Notch信号与少突胶质前体细胞增殖和分化的相关研究进展

中枢神经系统(central nervous system,CNS)脱髓鞘是以神经髓鞘脱失为主,神经元胞体和轴突受累相对较轻的一类神经性病变疾病。在CNS中,少突胶质细胞(oligodendrocyte,OLs)损伤是导致脱髓鞘发生的主要原因。提高少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)增殖和分化的能力可促进髓鞘修复。因此,研究OPCs的增殖和分化机制可为脱髓鞘疾病的治疗提供一种新思路和新靶点。Notch信号是一种进化上高度保守的信号转导途径,广泛存在于真核生物和原核生物中,与细胞、组织、器官的分化和发育密切相关。近年来研究发现Notch信号在髓鞘的再生过程中发挥重要作用。本文就Notch信号在OPCs增殖和分化的作用进行简要综述。     

大鼠脑缺血血管内皮生长因子与NG2细胞增殖关系的初步研究

目的观察大鼠脑缺血后少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPC)的表达,并初步探讨血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor,VEGF)在其中的作用。方法实验动物72只,按随机数字表法分为假手术对照组、缺血组和缺血+贝伐单抗组共3组,每组设6、12、24、72 h 4个时相点,每个时相点6只大鼠,采用激光共聚焦观察缺血后不同时相点NG2和VEGF免疫荧光标记的细胞增殖状况。结果在大脑皮层区,NG2与VEGF标记细胞基本完全重叠。在缺血后72 h内,阳性标记细胞随时间延长,进行性增多,其中贝伐单抗组在各时相点的双阳性细胞数均明显少于缺血组(P<0.05)。结论脑缺血损伤后脑皮层区存在OPC的活化现象。VEGF可能对损伤后NG2的增殖有促进作用。     

大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞的生物学特性

目的 探讨大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞在体外条件下的增殖及分化等生物学特性,为进一步研究脊髓脱髓鞘疾病的髓鞘再生奠定基础.方法 采用免疫吸附法原代培养大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞,并用免疫荧光染色鉴定其表面标志物A2B5及NG2;采用Alarm blue法检测其在体外的增殖能力,并绘制生长曲线;诱导原代培养的少突胶质前体细胞向成熟少突胶质细胞分化,并用免疫荧光染色鉴定成熟少突胶质细胞表面标志物MBP及GalC的表达情况.结果 免疫吸附法可以对大鼠脊髓组织中的少突胶质前体细胞进行有效的分离纯化,分离获得的少突胶质前体细胞A2B5及NG2表达呈阳性,Alarm blue法检测结果显示少突胶质前体细胞在体外具有良好的增殖能力,诱导分化实验证实少突胶质前体细胞可以分化为成熟少突胶质细胞并且MBP及GalC表达呈阳性.结论 采用免疫吸附法原代培养的大鼠脊髓源性少突胶质前体细胞在体外具有良好的增殖能力以及分化为成熟少突胶质细胞的能力.     

间歇性低氧对少突胶质前体细胞增殖的影响

目的：观察间歇性低氧-复氧对少突胶质前体细胞增殖的影响。方法：取分离纯化的少突胶质前体细胞,培养皿或96孔板中的细胞分别加入10mg／ml的各种细胞因子,分为常氧组和低氧组,低氧组在3％低氧环境下持续4d分别各培养1h、2h、3h、4h后取出复氧,9d后进行MTT测定或细胞计数。96孔板分组;无细胞的阴性对照,有细胞的空白对照,PDGF,bFGF,IL-6,IFN-β1,GDNF,PDGF＋bFGF,PDGF＋IL-6,PDGF＋GDNF,bFGF＋IL- 6,bFGF＋GDNF,IL-6＋GDNF,PDGF＋bFGF＋IL-6,PDGF＋bFGF＋GDNF,PDGF＋bFGF＋IL-6＋GDNF共16组。培养皿分组除无细胞的阴性对照组外的15组。培养至9d。同时取出各组细胞,进行细胞计数和MTT测定。结果：除1h组外,各低氧处理组细胞数及MTT值均较对照明显增多。结论：首次报道恰当时间的间歇性低氧-复氧可促进少突前体细胞增殖。这为细胞移植治疗中枢神经系统脱髓鞘疾病及研究髓鞘形成、髓鞘再生的机理提供基础。     

体外少突胶质细胞培养的新方法

目的 探讨小鼠鼠婴大脑皮质体外少突胶质细胞培养的新方法。方法 取C57/BL6新生小鼠P0~P2（出生后0~2天）的大脑皮质,accummax室温消化10min,然后用含10%FBS的DMEM/F-12高糖培养基体外培养,培养至第7天时,运用巴氏管吹打,从混合培养的细胞中分离纯化少突胶质前体细胞,然后加入促分化培养基促使少突胶质前体细胞分化发育成熟,行细胞免疫荧光进行鉴定。结果 少突胶质前体细胞纯度较高,达到93.3%左右。加入促分化培养基后,少突胶质前体细胞可快速分化发育成熟。结论 该体外少突胶质细胞培养方法较简单,细胞纯度及产量高,对临床脱髓鞘疾病的研究具有很大的应用价值。     

新生大鼠少突胶质前体细胞的培养与鉴定

目的 在体外培养条件下获取纯度较高的少突胶质前体细胞(oligodendrocyte progenitor cells,OPCs).方法 原代混合胶质培养,利用振荡法和差速贴壁法分离纯化少突胶质前体细胞,再用无血清化学条件培养基培养.免疫荧光法及膜片钳记录细胞电生理特性进行鉴定.结果 振荡分离后超过90%细胞为NG2阳性OPCs:OPCs电生理特性:输入阻抗Ra相对较高;电压依赖的K 电流具有外向整流特性;对河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)敏感的小的内向Na 流,不能产生动作电位.结论 振荡法结合差速贴壁可以获得纯度较高的OPCs;OPCs具有区别于神经元、星型胶质细胞、小胶质细胞的独有电生理特性.     

少突胶质前体细胞分离培养方法及其谱系限定细胞体外分化模型建立的改进

目的：对少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)的分离、培养及传代方法进行改良,探讨体外条件下OPCs的增殖与分化特性。方法： 取新生SD大鼠脊髓来源的细胞分离、纯化OPCs行原代培养,用含碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和血小板源性生长因子-aa(platelet-derived growth factor-aa,PDGF-aa)的培养液作扩增培养,MTT法检测OPCs的增殖能力;三碘甲腺原氨酸和睫状神经生长因子诱导OPCs分化,最终分化为成熟的少突胶质细胞(oligodendrocytes,OLs),并对分化细胞行形态学及免疫化学染色法鉴定。结果：95%以上的细胞具有双极或三极突起的典型OPCs形态并表达A2B5;MTT法检测显示OPCs在体外保持良好的增殖能力;细胞最终诱导分化为成熟的OLs并表达髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)。结论：OPCs在体外条件下可继续保持良好的增殖生长及定向分化能力。     

少突胶质前体细胞在髓鞘再生中作用的研究进展

髓鞘再生是脱髓鞘疾病发生后的重要修复方式.在中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)主要由少突胶质细胞及其前体细胞(Oligodendrocyte Precursor Cells,OPCs)介导,OPCs分化形成具有功能性的少突胶质细胞.近年来,研究发现OPCs广泛存在于哺乳动物的CNS,这使髓鞘再生过程成为可能.     

靶向VEGF的miRNA对恶性黑色素细胞增殖和凋亡的影响

目的研究靶向血管内皮生长因子（VEGF）基因的外源性miRNA对恶性黑色素瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法根据
VEGF基因序列设计合成4对miRNA干扰片段,构建质粒真核表达载体,分别为X-26-1-3、X-26-2n-1、X-26-3-2和X-26-4-4,测
序分析鉴定插入序列的完整性;脂质体法将该4 个重组表达载体转染黑色素瘤细胞株SKmel-28,RT-PCR 检测转染细胞中
VEGF基因的mRNA表达变化,Western blotting 检测miRNA对VEGF蛋白表达水平的调控效应,明确抑制效果最为显著的
miRNA干扰序列。MTS法和流式细胞仪分别检测人工合成的靶向VEGF的miRNA对SKmel-28生长的抑制作用,以及对肿瘤
细胞凋亡的影响。结果测序分析证实4个重组体插入片段的碱基序列均完全正确,成功转染SKmel-28细胞后,均能显著抑制
肿瘤细胞VEGF mRNA和蛋白的表达,与对照组相比有显著性差异（P<0.01）。抑制效应最强的重组载体是X-26-2n-1,MTS法
和流式细胞仪检测显示,SKmel-28细胞转染X-26-2n-1后,细胞增殖受到明显抑制,增殖抑制效应具有时间依赖性,与阴性对照
组比较差异具有显著性（P<0.05）,与空白组比较细胞增殖抑制更加明显（P<0.01）;肿瘤细胞早期凋亡率、晚期凋亡率、总凋亡率
也显著高于对照组（P<0.01）。结论外源性靶向VEGF的miRNA能够显著降低黑色素瘤细胞SKmel-28 VEGF基因和蛋白的
表达水平,抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡。
     

内皮细胞表达血管内皮细胞生长因子的研究

目的 观察体外培养的内皮细胞表达和分泌血管内皮细胞生长因子(VEGF)的情况。方法 以脐静脉内皮细胞系ECV-304为研究对象，采用RT-PCR、流式细胞仪、ELISA法分别观察佛波脂(PMA)对ECV-304合成与分泌VEGF的作用。结果 100ng／ml PMA能明显上调VEGF mRNA的表达、VEGF蛋白的合成及分泌。其对VEGF mRNA表达及细胞内VEGF合成的作用在12h最为明显；而分泌至上清液中的VEGF量则在18h达到高峰。PMA的上述作用能够被放线菌素D所抑制。结论 PMA能够诱导内皮细胞ECV-304表达、合成及分泌VEGF，该作用呈剂量和时间依赖性。其对VEGF mRNA的作用涉及核苷酸的从头合成途径。     

生脉成骨胶囊对血管内皮细胞增殖及分泌VEGF功能的影响

目的探讨生脉成骨胶囊兔血清对人脐静脉血管内皮细胞株（ECV304细胞）增殖及分泌血管内皮生长因子（VEGF）功能的影响.方法以MTT法测定体外培养的ECV304细胞增殖,采用ELISA法检测培养液上清中VEGF浓度,应用透射电镜技术观察药物血清作用12 h后细胞显微结构.结果不同剂量生脉成骨胶囊兔血清在作用12 h和36h后对ECV304细胞增殖无促进作用,中剂量和高剂量兔血清在36h表现出抑制ECV304细胞增殖的作用（P＜0.01）,低剂量兔血清作用1 h后可显著促进ECV304细胞分泌VEGF（P＜0.01）.结论生脉成骨胶囊兔血清对ECV304细胞增殖无促进作用,低剂量生脉成骨胶囊兔血清可促进ECV304细胞分泌VEGF,提示这可能是生脉成骨胶囊促进血管生成的主要作用机制之一.     

生脉成骨胶囊对血管内皮细胞增殖及分泌VEGF功能的影响

目的 探讨生脉成骨胶囊兔血清对人脐静脉血管内皮细胞株(ECV304细胞)增殖及分泌血管内皮生长因子(VEGF)功能的影响。方法 以MTT法测定体外培养的ECV304细胞增殖,采用ELISA法检测培养液上清中VEGF浓度,应用透射电镜技术观察药物血清作用12h后细胞显微结构。结果 不同剂量生脉成骨胶囊兔血清在作用12h和36h后对ECV304细胞增殖无促进作用,中剂量和高剂量兔血清在36h表现出抑制ECV304细胞增殖的作用(P<0.01),低剂量兔血清作用1h后可显著促进ECV304细胞分泌VEGF(P<0.01)。结论 生脉成骨胶囊兔血清对ECV304细胞增殖无促进作用,低剂量生脉成骨胶囊兔血清可促进ECV304细胞分泌VEGF,提示这可能是生脉成骨胶囊促进血管生成的主要作用机制之一。     

VEGF在HaCaT细胞中的自分泌作用

目的:检测VEGF在皮肤角质形成细胞系HaCaT细胞中可能的自分泌作用.方法:用MTT法,检测不同浓度外源性VEGF165(0,1,5,10,25,50,100 ng/ml)和不同浓度VEGF特异性抑制剂阿瓦斯丁(0,0.063,0.125,0.25,0.50,1.0,2.0 mg/ml)作用下HaCaT细胞增殖的变化;用细胞迁移实验,检测不同浓度VEGF165和0.5 mg/ml阿瓦斯丁作用下HaCaT细胞迁移的变化;蛋白免疫印迹检测10 ng/ml VEGF165和0.5mg/ml阿瓦斯丁作用下HaCaT细胞ERK1/2的磷酸化情况.结果:VEGF165剂量依赖性地促进HaCaT细胞的增殖和迁移能力;而阿瓦斯丁剂量依赖性地抑制其增殖能力,0.50 mg/ml阿瓦斯丁可以显著性降低其迁移能力;10 ng/ml VEGF165显著性促进HaCaT细胞ERK1/2的磷酸化,而对0.5 mg/ml阿瓦斯丁预处理过的HaCaT细胞的ERK1/2磷酸化没有促进作用.结论:VEGF在皮肤角质形成细胞系HaCaT中存在着自分泌作用.     

趋化因子12促进少突胶质前体细胞的增殖

目的 体外研究趋化因子12(CXCL12)对大鼠少突胶质前体细胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)增殖的影响及其机制.方法 振荡分离和差速贴壁等方法获得OPCs,采用免疫细胞化学技术进行鉴定;CCK-8检测OPCs在不同浓度CXCL12(0、5、10、20 ng/mL)作用不同时间点(0、24、48、72 h)的增殖,Western blot检测OPCs在各浓度下72 h后下游CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达;CXCR4 siRNA、CXCR7 siRNA分别干扰CXCR4、CXCR7蛋白表达后,检测在20 ng/mL CXCL12下OPCs在各时间点的增殖,Western blot检测该条件下CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达;MMP9 siRNA干扰MMP9蛋白表达后,检测在20 ng/mL CXCL12下OPCs在各时间点的增殖.结果 在一定浓度范围内,CXCL12能够明显促进OPCs增殖,并且促进OPCs内CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达.与0 ng/mL相比,20 ng/mL CXCL12作用72 h后,OPCs增殖及CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达增加最明显(P＜0.05,P＜0.01);CXCR4、CXCR7分别干扰后,OPCs增殖受到抑制,MMP9蛋白表达量也明显降低(P＜0.05,P＜0.01);MMP9干扰后,OPCs增殖受到抑制(P＜0.05).结论 CXCL12对OPCs增殖有明显促进作用,与CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达上调相关.     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达.方法:将人源性的VEGF165cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达.结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108 pfu/ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达.结论:成功构建了表达人VEGF 165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础.     

腺病毒介导的血管内皮生长因子体外靶向性转染心肌细胞

目的:构建以鼠心肌轻链蛋白基因(mlc-2v)为启动子、携带人血管内皮生长因子hVEGF165基因的重组腺病毒载体,检测该重组腺病毒载体对心肌细胞转染的靶向性.方法:酶切腺病毒载体PDC315自身启动子CMV,构建腺病毒载体PDC317,分别接入hVEGF165、mlc-2v基因,构建腺病毒载体PDC-mlc-hVEGF165.鉴定正确后,将PDC-mlc-hVEGF165与Lipofectamine共转染至293细胞,经同源重组获得以mlc-2v为启动子、携带hVEGF165基因的重组腺病毒Ad-mlc-hVEGF165,同步构建无靶向性的重组腺病毒Ad-hVEGF165.扩增并测定滴度后,Ad-hVEGF165、Ad-mlc-hVEGF165分别转染体外培养的心肌细胞、骨骼肌细胞及平滑肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测Ad-mlc-hVEGF165转染心肌细胞的靶向性.结果:构建的病毒正确,病毒滴度为2.8×109 pfu/ml.转染3 d后,Ad-hVEGF165组在各培养细胞的上清液及细胞内均检测到VEGF的表达,而Ad-mlc-hVEGF165组仅在心肌细胞中有VEGF的表达,且Ad-mlc-hVEGF165组心肌细胞分泌的VEGF要少于Ad-hVEGF165组.结论:成功构建了以mlc-2v为启动子、携带人VEGF基因的重组腺病毒Ad-mlc-hVEGF165;该重组载体能体外靶向性转染心肌细胞并使之表达VEGF.     

碘对血管内皮细胞表达VEGF影响的研究

目的 研究碘对血管内皮细胞表达血管内皮生长因子(VEGF)的影响.方法 在含有不同浓度碘离子(I-)环境中培养血管内皮细胞,使用Western-blot和RT-PCR法检测VEGF的表达情况.结果 不同浓度的I-作用于血管内皮细胞后,VEGF表达未出现上调(P>0.05).结论 碘不促进血管内皮细胞合成VEGF,碘促进血管内皮细胞增殖与VEGF上调无关.