建立快速检测鼠疫耶尔森菌的胶体金免疫层析法

〔目的〕　建立检测鼠疫耶尔森菌 (鼠疫杆菌 )的胶体金标记免疫层析方法。〔方法〕　采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒 ,并标记鼠疫杆菌的抗体 ,制成免疫层析检测试纸条 ,进行特异性和敏感性评价 ,并对面粉、土壤、奶粉、淀粉等不同材料进行模拟添加鼠疫菌检测。〔结果〕　用多种不同的常见细菌或近缘细菌进行测试 ,未出现非特异性反应 ,检测鼠疫杆菌的灵敏度为 1× 10 5cfu/ml,对水、土壤、奶粉、面粉、淀粉、酵母粉等不同材料中鼠疫杆菌进行检测也取得同样结果 ,10～ 15min即可得到结果。〔结论〕　建立了 1种可以用于现场快速检测鼠疫杆菌的胶体金免疫层析方法 ,为进一步大规模应用奠定了基础。     

淮南市O139霍乱疫情3种快速检测方法的应用比较及菌株相似性分析

目的通过建立霍乱弧菌的快速检测方法,提高霍乱疫情应急检测的速度和检出率,溯源可疑的传染源。方法将细菌分离鉴定,实时荧光PCR快速检测,胶体金免疫层析快速试纸法同时用于检测霍乱疫情处置期间所采集的患者水样便、外环境水质、食品及水产品,并对其结果进行比较分析;将分离到的O139霍乱弧菌进行脉冲场凝胶(PFGE)电泳分型分析。结果 3种检测方法中实时荧光PCR快速检测和胶体金免疫层析快速试纸法阳性率较高,常规细菌分离鉴定阳性率较低,3种方法各有优势及缺点;PFGE分子分型分析提示本次O139霍乱疫情传染源为水产市场中甲鱼带菌,污染病人食用食物所致。结论荧光PCR快速检测和胶体金免疫层析快速试纸法是菌株分离培养方法的有效补充;PFGE对不同来源的霍乱弧菌遗传同源相关性分析有较好的分辨能力。     

应用免疫层析法检测食品中的沙门菌

〔目的〕建立一种简便快速的胶体金免疫层析法 (GICA)用于检测食品中的沙门菌。〔方法〕抗沙门菌多抗用抗原吸收法封闭与其他肠道杆菌的交叉反应 ,标记胶体金溶胶制成探针 ,采用多膜复合的方法制备免疫层析条。〔结果〕该层析条可检出人工染菌的畜禽肉、牛奶和米饭等食品中的沙门菌 ,灵敏度为 2 .1× 10 6cfu/ml,用常见溶液和自来水处理染菌食品样品 ,检测结果无异。〔结论〕该方法简便快速 ,无需特殊仪器设备 ,适合现场检测之用。     

O139群霍乱弧菌荧光纳米颗粒试纸条的研制

目的本研究旨在建立一种准确、快速、简便的O139群霍乱弧菌检测方法。方法以荧光纳米颗粒为标记物,采用双抗体夹心法模式制备O139群霍乱弧菌免疫层析检测试纸条。在紫外灯下观察试纸条上质控线和检测线上的荧光信号强度作为结果判定依据。结果用所制备的O139群霍乱弧菌荧光纳米颗粒检测试纸条对9属20种105株菌进行检测,所有20株O139群霍乱弧菌检测结果呈阳性,其余85株非O139群霍乱弧菌均呈阴性反应;用该试纸条检测人工污染的海鱼样品,灵敏性为3.5×104CFU/mL。用自制试纸条和标准法同时检测77份样品(均为水产品),两种方法的总符合率为85.7%。结论O139群霍乱弧菌荧光纳米颗粒检测试纸条的研制成功为O139群霍乱弧菌的快速检测提供了一个极好的检测方法,便于野外检测的开展,具有广阔的应用前景。     

利用胶体金免疫层析技术快速定量检测单增李斯特菌方法的建立

〔目的〕建立胶体金免疫层析技术快速定量检测单增李斯特菌方法。〔方法〕利用胶体金标记和双抗体夹心免疫层析技术,建立单增李斯特菌的快速检测方法,评价其特异性和敏感性,并拟合标准曲线进行定量检测;在牛奶、橙汁、果冻等即食食品样品中添加单增李斯特菌模拟污染样品,评价该方法对半固体、液体等即食食品、可疑生物恐怖样品的检测能力。〔结果〕该法可在10min内完成定性和半定量检测,定量检测灵敏度为3.5×103cfu/ml,线性范围3.5×105～3.5×108cfu/ml,回收率在99%～101.7%之间。〔结论〕建立的检测单增李斯特菌的胶体金免疫层析方法,能快速、灵敏、特异、准确地对样品中的单增李斯特菌进行定性、定量检测。     

2006年鸭绿江水及水产品中检出霍乱弧菌报告

〔目的〕通过对鸭绿江水及水产品中O1群和O139群霍乱弧菌检测,了解霍乱弧菌在其中的存活及菌型分布情况,为制定防治措施提供依据。〔方法〕采集鸭绿江水及水产品进行霍乱弧菌分离培养,血清学诊断符合O1群和O139群霍乱弧菌者,按国标法进行系统菌株鉴定。〔结果〕从216份(江水189份、水产品27份)标本中检出9株O1群霍乱弧菌,全部为江水中检出,总检出率为4.17%。其中稻叶型2株,占22.2%;小川型7株,占77.8%。〔结论〕检出的9株O1群霍乱弧菌均属非流行株,江水中霍乱弧菌的检出率高于水产品的检出率。总检出率较高,提示在今后霍乱监测中,鸭绿江水应继续作为重点。     

O1群霍乱弧菌胶体金法快速检测

目的 了解胶体金法检测O1群霍乱弧菌的特异性、灵敏度和实用性.方法 取患者粪便标本,先用碱性蛋白胨水35℃增菌6 h,然后用胶体金法进行检测,同时作霍乱弧菌常规培养,培养出细菌后用血清凝集法作为鉴别诊断O1群霍乱弧菌的金标准,用统计学方法对胶体金法诊断试验的评价指标进行计算..结果 700份样本中,常规法培养出O1霍乱弧菌105株,胶体金法试验阳性108株,经χ2检验,差异无统计学意义(χ2=0.24,P>0.05),表明胶体金法检测O1群霍乱弧菌与常规培养法检测结果之间的差异无统计学意义.胶体金法检测O1群霍乱弧菌诊塑试验的灵敏度为93.33%,特异性为98.32%,阳性预测值为90.74%,阴性预测值为97.18%,假阴性率为1.68%,假阳性率为6.67%.结论 胶体金法检测O1群霍乱弧菌特异性高(98.32%),灵敏度好,与常规培养法的一致性也较高,在快速检测O1群霍乱弧菌中有一定应用价值.     

水产品中致病性弧菌PCR快速检测研究

〔目的〕建立一种快速、准确、特异的方法,快速检测和鉴定出食品中的非致病性和致病性霍乱弧菌与副溶血性弧菌。〔方法〕针对霍乱弧菌的种特异性基因ompW、毒力基因tcpA、ctxA和副溶血性弧菌的种特异性基因tl、毒力基因tdh设计引物,建立PCR检测体系。〔结果〕检测结果显示,该方法能够特异性检出副溶血性弧菌或霍乱弧菌,并进一步确定其是否携带tdht、cpA或ctxA毒力基因,检测的灵敏度可达到5×101cfu/ml菌浓度。〔结论〕与传统方法比较,该方法快速、特异、灵敏,能在较短时间内对大量水产品样品进行检测。     

一种快速筛查金黄色葡萄球菌的荧光纳米免疫层析方法的建立

目的建立一种快速筛查金黄色葡萄球菌的荧光纳米免疫层析检测方法。方法以荧光纳米颗粒作为示踪标记物,采用双抗体夹心法检测金黄色葡萄球菌A蛋白,制备了稀土离子标记的免疫层析试纸条,在紫外激发光源下判断反应结果。对该方法的特异性、敏感性和样本检测的适用性进行了分析。结果所制备的试纸条具有良好的特异性,与表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门菌、志贺菌、大肠杆菌、O1/O139群霍乱弧菌、副溶血性弧菌均无交叉反应。用该试纸条检测纯菌液和未经培养的粪便、呕吐物的灵敏度为7.2×104CFU/ml,检测经培养的模拟污染食物样本、粪便样本的检测限最低为7.2×102CFU/ml,反应在15 min内完成。结论本研究成功建立了金黄色葡萄球菌的荧光纳米免疫层析检测方法,能够快速检测食品、奶制品、呕吐物、粪便中的金黄色葡萄球菌,具有良好的特异性和灵敏性,便于开展现场快速检测。     

应用胶体金免疫层析法检测水产品中霍乱弧菌的研究

〔目的〕应用胶体金免疫层析法,研究水产品中霍乱弧菌的快速检测方法。〔方法〕通过模拟水产品棉拭子标本比对试验及现场应用比对试验,比较不同检验方法的差异。〔结果〕70份增菌液中霍乱弧菌理论浓度为1.5×10CFU/ml的模拟水产品棉拭子标本分别按检验方法1、检验方法2检验,同时检出阳性51份,检验方法2的检出率(87%)显著高于检验方法1的检出率(74%);30份增菌液中霍乱弧菌理论浓度为1.5×101CFU/ml的“模拟水产品棉拭子标本”按检验方法2进行检验的检测结果均为阳性。对2000份水产品进行检测的现场应用对照实验结果显示:检验方法3的检出率(0.4%)与检验方法1的检出率(0.3%)差异无显著性;胶体金试纸条实验的假阳性率为8%。〔结论〕在胶体金免疫层析法实验中,增菌液增菌前霍乱弧菌含量为1CFU/ml,通过增菌后可被检出;增菌液霍乱弧菌含量为10CFU/ml,增菌12h后均可被检出;水产品棉拭子标本增菌12h检测阴性者可报告阴性,阳性者则参照《霍乱防治手册》[1]进一步分离鉴定。鱼贝类霍乱弧菌污染菌数较少(103CFU/100g以下)[2],无法满足使用胶体金免疫层析法所要求的含菌量(106CFU/ml)[3],可以通过改良增菌培养液成分,以提高待检菌繁殖能力,在短时间内提高增菌液待检菌浓度,使胶体金免疫层析法的灵敏性高于或接近常规的分离鉴定法。     

进口废旧物品携带微生物状况初步研究

目的调查进口废旧物品携带微生物状况。方法按集装箱采样,用试纸片法对样本微生物进行细菌总数、大肠杆菌、沙门氏菌计数,用致病菌增菌检测试剂盒、免疫层析检测片、胶体金快速检测试剂盒和全自动微生物分析系统进行致病菌检测。结果检测93份样本,金黄色葡萄球菌阳性率为61.29%,沙门菌阳性率为33.33%,腊样芽胞杆菌阳性率为72.04%,副溶血弧菌58.06%,致泻大肠埃希菌29.03%。检出铜绿假单胞菌、杀鲑气单胞菌、温和气单胞菌、溶血葡萄球菌、土拉热弗朗西菌、肺炎链球菌、麻疹孪生球菌、志贺菌、粘质沙雷菌、阴沟肠杆菌、红斑丹毒丝菌等致病菌、条件致病菌及非致病菌。在93份样本中均未检测出出血性大肠杆菌O157:H7,霍乱弧菌O139二种致病菌。结论进口废旧物品中致病微生物的检出率较高,对从业人员的身体健康和环境危害的评价,有待深入研究。     

实时荧光PCR法、胶体金法和培养法检测甲鱼中霍乱弧菌

目的优化水产品甲鱼中霍乱弧菌的检测程序,提高甲鱼中霍乱弧菌检出率。方法用实时荧光PCR、常规细菌培养、胶体金法同时对甲鱼中霍乱弧菌进行检测,并用实时荧光PCR法检测标本中霍乱弧菌ctx基因。结果共检测185份甲鱼样品,其中实时荧光PCR法检出28份霍乱弧菌核酸阳性,阳性率为15.14%;6份ctx基因核酸阳性,阳性率21.43%(6/28)。常规细菌培养法分离出2株菌株,一株为O139群霍乱弧菌,一株为小川型霍乱弧菌,用实时荧光PCR检测这两株纯培养菌株或原始标本,霍乱弧菌ctx基因均为阴性;胶体金法未检出阳性标本。结论对于水产品标本,可先用实时荧光PCR法筛检霍乱弧菌,阳性标本再进行传统细菌分离培养,以提高霍乱弧菌菌株的检出率;同时阳性标本进行霍乱弧菌ctx基因核酸检测,如也为阳性,需提高警惕,加强流行病学上的预防控制措施,及时防范霍乱疫情的发生。     

多重荧光定量PCR甄别霍乱弧菌方法的建立

目的 利用多重荧光定量PCR技术,建立一种快速、准确、特异甄别霍乱弧菌的定量方法.方法 分别根据霍乱弧菌霍乱毒素A亚单位基因(ctxA)和糖基转移酶基因(LPSgt)作为检测的靶基因,设计引物和TaqMan-MGB探针,探针的5'端分别用FAM和VIC进行荧光标记,3'端标记MGB.优化PCR扩增体系,对多重实时荧光定量PCR方法的特异性、灵敏度、重复性评价,同时进行一定数量临床样本考核鉴定,与常规方法进行比较.结果 该方法可准确、特异地鉴定霍乱弧菌,同时能够甄别O139群霍乱弧菌.全部的霍乱弧菌用ctxA基因对应引物和探针检测均为阳性,其中只有O139群霍乱弧菌出现LPSgt基因阳性,其他菌株均无阳性结果.检测的灵敏度为2×102 cfu/ml.同时对收集的45例临床样本进行鉴定,结果显示10例为霍乱弧菌,其中O139群有4例,其余均为阴性结果,与常规鉴定方法一致.结论 研究建立的多重荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,可有效鉴定产毒霍乱弧菌及甄别O139群霍乱弧菌,可用于霍乱监测和防制工作中的实验室诊断.     

贝氏柯克斯体重组抗原P1表达纯化及胶体金免疫层析方法的建立

目的制备贝氏柯克斯体的重组外膜蛋白P1,并建立一种快速检测贝氏柯克斯体抗体的胶体金免疫层析方法。方法利用贝氏柯克斯体主要的表面蛋白P1的良好免疫原性和免疫反应性,对已构建的表达P1抗原的重组工程菌,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达P1重组蛋白,通过蛋白纯化、复性、浓缩等过程获得目的蛋白。纯化的P1重组抗原包被硝酸纤维素膜,胶体金标记SPA,建立检测贝氏柯克斯体抗体的免疫层析方法,评价该方法的特异性、灵敏性、稳定性及应用性。结果纯化后获得分子质量(Mr)为52000的目的蛋白,纯度为94%。建立了快速检测贝氏柯克斯体特异性抗体的方法,对阳性参照样本检测,目测灵敏度可达1∶105,采用金标仪半定量检测灵敏度可达116ng/ml;对94份鼠血清和90份健康人血清检测,无阳性检出;对布鲁氏菌、普氏立克次体、军团菌、土拉弗朗西斯菌等传播途径和临床特征相似的病原抗体进行检测,未发生交叉反应。结论利用重组抗原建立的贝氏柯克斯体抗体胶体金免疫层析方法具有较好的敏感性和特异性,可用于传染病快速筛查。     

鼠疫菌免疫胶体金快速检测方法的建立

目的利用免疫胶体金技术建立一种简便、快速并适用于基层人员使用的鼠疫菌抗原检测方法。方法将抗鼠疫菌F1抗原的抗体致敏硝酸纤维素膜,用于捕获鼠疫抗原,然后用免疫胶体金颗粒进行标记。结果应用鼠疫菌免疫胶体金快速检测法最低可检出不同鼠疫菌(EV和Evp株)1.56×105CFU/ml,检测鼠疫菌F1抗原最低可检出1ng/ml,与鼠疫反向间接血凝法的检测结果一致;并且不与假结核小肠结肠炎等耶尔森菌以及其他相关细菌发生交叉反应。结论鼠疫菌免疫胶体金快速检测法具有较好的特异性、敏感性和简便快速的特点。     

1984-2002年重庆市59株O_1群霍乱临床分离株耐药性及分子分型研究

目的分析重庆市1984-2002年O1群霍乱临床分离株的耐药性和菌株的相关性。方法对59株O1群霍乱临床分离株(小川型20株,稻叶型39株)采用K-B法检测对16种抗菌药物的敏感性,用NotI酶切基因组DNA,经脉冲场凝胶电泳(PFGE)获得电泳图谱,利用BioNumerics软件对图谱进行聚类分析。结果重庆地区O1群霍乱弧菌对复方新诺明耐药、痢特灵和链霉素的耐药严重,耐药率分别为28.81%(17/59)、61.02%(36/59)和30.51%(18/59),人群分离株对丁胺卡那、庆大霉素、妥布霉素、氨苄西林、新霉素和强力霉素敏感,未发现耐药菌株。21株小川型和40株稻叶型O1群霍乱弧菌被分为13种PFGE型18个亚型,从患者分离到的59株O1群霍乱弧菌的相似性值约在88%～100%。结论未发现重庆市O1群霍乱弧菌人群分离株的耐药性有明显改变,小川型和稻叶型的耐药性不同。重庆市O1群霍乱弧菌人群分离株同源性较高,可能为来自同一来源的流行菌株。     

水产品中霍乱弧菌的监测方法研究

目的:研究水产品中霍乱弧菌的监测方法,及时发现被霍乱弧菌污染的水产品,采取有效防控措施,防范霍乱疫情的发生。方法:用实时荧光PCR法、胶体金法、分离培养法三种方法分别对180份水产品进行霍乱弧菌检测,阳性样品再进行霍乱肠毒素检测。结果:三种方法检出了44份核酸阳性标本,18份霍乱肠毒素阳性标本,分离出8株霍乱弧菌。结论:在进行水产品霍乱监测时,可以先用实时荧光PCR进行初筛,筛出核酸阳性标本,进行霍乱肠毒素检测,及时发现被霍乱产毒株污染的水产品,再对筛出的核酸阳性标本结合胶体金法进行分离培养和分型鉴定,进一步完成霍乱疫情的确证和分析。     

双重套式PCR方法在霍乱弧菌外环境监测中的应用

目的 建立一种能够检测O1群和O139群霍乱弧菌的套式聚合酶链反应方法,并应用于外环境水体标本的监测.方法 根据GenBank发表的O1群和O139群霍乱弧菌O抗原编码基因rfb的序列,运用DNAStar Primer Select软件各自设计6条引物,检测不同引物组合的特异性,建立双重套式PCR方法同时检测O1群和O139群霍乱弧菌;并对该方法进行敏感度、特异度、重复性及现场评价.通过比较套式PCR与常规PCR的DNA检出下限分析该方法的敏感度;对32份套式PCR阳性的水体样本(O1群11份,O139群21份)进行重复性评价,挑选部分阳性扩增产物进行测序,分析其与相应基因序列的一致性.结果 建立的检测O1群和O139群霍乱弧菌的双重套式PCR体系,根据其扩增的片段大小能够区分O1群和O139群霍乱弧菌,而对其他弧菌DNA样品都未见特异性扩增;敏感度比常规PCR高15 000倍,且在多引物或者多模板共存于一个反应管的试验条件下,不会对敏感度产生干扰;32份套式PCR阳性的水样标本,经2次或3次套式PCR试验,结果显示该体系具有较好的重复性和一致性,阴性水样均无任何扩增产物,说明所用引物的特异性较好;序列分析表明扩增产物仅同霍乱弧菌相应的基因序列有100%的一致性.结论 本检测相应霍乱弧菌的双重套式PCR方法,具有灵敏、特异、快速、适合基层实验室的特点,可用于监测外环境水体中霍乱弧菌的存在及消长情况.     

胶体金试纸条与ELISA法检测HBsAg差异分析

目的:探讨胶体金试免疫层析试验(GICA)与酶联免疫吸附试验(ELISA)检测HBsAg临床应用价值。方法:分别用胶体金试纸条与ELISA法检测250份标本中的HBsAg,并对阳性率进行比较,然后将强阳性的10份标本做倍比稀释,观察两种检测方法灵敏度的差异。结果:两种方法的阳性率之间差异无显著性,ELISA法灵敏度较胶体金试纸条灵敏度高。结论:两种方法皆是检测HBsAg的良好方法,胶体金试纸条法操作简便、快速,适用于急诊及健康人群的筛查,ELISA法适用于常规检测。