心脏组织特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

目的：建立在小鼠心肌细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠。方法：构建了心肌细胞特异性表达Cre重组酶的转基因载体。该载体通过显微注射被导入小鼠受精卵中，通过胚胎移植，获得转基因首建者小鼠。利用PCR检测子代小鼠Cre重组酶整合情况。通过Northern杂交检测Cre重组酶表达的组织特异性。结果：构建了含有心肌细胞特异性α-肌球蛋白重链(α-MHC)启动子、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体α-MHC—Cre—hGH。将转基因载体进行显微注射，共注射了215枚小鼠受精卵，其中202枚移植入13只假孕母鼠的输卵管中发育，获得子代小鼠42只。PCR检测发现有1只小鼠在其基因组上整合有Cre重组酶基因。Northem杂交检测结果显示该转基因小鼠只在心脏组织中特异性地表达Cre重组酶基因。结论：成功获得了在小鼠心肌细胞中特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠，为利用条件基因打靶技术研究基因在心脏发育与相关疾病中的功能提供了有利的工具。     

Cre重组酶在心肌细胞特异性转基因小鼠中的功能检测

目的：检测Cre重组酶在心肌细胞特异性Cre重组酶转基因小鼠（α-MHC-Cre）中的组织分布及其在体内介导基因重组的作用。方法：将α-MHC-Cre转基因小鼠与尺DSA26报告小鼠交配，利用LacZ染色对双转基因阳性子代小鼠进行检测。然后，将α-MHC-Cre小鼠与Smad4条件基因打靶小鼠交配，利用PCR和Southem杂交对Cre重组酶介导重组的组织特异性进行检测。结果：LacZ染色表明，Cre重组酶只在心肌细胞中特异性表达并介导ROSA位点LoxP序列间的重组。PCR和Southem结果显示Cre重组酶只在心肌细胞中特异地剔除了Smad4基因，进一步验证了Cre重组酶在心肌细胞中发挥介导LoxP位点重组的作用。结论：α-MHC-Cre转基因小鼠具有良好的组织特异性，只在心肌细胞中表达Cre重组酶，并能在体内成功地介导心肌细胞基因组上LoxP位点间的重组，是一种理想的研制心肌细胞特异性基因剔除小鼠的工具小鼠。     

1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠的制备及检测

目的制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠,为乙肝的防治提供较好的动物模型。方法采用受精卵显微注射法,制备1.3拷贝C基因型HBV转基因小鼠;采用PCR、ELISA、荧光定量PCR和免疫组化方法检测HBV基因在转基因小鼠体内的整合、复制和表达情况。结果共注射受精卵2282枚,成活2024枚,注射成活率88.7%。共移植假孕雌鼠72只,59只怀孕,假孕雌鼠妊娠率81.9%。共产下F0代小鼠185只,PCR检测共有19只整合阳性,阳性率10.3%。血清荧光定量PCR结果显示,其中6只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102~103拷贝/ml;经传代产下F1代小鼠96只,PCR检测HBV DNA阳性33只,阳性率34.4%。血清荧光定量PCR结果显示,其中10只小鼠有HBV DNA复制,拷贝数为102~103拷贝/ml;F0代和F1代小鼠随机分别各取3只进行肝脏和肾脏HBsAg免疫组化检测结果均为阳性,且肾脏表达高于肝脏。结论 1.3拷贝C基因可以在上述制备成功的C型HBV转基因小鼠体内复制和表达,并且可以遗传给下一代。     

Cre重组酶调控的OVA-HBsAg转基因乙肝模型小鼠的制备及鉴定

目的 制备Cre重组酶调控的卵清蛋白(OVA)-HBsAg转基因小鼠,为乙肝的防治提供更好的动物模型.方法 采用原核显微注射方法将线性化的携带OVA-HBsAg基因并带有LoxP位点的质粒注入C57BL/6J×DBA小鼠受精卵的雄原核内,制备受Cre重组酶调控表达的OVA-HBsAg转基因小鼠.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与本室饲育的Alb-Cre转基因阳性公鼠进行杂交,获得子代小鼠,观察Cre对OVA-HBsAg转基因小鼠HBsAg的诱导表达情况.采用PCR、ELISA和免疫组化方法检测HBsAg基因、Cre基因在转基因小鼠体内的整合及表达情况.结果 共注射受精卵491枚,成活337枚,成活率68.6％.产下F0代小鼠29只,其中PCR阳性4只,外源基因整合率13.8％.目前已传至F4代,F1-F4代PCR阳性率分别为27.5％、32.0％、22.9％、25.0％,ELISA法未检测到血清中HBsAg表达.将F1代OVA-HBsAg阳性母鼠与Alb-Cre阳性公鼠杂交,获得16只子代小鼠,PCR检测Cre基因和HBsAg基因双阳性的子代小鼠有6只,其中2只小鼠血清HBsAg检测为阳性,诱导表达阳性率为33.3％.结论 成功制备出OVA-HBsA转基因小鼠,且可稳定传代,Cre重组酶可以诱导小鼠体内HBsAg的表达.     

YMDD突变株HBV转基因小鼠的制备及检测

目的建立YMDD耐药突变株HBV转基因小鼠,为乙肝防治研究提供转基因动物模型。方法采用受精卵显微注射法,将带有YMDD突变的对拉米夫定有耐药性的1.3拷贝HBV基因注入FVB/N单细胞受精卵的原核内,制备YMDD耐药突变株HBV转基因小鼠。采用PCR检测外源基因的整合和传代情况,采用ELISA和免疫组化等方法检测HBsAg在肝、肾中的复制和表达情况。结果注射受精卵3401枚,产269只F0代仔鼠,PCR阳性33只,外源基因的整合率12.3%。9只转基因鼠血清HBVDNA弱阳性,拷贝数低于103拷贝/ml;免疫组化结果显示肝组织和肾组织均有HBsAg表达,且肾组织中的表达强于肝组织。经传代产下47只F1代转基因鼠,目的基因PCR阳性率为27.6%,且肝组织和肾组织中HBsAg均有表达,分布特性与F0代一致。结论成功制备出体内有复制表达而且可以传代YMDD耐药突变株HBV的转基因小鼠。     

成骨细胞特异性Pten基因敲除小鼠发生骨质硬化症

目的:研究Pten基因及其介导的PI3K/AKT信号通路在骨代谢平衡过程中的作用并建立相应的骨代谢疾病小鼠动物模型.方法:在利用Cre-LoxP系统获得成骨细胞特异性Pten基因敲除小鼠的基础上,利用X线摄影术、骨密度分析及组织学染色方法分析Pten基因敲除小鼠较野生型小鼠的骨量变化情况,进一步提取2种基因型小鼠骨组织RNA,通过实时定量PCR分析成骨细胞的标志基因如胶原Ⅰ、碱性磷酸酶、骨钙素等标志分子的表达情况.结果:获得了成骨细胞特异性Pten基因敲除小鼠,Pten基因敲除后小鼠的体型较野生型小鼠没有明显改变,但X线片、骨密度及组织学分析均表明Pten敲除小鼠骨量明显增加,发生了与人类骨质硬化症相类似的表型:此外,实时定量PCR的分析结果显示,成骨细胞的标志基因如胶原Ⅰ、碱性磷酸酶、骨钙素等标志分子的表达都有明显的升高.结论:成功地建立了Pten基因敲除骨质硬化症小鼠动物模型.     

慢病毒介导的绿色荧光蛋白转基因小鼠的制备及鉴定

目的以携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒为载体制备转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台。方法将慢病毒表达载体FUGW与ViraPowerTMLentiviral Packaging Mix按1∶2比例混合,用LipofectamineTM2000转染293FT细胞,包装出的病毒经浓缩后以293T细胞测定病毒滴度。采用受精卵卵周隙显微注射的方式制备转基因小鼠。出生小鼠用PCR法检测GFP基因整合情况,并在荧光体视显微镜下鉴定外源基因的表达情况。结果病毒包装过程中,转染后24h即可见GFP表达,72h时293FT细胞的转染效率达95%以上,镜下可见大量绿色荧光。包装出的慢病毒滴度为106U/ml,经浓缩后可达108U/ml。PCR检测显示,F0代小鼠GFP PCR阳性率为70.27%(26/37)。荧光体视显微镜下观察荧光小鼠所占比例,F0代为65.2%(15/23),F1代为55.0%(11/20),荧光强度在两代个体中相当。F0代、F1代中GFP均呈广泛表达。结论制备出携带GFP可传代的转基因小鼠,建立了慢病毒载体介导的转基因小鼠制备技术平台。     

Wistar大鼠c-ski基因部分序列的克隆、测序及实时荧光定量PCR的建立

目的 测定Wistar大鼠c-ski基因部分序列,并应用于检测大鼠c-ski基因表达的实时荧光定量PCR的建立.方法 提取培养的Wistar大鼠皮肤成纤维细胞总RNA,通过RT-PCR扩增,将扩增产物克隆到PMD-18T载体上并测序.根据获得的c-ski基因部分序列设计实时荧光定量PCR引物,建立SYBR green定量PCR检测方法,并检测培养的大鼠皮肤成纤维细胞c-ski mRNA表达水平.结果 获得的Wistar大鼠c-ski基因cDNA序列长561bp,为未曾报道的新序列,其与人、小鼠具有较高的同源性,Gen-Bank收录(收入号DQ409171).建立的SYBR green定量PCR检测标准品在103～109拷贝范围内的相关系数为0.991 49.体外培养的Wistar大鼠皮肤成纤维细胞样晶中c-ski mRNA水平为(1.024±0.18)×106拷贝/μl.结论 新获得了Wistar大鼠c-ski基因部分序列,该序列可用于实时荧光定量PCR的建立.     

平滑肌细胞特异表达Cre重组酶转基因小鼠的建立

目的：建立平滑肌细胞特异表迭Cre重组酶的转基因小鼠。方法：用分子克隆的方法构建含有α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)启动子、Cre重组酶基因和polyA的转基因载体α-SMA-Cre。以显微注射的方法将5．3kb的转基因片段引入小鼠基因组。通过PCR和LacZ染色以检测Cre重组酶在体内介导重组的功能。结果：共注射282枚受精卵，移植至10只假孕母小鼠的输卵管中发育，获得子代小鼠19只，经PCR鉴定有4只小鼠在基因组上整合有Cre基因，整合率为2l％。将该小鼠与基因组上携带LoxP位点的Smad4务件基因打靶小鼠交配，通过PCR在所有含有平滑肌细胞的组织基因组DNA中检测到重组后的234bp特异条带。与“报告”小鼠-ROSA26交配，LacZ染色后小肠壁平滑肌细胞中特异地检测到Cre重组酶活性。结论：成功构建了平滑肌细胞特异表达Cre重组酶的转基因小鼠．该小鼠在平滑肌细胞中特异表迭Cre重组酶，并能在体内成功地介导LoxP位点间的重组。     

荧光实时定量PCR检测老年人外周血淋巴细胞β_1和β_2肾上腺素能受体基因mRNA表达

目的建立荧光实时定量PCR法检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2肾上腺素能受体(AR)基因mRNA表达。方法随机选择ASAⅠ~Ⅱ级老年患者30例,分离外周静脉血淋巴细胞,采用荧光实时定量PCR法检测β1和β2-AR基因mRNA表达,并与半定量PCR检测结果进行比较。结果30例患者外周血淋巴细胞荧光实时定量PCR均检出β1和β2-AR mRNA表达,不同性别组同一基因表达量无显著差异(P>0.05);荧光实时定量PCR检测β2-AR mRNA表达量显著高于β1-AR mRNA(P<0.001),而半定量PCR随着循环次数增加,β1和β2-AR mRNA表达差异减小。结论所建立的荧光实时定量PCR成功检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2-AR基因mRNA表达,有较高的灵敏性及特异性;半定量PCR扩增平台期影响试验结果判断。     

Development of a sodium/iodide symporter (NIS)-transgenic mouse for imaging of cardiomyocyte-specific reporter gene expression.

Development of a small animal imaging system for differentiated cell-specific reporter gene expression will enable us to image cellular differentiation in vivo. In this study, we developed a sodium/iodide symporter (NIS)-transgenic mouse in which NIS is constitutively expressed as an imaging reporter gene only in cardiomyocytes. METHODS: To express NIS gene in cardiomyocytes, alpha-myosin heavy chain (alpha-MHC)-NIS was constructed and used for the production of NIS-transgenic mice. Twelve lines of positive founder were obtained. The adequacy of the transgenic mouse model was tested by in vivo scintigraphy, microPET, and a biodistribution study. RESULTS: The myocardium of transgenic mice showed rapid and intense uptake of 131I, which was much higher than that of the thyroid, and also showed long retention by gamma-camera pinhole imaging. The relative uptake ratio of the heart of transgenic mice was 4.6 +/- 1.5, which was 3.8 +/- 1.2 times higher than that of control wild-type mice. The uptake of the heart was completely blocked by oral administration of KClO4, an NIS inhibitor. The heart of transgenic mouse was also clearly and intensely visualized on microPET using 124I. Biodistribution data of these mice showed the uptake of 40-160 %ID/g (percentage injected dose per gram of tissue) of (99m)Tc-pertechnetate in the heart compared with 40-60 %ID/g in the stomach, respectively. NIS expression in the myocardium was confirmed by immunohistochemistry using a NIS-specific antibody. CONCLUSION: We developed a transgenic mouse model to image cardiomyocytes with a gamma-camera and microPET using an alpha-MHC promoter and NIS. The transgenic mouse can be used as an imaging model for cardiomyocyte-specific reporter gene expression and cellular differentiation into cardiomyocytes after cardiac stem or progenitor cell transplantation.     

rrBMP-7基因对缺氧复氧损伤心肌细胞的保护作用

目的 探讨骨形态发生蛋白-7(BMP-7)基因对缺氧复氧损伤后心肌细胞的保护作用.方法 将体外培养的乳大鼠心肌细胞分为3组:对照组(C组);缺氧复氧组(HR组):将培养的心肌细胞缺氧120min,复氧240min;转染组(BT组):将重组鼠BMP-7质粒转染心肌细胞后,再缺氧120min/复氧240min.每组重复8次.心肌细胞损伤程度以心肌细胞搏动功能评定、台盼蓝摄取率和乳酸脱氢酶(LDH)、磷酸肌酸激酶(CPK)活性来表示,同时检测心肌细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量.通过荧光成像技术检测各组心肌细胞内钙含量的变化.结果 与C组比较,HR组心肌细胞LDH、CPK含量显著增高,台盼蓝摄取率增加,SOD活性和细胞搏动频率显著下降,MDA和钙离子含量显著增高.与HR组比较,BT组心肌细胞台盼蓝摄取率降低,LDH活性减低,SOD活性增高,MDA含量下降,细胞内钙离子含量降低.结论 BMP-7转染可对抗缺氧复氧对心肌细胞的损伤,其机制与提高心肌细胞抗氧化损伤能力,对抗缺氧复氧引起的细胞内钙超载有关.     

神经肽Y1受体激动药诱导大鼠心肌细胞肥大的研究

 目的 探讨神经肽Y1受体激动药[Leu31,Pro34]NPY在诱导心肌细胞肥大中的作用.方法 用不同浓度[Leu31,Pro34]NPY刺激原代培养心肌细胞,采用放射性核素3H-leu掺入法检测培养心肌细胞蛋白质合成速率.应用荧光定量PCR方法检测[Leu31,Pro34]NPY对培养心肌细胞肥大相关基因ANF、β-MHC mRNA表达的影响.结果 [Leu31,Pro34]NPY(10-9 mol/L、10-8 mol/L、10-7 mol/L)作用心肌细胞24 h后可明显增加心肌细胞3H-leu的掺入量 (P＜0.01),并可诱导心肌细胞β-MHC表达增加(P＜0.01),对ANF表达的影响不明显.结论 神经肽Y1受体激动药[Leu31,Pro34]NPY可加快细胞蛋白质合成速率、促进心肌细胞β-MHC表达,直接诱导心肌细胞的肥大.     

MiR30b与小鼠Bach2相互作用的研究

目的研究B细胞末端分化过程中miR30b新的作用靶点。方法经生物信息学分析,利用特异性引物以及定点突变引物从小鼠c DNA中分别扩增大小为530、361和189bp三个目的片段,胶回收并对361和189bp进行拼接,获得野生型、突变型小鼠Bach2 mRNA特异性片段,分别与pmir GLO载体连接,构建野生型、突变型重组荧光素酶报告基因质粒pmir GLO-m Bach2、pmir GLO-m Bach2 mt;与miR30b共转染至HEK293 T细胞,分析其荧光素酶活性。结果重组荧光素酶报告基因质粒经双酶切及测序证实构建正确;共转染后,与pmir GLO+miR30b组相比,pmir GLO-m Bach2+miR30b组的荧光素酶活性明显降低(P0.05),而pmir GLO-m Bach2 mt+miR30b组的荧光素酶活性则无明显改变(P0.05)。结论小鼠Bach2 mRNA是miR30b的靶点。     

建立高效的转基因动物鉴定技术体系

转基因动物的鉴定是转基因动物研究领域的重要内容。本文简要回顾了相关鉴定技术的研究进展 ,建立和完善了特异性PCR扩增及其产物酶切的转基因动物鉴定体系 ,在引物设计、PCR参数优化、设立内源性标记等方面作了进一步的改进 ,提高了PCR的特异性和可靠性。实验表明 ,PCR扩增及其产物酶切是一种准确、灵敏、简便、重现性好的转基因动物筛选鉴定方法     

节律基因mClock在肿瘤实验化疗中的作用

目的 研究节律基因mClock在顺铂诱导小鼠Lewis肺癌细胞(LLC)凋亡中的作用.方法 体外采用12-十四酸佛波酯-13-乙酸盐(PMA)诱导LLC细胞近日节律,荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测细胞mClock基因的节律性表达.于诱导后不同时间点,顺铂(CDDP)处理细胞,24 h后四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)法和流式细胞术检测(FCM)其对细胞的增殖与凋亡的影响.采用脂质体介导方法将mClock基因转染至LLC细胞,顺铂处理细胞,24 h后MTT法和流式细胞术检测其对细胞的增殖与凋亡的影响.结果 PMA作用LLC后,mClock基因呈现节律性表达.PMA诱导LLC节律表达的不同时间点,细胞对顺铂的敏感性不同.mClock过表达使顺铂作用后LLC凋亡率下降,细胞增殖明显.结论 mClock能够抑制顺铂诱导LLC的凋亡.     

Cellular MRI contrast via coexpression of transferrin receptor and ferritin.

Recently there has been growing interest in the development and use of iron-based contrast agents for cellular imaging with MRI. In this study we investigated coexpression of the transferrin receptor and ferritin genes to induce cellular contrast in a biological system. Expression of transgenic human transferrin receptor and human ferritin H-subunit was induced in a stably transfected mouse neural stem cell line. When grown in iron-rich medium, the transgenic cells accumulated significantly more iron than control cells, with a trend toward an increase in reactive oxygen species, but no detrimental effects on cell viability. This cellular iron significantly increased the transverse relaxivities, R2 and R2*, at 1.5 T and 7 T. By comparing measurements in the same cell samples at 1.5 T and 7 T, we confirmed the expected increase in relaxivity with increasing field strength. Finally, supplemented transgenic cells transplanted into mouse brain demonstrated increased contrast with surrounding neural tissue on T2*-weighted MR brain images compared to controls. These results indicate that dual expression of proteins at different critical points in the iron metabolism pathway may improve cellular contrast without compromising cell viability.     

Let-7和miR-24在紫外线B诱导的细胞凋亡中的作用

目的 研究let-7和miR-24在紫外线B(UVB)诱导的细胞凋亡中的可能作用。方法 NIH3T3细胞受50 J/m²UVB照射后,用Hoechest 33342/PI染色观察其凋亡情况;RT-PCR检测let-7和miR-24的表达水平。利用在线数据库PicTar等预测它们的靶基因,并用GOstat软件对这些靶基因进行功能分类。结果 荧光显微镜下,NIH3T3细胞经UVB照射后可见典型的凋亡和坏死细胞;let-7和miR-24在UVB照射组的表达水平较对照组明显增加。用GOstat进行功能分类后发现,casp3、bcl2l2、map3k1和cdk5等基因同时也是UVB诱导的细胞周期调节的靶基因。结论 let-7和miR-24可能参与UVB诱导的细胞凋亡。     

Characterization of IMPY as a potential imaging agent for β-amyloid plaques in double transgenic PSAPP mice

Deposition of -amyloid (A) plaques in the brain is likely linked to the pathogenesis of Alzheimers disease (AD). Developing specific A aggregate-binding ligands as in vivo imaging agents may be useful for diagnosis and monitoring the progression of AD. We have prepared a thioflavin derivative, 6-iodo-2-(4-dimethylamino-)phenyl-imidazo[1,2-a]pyridine, IMPY, which is readily radiolabeled with ¹²⁵I/¹²³I for binding or single-photon emission computerized tomography (SPECT) imaging studies. Characterization of [¹²⁵I]IMPY binding to plaque-like structures was evaluated in double transgenic PSAPP mice. [¹²⁵I]IMPY labeled A plaques in transgenic mouse brain sections, and the labeling was consistent with fluorescent staining and A-specific antibody labeling. Significant amounts of A plaques present in the cortical, hippocampal, and entorhinal regions of the transgenic mouse brain were clearly detected with [¹²⁵I]IMPY via ex vivo autoradiography. In contrast, [¹²⁵I]IMPY showed little labeling in the age-matched control mouse brain. Tissue homogenate binding further corroborated the A plaque-specific distribution in various brain regions of transgenic mouse, and correlated well with the known density of A deposition. Using a tissue dissection technique, [¹²⁵I]IMPY showed a moderate increase in the cortical region of transgenic mice as compared to the age-matched controls. In vitro blocking of [¹²⁵I]IMPY by carrier observed via autoradiography in mouse brain sections was not replicated by an in vivo blocking experiment in living TT mouse brain. The failure was most likely due to a significant carrier effect, which slows down the tracer in vivo metabolism, leading to an increased brain uptake. Taken together, these data indicate that [¹²³I]IMPY is a potentially useful SPECT imaging agent for in vivo labeling of A plaques in the living brain.     

小胶质细胞在老年黄斑变性形成过程中的作用

目的 观察小胶质细胞在激光诱导小鼠脉络膜新生血管（CNV）发生过程中的表达特点及意义.方法 雄性CX3CR1＋/GFP杂合性转基因小鼠32只,取每只小鼠一只眼作为实验组,予532nm激光光凝,激光功率50兆瓦,曝光时间100ms,光斑直径100μm,每眼光凝4点,另一只眼作为对照组,在光凝后分别于7d、14d、21d、28d按随机数字法选取8只小鼠处死,摘出眼球,制作病理标本,用荧光免疫组化染色方法检测CD11b、Iba1的表达,并用激光共聚焦显微镜进行观察.结果 光斑处实验组较对照组小胶质细胞增生明显（P〈0.05）,并且14d组及21d组小胶质细胞较7d组增生明显,在细胞数量、细胞面积、平均光密度值等方面的差异均具有统计学意义（P〈0.05）,28d组小胶质细胞增生程度下降,与7d组接近.结论 小胶质细胞在激光诱导CNV模型中激活,随着损伤时间推移先升高,后降低,在CNV的形成过程中发挥重要作用.