末端2乳突仅稍突出于体壁。上述4种腹腔丝虫肛比率均小于3。首次描述我国匐行恶丝虫各期幼虫的形态,感染期幼虫3个尾端乳突呈球形,互相靠近,肛比率小于2。     

用种特异的DNA探针鉴别蚊媒体内的马来丝虫

对蚊媒体内的丝虫感染性幼虫进行定量,是评价丝虫病防治效果的最好方法。然而,在同一地区的人丝虫和动物丝虫,可通过同种蚊媒传播,若以生化学或形态学方法区分这些感染性幼虫,又往往不大可能。为此,作者采用种特异的马来丝虫DNA探针鉴别马来丝虫。作者分离了马来丝虫的8个地理株及帝汶丝虫、彭亨丝虫、匐行恶丝虫(D. repens)、部利丝虫(Breinlia booliti)、加里曼丹吴策线虫(W. Kalimantani)和心脏丝虫(Cardiofilaria Spp.),保种子沙鼠、猫、叶猴、猕猴、大鼠等动物体内,以东乡伊蚊叮咬这些动     

不稳定性心绞痛患者血浆组织因子途径抑制物水平及启动子-287T→C多态性分析

本研究对不稳定性心绞痛 (UA)患者血浆组织因子途径抑制物 (TFPI)的水平和TFPI 2 87T→C的基因多态性进行了观察 ,探讨TFPI在UA发病过程中所起的作用。1.方法 :选择UA患者 10 2例 (UA组 )和冠状动脉造影无狭窄者 10 0例 (对照组 )进行研究。ELISA法测定TFPI的血浆水平。采用酚抽提法提取全血基因组DNA ,根据TFPI基因序列 ,参考Dider等设计的引物 ,并加以修改 (5′ 端引物 :5′ GAATTCAAATAAGGCTGCGTA 3′ ;3′ 端引物 :5′ GAGGGAGCCTCAGAGTCGGCTTC 3′)。于PCR仪内进行DNA中组织因子途径抑制物相应片…     

聚合酶链反应检测蚊体内马来丝虫幼虫的实验

目的　建立一种特异、灵敏和简捷的聚合酶链反应 (PCR)检测蚊体内马来丝虫幼虫的方法。方法　在应用一种新的模板纯化处理技术 (Microcon 10 0 )基础上 ,采用适应于检测我国马来丝虫的两套DNA扩增引物(P1、P2与P3、P4) ,对实验感染马来丝虫的中华按蚊进行扩增检测。结果　两套引物均可检出蚊体内不同发育期幼丝虫 (L1、L2 和L3) ,其灵敏度达 1只蚊体内 1/ 6 4条L1和 2 0 0只群体蚊中含有 1只感染蚊 (体内有 1条L3)的水平 ,而对犬恶丝虫及未感染蚊却不能扩增出特异条带。结论　初步建立特异、灵敏和简捷的PCR检测蚊体内马来丝虫幼虫的方法。     

疟原虫种属同检多重PCR方法的建立和应用

目的建立高效的疟原虫种属特异性检测方法。方法设计疟原虫种(核糖体18S rRNA,4对)和属(线粒体基因,1对)特异性引物,与通用引物(5′-CGAGTCCTGCGGTCTCAAATT-3′)连接后,形成5对嵌合特异性引物。常规PCR确定各对引物的最佳退火温度和引物浓度,多重PCR优化5对引物混合后的最佳反应条件,建立反应体系(命名为P5-mPCR方法)。用P5-mPCR检测不同原虫密度的间日疟原虫(Pv)、三日疟原虫(Pm)、卵形疟原虫(Po)、恶性疟原虫(Pf)感染者血样和模拟混合感染样品,确定P5-mPCR方法的检测灵敏度。用日本血吸虫、刚地弓形虫、杜氏利什曼原虫、猪囊尾蚴、卫氏并殖吸虫、隐孢子虫等其他寄生虫感染者血样或虫体DNA评价P5-mPCR方法的特异性。用212份疟疾送检血样,与巢式PCR方法比较评价其应用价值。结果优化后的P5-mPCR反应体系各组分含量(体积比)为:DNA模板10%、引物Mix 5%、dd H_2O 35%,Taq酶预混液50%。反应体系的最佳循环条件为:95℃ 5 min;94℃ 15 s,58℃ 20 s,72℃ 20 s,循环5次;94℃ 15 s,62℃ 20 s,72℃ 20 s,循环10次;94℃ 15 s,68℃ 20 s,72℃ 20 s,循环25次;72℃ 3 min;10℃ 5 min。扩增产物的长度分别为:Pv 778 bp,Pm 582 bp,Po 400 bp,Pf 256 bp,疟原虫属334 bp。其检测灵敏度分别为4.49、5.45、6.39、4.07个虫/μl血(种特异性检测平均值为4.85个虫/μl血)和0.10~1.07个虫/μl血(属特异性检测的平均值为0.41个虫/μl血)。P5-mPCR检测含有50~200个虫/μl血的模拟混合样品,各特异性扩增条带均清晰可见;检测日本血吸虫、刚地弓形虫、杜氏利什曼原虫、猪囊尾蚴、卫氏并殖吸虫、隐孢子虫等其他寄生虫样品,结果均为阴性。巢式PCR和P5-mPCR检测212份疟疾送检血样,两种方法检测结果的一致性较高(Kappa=0.866,P0.01),检出的阳性率分别为75.0%(159/212)和79.7%(169/212),差异具有统计学意义(χ~2=8.100,P0.01)。从分型诊断来看,两者的差异主要来源于Pf(P0.01)和Po(P0.05)样品,对Pv、Pm和混合感染血样的检测结果,两种方法差异无统计学意义。结论建立的P5-mPCR方法具有敏感性高,特异性好,操作简便快速,检测结果易于判断,一次反应即可确定4种人体疟原虫。     

一段检测锥虫特异性核酸靶序列的筛选及评价

目的以60S核糖体蛋白L44(60S RPL44)基因为靶基因,筛选出一段可特异性检测锥虫属(Trypanosoma)原虫的核酸靶序列,并对其敏感度和特异性进行初步评价。方法将布氏锥虫指名亚种(T.brucei brucei)的60S RPL44基因序列与公共数据库中田鼠巴贝虫(Babesia microti)、杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、恶性疟原虫(P.falciparum)和刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)等24种非锥虫属常见的血源性原虫,以及8种锥虫属内其他种的同源序列进行比对。同时,利用Primer Premier 6对布氏锥虫指名亚种的60S RPL44基因序列设计多对引物,结合序列比对结果和各引物评价情况,从中筛选出一对评价情况良好且理论上仅能扩增锥虫属靶序列的引物。利用该对引物检测布氏锥虫指名亚种、布氏锥虫罗德西亚种(T.b.rhodesiense)、刚果锥虫(T.congolense)、伊氏锥虫(T.evansi)以及上述5种其他属原虫,评价其特异性。采用梯度稀释(10 ng/μl、1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl)的伊氏锥虫基因组DNA为模板评价其敏感度。结果选出一段基于60S RPL44的特异性序列,针对该序列的扩增引物为P1:5′-CCTGATGAAAGGTGCAATG-3′,P2:5′-CGTTTTCGCCTTCTTGTGGA-3′。该引物扩增布氏锥虫指名亚种、布氏锥虫罗德西亚种、刚果锥虫、伊氏锥虫的DNA均为阳性,扩增片段长156 bp;扩增田鼠巴贝虫、杜氏利什曼原虫、间日疟原虫、恶性疟原虫、刚地弓形虫等非锥虫属原虫均为阴性;该引物检测伊氏锥虫DNA的敏感度为10 pg/μl。结论筛选获得一段敏感度较高、特异性强的检测锥虫属原虫的核酸靶标序列。     

1例误诊为疟疾的田鼠巴贝虫病患者的鉴别诊断

目的对1例误诊为疟疾的田鼠巴贝虫病患者进行鉴别诊断,并分析其临床诊治情况。方法收集患者的临床发病资料,对患者进行流行病学调查。采集患者血样,制作厚、薄血片,吉氏染色后镜检,并进行疟疾快速诊断试剂(RDT)检测。提取患者外周血DNA,以巴贝虫18S r RNA基因属、种特异性引物和恶性疟原虫核糖体RNA小亚基(SSU r RNA)基因特异性引物进行PCR扩增。结果该患者于2019年2月起,反复发热2月余,血常规白细胞、红细胞和血小板进行性下降,有中度贫血及脾肿大。流行病学调查结果显示,该患者无外出史。患者外周血的厚、薄涂片均可见大量似恶性疟原虫虫体,其外周血经疟疾快速诊断试剂检测呈阴性。患者血样DNA经PCR扩增后,可获得长度约400 bp和1 600 bp的巴贝虫属、田鼠巴贝虫种特异性阳性条带。结论结合患者的临床发病资料、流行病学史、病原学和分子生物学检测结果,确诊其为田鼠巴贝虫感染。     

等位基因特异性PCR技术在5-脂氧合酶基因多态性检测中的应用

目的 探讨等位基因特异性PCR技术检测5-脂氧合酶基因六个位点的单核苷酸多态性(SNP)的效果.方法 采集36例哮喘患者外周静脉血2 mL,用0.2％氯化钠处理收集白细胞,采用基因组DNA提取试剂盒抽提基因组DNA,采用等位基因特异性PCR(AS-PCR)法直接对已知位点的SNP进行扩增分型.针对野生型和突变型设计3 ′端的碱基,且倒数第二位的碱基设计故意错配的碱基,用以提高引物的特异性.结果 5-脂氧合酶六个位点的SNP检测结果准确清晰.结论 采用本研究设计的引物可以对5-脂氧合酶的六个位点直接扩增分型;与测序法和限制性内切酶酶切法相比,等位基因特异性PCR技术检测5-脂氧合酶六个位点的SNP具有经济、快速、简便、易行等特点.     

用聚合酶链反应技术对粉尘螨和屋尘螨进行鉴别和检测

目的用聚合酶链反应（PCR）技术对粉尘螨和屋尘螨进行鉴别和检测。方法用随机引物PCR对粉尘螨和屋尘螨的DNA进行扩增,选择3个扩增条带进行测序和分析。根据测序结果再次设计PCR引物用于粉尘螨和屋尘螨的鉴别和检测,并对该引物的特异性和敏感性进行了分析。结果随机引物扩增反应,粉尘螨在750bp和500bp左右均有明显条带;而屋尘螨仅500bp左右条带较清晰,无大于500bp的扩增产物出现。测定了3个新的尘螨DNA片段的序列结构。新设计的引物用于两种尘螨的检测有较好的特异性和敏感性。结论随机引物PCR技术可用于粉尘螨和屋尘螨的鉴别。本研究方法具有检测环境中粉尘螨和屋尘螨的潜力。     

微小隐孢子虫种特异性基因片段的克隆及诊断引物的确定

目的　寻找用于诊断微小隐孢子虫病的特异性引物。　方法　在RAPD分析过程中获得了 1条微小隐孢子虫 [Cryptosporidium parvum (C .parvum ) ]种特有 712bp的基因片段 ,将该片段分离、纯化、克隆和测序 ,据此序列合成一对特异性引物FF。用引物FF扩增美国 2株C .parvum和中国 4株C .parvum ,并用该引物与Morgan( 1996 )发表的C .parvum种特异性诊断引物 0 2 1作对照 ,检测镜检C .parvum卵囊阴性的兔粪样 35份和人粪样 5 5份。　 结果　引物FF扩增 6株C .parvum均能产生预计 6 0 3bp的片段 ,引物FF和引物 0 2 1粪样检测结果完全一致 ,其敏感性是可检出 1个卵囊的DNA。　结论　获得的引物FF特异性强 ,敏感性高 ,可用于微小隐孢子虫病的诊断。     

不同PCR方法检测布鲁菌阳性样本的敏感性分析

目的利用布鲁菌分离株及对应的患者血液样本验证不同引物扩增的特异性及其敏感性,为将PCR方法应用于人布鲁菌病临床诊断提供参考。方法对血液样本进行传统布鲁菌分离培养,根据表型对分离株进行种型鉴定;用玻片凝集试验(PAT)和试管凝集试验(SAT)两种血清学方法检测培养阳性的血液模板;应用不同布鲁菌属引物B4/B5、BP26以及羊、牛和猪种引物对布鲁菌分离株进行鉴定,同时对其血液模板进行PCR检测。结果从急性发热患者血液分离到24株布鲁菌,经表型鉴定均为羊种。对分离株进行PCR鉴定,布鲁菌属引物B4/B5、BP26及羊种引物在分离株中均扩增到目的条带。应用不同引物PCR方法对血液模板检测的阳性率依次为B4/B5(79.17%),羊种(66.67%)和BP26(25.00%);B4/B5和羊种引物扩增同为阳性的符合率为41.67%,B4/B5或羊种引物扩增为阳性的符合率为91.67%。结论在布鲁菌分离培养阳性的血液样本中,应用单一引物PCR进行人布鲁菌病诊断的敏感性较低,将布鲁菌属B4/B5和地方流行种引物结合可提高PCR检测方法的敏感性和特异性。     

肥大细胞对平滑肌源性泡沫细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的影响

目的　检测大鼠腹腔肥大细胞 (mastcell,MC)对平滑肌源性泡沫细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原表达的影响。方法　SD大鼠体重约 2 0 0g ,雌雄不限 ,供采集MC和原代培养平滑肌细胞 (smoothmusclecell,SMC)。采用梯度密度离心分离MC ,提取MC上清液(含MC释放的各种炎症介质 )。用MC上清液和氧化型低密度脂蛋白 (oxLDL)处理SMC ,实验分四组 :对照组SMC在 5mL含10 %小牛血清的DMEM中培养 4 8h ;oxLDL组SMC在 5mL含 10 %小牛血清的DMEM中 (含oxLDL ,终浓度为 10 0mg L)培养 4 8h ;MC上清液组SMC在 5mL含 10 %小牛血清的MC上清液 (由含 1× 10 6 个MC的细胞悬液提取 )中培养 4 8h ;MC上清液 +ox LDL组SMC在 5mL含 10 %小牛血清的MC上清液 (由含 1× 10 6 个MC的细胞悬液提取 )中 (含oxLDL ,终浓度为 10 0mg L)培养4 8h。采用油红O染色检测SMC泡沫化。RT PCR检测SMCⅠ型胶原和Ⅲ型胶原mRNA的表达 ,PCR引物序列Ⅰ型胶原为 5′ GACACTGAACCCTTTGTAATG 3′和 5′ GTGAAACTCCCGTCTGCT 3′ ,扩增片段长度为 399bp ;Ⅲ型胶原引物序列为 5′ AGCGGAGAATACTGGGTT 3′和 5′ TGTAATGTTCTGGGAGGC 3′ ,扩增片段长度为 2 88bp ;内参照采用β actin ,引物序列为 5′ GTGGGGCGCCCCAGGCACCA 3′和 5′ CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC 3′,扩     

基于线粒体细胞色素氧化酶亚单位3基因鉴定贵州省首例输入性卵形疟病例

提取贵州省首例镜检诊断为输入性卵形疟病例的血样DNA,以疟原虫的核糖体RNA小亚基(SSU r RNA)和线粒体细胞色素氧化酶亚单位3基因(cox3)为靶标,分别设计属、种特异性引物及种特异性引物, PCR扩增、测序,比较2种引物对疟原虫种类PCR鉴定的特异性。以卵形疟原虫wallikeri亚种参考序列(GenBank登录号:HQ712053.1)和curtisi亚种参考序列(GenBank登录号:HQ712052.1)为模板,应用DNAMAN V6软件对扩增序列进行Blast比对。利用Mega 7.0.26软件,采用邻接法,基于疟原虫线粒体cox3基因DNA序列构建系统进化树。PCR结果显示,基于疟原虫SSU r RNA属、种特异性引物扩增,仅获得1 200 bp的属特异性条带,未出现种特异性条带。基于疟原虫cox3种特异性引物扩增,可获得880 bp的目的条带。Blast比对结果显示,PCR扩增获得的cox3基因序列与卵形疟原虫wallikeri亚种和curtisi亚种的序列一致度为99.4%和97.4%。