胰岛素样生长因子-1基因转染脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的研究

目的 观察胰岛素样生长因子(IGF)-1基因转染的脂肪间充质干细胞(ADSCs)向软骨细胞分化的效果.方法 原代培养兔ADSCs,免疫荧光法检测细胞表面抗原CD44、CIM9;脂质体介导人IGF-1基因转染兔ADSCs联合低浓度血清培养基向软骨细胞分化诱导,RT-PCR及Western blot方法检测IGF-1的表达,MMT法绘制细胞增殖曲线、甲苯胺蓝染色软骨结节、免疫组织化学检测Ⅱ型胶原的表达.结果 脂肪间充质干细胞CD44、CD109表达阳性,基因转染后细胞IGF-1表达阳性,细胞增殖速度增快,出现软骨结节,Ⅱ型胶原表达增高.结论 从脂肪组织中能够分离出增殖旺盛的ADSCs,IGF-1在ADSCs内获得稳定表达,细胞增殖能力增强,促进其向软骨细胞分化.     

组织工程脂肪研究的新思路及其他

1 关于脂肪组织工程研究 构建近似正常脂肪组织特性的组织工程脂肪,是我们10年来的研究方向.先后选用骨髓间充质干细胞(MSC)、脂肪来源干细胞为种子细胞,以聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、胶原为支架材料构建组织工程脂肪.目前在种子细胞与支架材料筛选方面获得一些新线索,并由此开展了相应研究.     

质粒修饰BMSC联合纳米支架促进软骨缺损修复的相关研究

目的探究慢病毒介导聚蛋白多糖(Aggrecan)过表达质粒转染骨髓间充质干细胞联合Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架向软骨细胞转化及软骨缺损修复的作用效果。方法构建慢病毒聚蛋白多糖过表达载体,培养骨髓间充质干细胞,构建兔模型软骨缺损模型,实验组造模后植入Gelatin/PLGA三维支架+转染聚蛋白多糖过表达载体骨髓间充质干细胞复合物;阴性对照组造模后植入Gelatin/PLGA三维支架+未转染骨髓间充质干细胞复合物;模型组造模后加入生理盐水处理。体外实验利用HE染色和免疫组织化学染色检测骨髓间充质干细胞联合Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架的联合培养体系向软骨细胞转化中聚蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白的表达。构建兔膝关节软骨缺损模型,HE染色和免疫组织化学分析复合支架材料对软骨缺损的修复效果。结果 a)实验组(Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架+转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物)中支架表面黏附的细胞与对照组(Gelatin/PLGA纳米纤维多孔支架+未转染骨髓间充质干细胞)相比,细胞数明显增多;b)动物模型大体观察结果显示,实验组的修复效果要明显优于阴性对照组;c)动物模型HE染色结果显示,阴性对照组多为纤维性修复,而实验组多为细胞性修复;d)免疫组织化学染色结果显示,实验组修复软骨组织中Aggrecan和Ⅱ型胶原含量要明显优于阴性对照组。结论 Gelatin/PLGA三维支架加转染Aggrecan过表达载体骨髓间充质干细胞复合物可以促进BMSC向软骨细胞的分化,并且分泌更多的含Aggrecan和Ⅱ型胶原成分的细胞外基质,从而发挥其促进软骨缺损修复的作用。     

转化生长因子-β1基因修饰对骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的影响

目的观察骨髓间充质干细胞经转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor,TGF-β1)基因修饰后增殖能力和向软骨细胞分化能力的变化。方法利用脂质体将pcDNA3-TGF-β1基因导入骨髓间充质干细胞,通过大体形态观察、CCK-8测定转染前后骨髓间充质干细胞的增殖代谢能力,同时RT-PCR和Westernblot法检测软骨特异性细胞外基质蛋白Ⅱ型胶原的表达。结果基因修饰后骨髓间充质干细胞倍增能力明显增强,并且Ⅱ型胶原蛋白表达增加。结论经TGF-β1基因修饰的MSCs向软骨细胞分化能力增强,是优秀的软骨组织工程种子细胞。     

残耳软骨细胞与脂肪干细胞共培养体内构建软骨的实验研究

目的验证残耳软骨细胞与脂肪来源的间充质干细胞(Adipose derived stem cells,ADSCs)共培养,体内构建软骨的可行性。方法分离培养同一先天性小耳畸形患者来源的残耳细胞及脂肪干细胞。24只裸鼠随机分为4组:①实验组,接种残耳软骨细胞及脂肪干细胞,两种细胞以1∶1比例混合,细胞浓度为5.0×107 cells/mL;②对照组1,接种单纯残耳软骨细胞,细胞浓度为5.0×107 cells/mL;③对照组2,接种单纯ADSCs,细胞浓度为5.0×107 cells/mL;④对照组3,接种单纯残耳软骨细胞,细胞浓度为2.5×107 cells/mL。每组接种6只裸鼠,每只接种0.2 mL。体内培养10周后取材。通过对新生组织的大体观察、测量湿重、糖胺多糖含量测定、组织学及免疫组化染色等方法对各组新生软骨进行比较。结果实验组、对照组1与对照组3产生不同组织量的软骨样组织,对照组2形成纤维样组织;实验组平均湿重及糖胺多糖含量达到对照组1的88%以上,对照组3平均湿重低于对照组1的40%;HE染色示实验组、对照组1与对照组3的标本均有软骨陷窝形成,对照组2未见软骨陷窝形成;Ⅱ型胶原免疫组化染色示实验组、对照组1与对照组3均可见Ⅱ型胶原表达;对照组2未见Ⅱ型胶原表达。结论体内共培养条件下,残耳软骨微环境可有效促进脂肪干细胞向软骨方向分化,残耳软骨细胞与脂肪干细胞共培养体内构建软骨具备可行性。     

hIGF-1基因改良修饰人脐血间充质细胞的研究

目的研究hIGF-1基因改良修饰人脐血间充质干细胞的方法,为关节软骨组织工程修复提供良好的种子细胞。 方法综合应用密度梯度离心法和细胞贴壁法分离培养人脐血间充质干细胞,流式细胞仪进行细胞鉴定。通过X-tremen HP介导将含hIGF-1基因全长的真核表达载体pIRES2-EGFP-hIGF-I转染人脐血间充质干细胞,倒置荧光显微镜检测转染后荧光蛋白的表达,计算转染效率,ELISA检测转染后细胞上清液中hIGF-1的含量变化,免疫荧光与RT-PCR检测hIGF-1在细胞中的表达,免疫组化检测Ⅱ型胶原表达。 结果人脐血间充质干细胞表面表达CD105（99.93%）、CD90（99.85%）、CD146（73.63%）,不表达Anti-HLA-DR（1.38%）、CD45（0.13%）、CD34（0.11%）。hIGF-1基因可在X-tremen HP介导下转染人脐血间充质干细胞,48 h转染效率为（29±8）%。转染后48 h分泌的hIGF-1最多,为（34.89±0.38）ng/ml,且与对照组相比,差异具有统计学意义（P<0.01）。转染后细胞可检测到hIGF-1 mRNA、蛋白以及Ⅱ型胶原表达。 结论hIGF-1基因可通过X-tremen HP介导改良修饰人脐血间充质干细胞,促进hIGF-1和Ⅱ型胶原的表达与分泌。     

肌腱组织工程和基因转染

骨髓源间充质干细胞是肌腱组织工程最为常用的种子细胞.脂肪源干细胞具备相似的多分化潜能,有望成为肌腱组织工程的种子细胞. 纳米纤维材料可以模拟细胞外基质的结构和功能,作为肌腱组织工程的支架有明显的优越性.基因转染技术可克服外源性细胞因子在肌腱修复处作用短暂的不足.肌腱组织工程及基因转染的前景令人鼓舞,但仍面临诸多挑战,需进一步研究.     

应用自体脂肪干细胞修复猪关节软骨缺损的初步实验研究

目的 探索自体脂肪干细胞修复猪关节软骨缺损的可行性.方法 从猪背部脂肪组织中获取脂肪干细胞,经过体外培养扩增,以50×106/ml的浓度将脂肪干细胞接种于PLGA(polylacticacid/polyglycolicacid,PLA/PGA,PLGA)中,细胞材料复合物在体外成软骨诱导2周.于猪膝关节软骨非负重区形成2个直径8mm的环形、全层软骨缺损,实验组回植经诱导后的细胞材料复合物,对照组放置单纯支架材料.术后12周取材,缺损修复区行大体观察、组织学HE及藏红花染色、免疫组化检测.结果 术后12周实验组缺损区大部分被修复,缺损被软骨组织填充,修复区表面光滑.组织学染色显示有典型的透明软骨样结构.藏红花染色发现修复组织表达丰富的聚合蛋白多糖.对照组则未能修复关节软骨缺损,缺损区面积增大,表面覆盖薄层纤维组织.结论 猪自体脂肪干细胞可以作为组织工程种子细胞,修复猪关节软骨缺损.     

人脂肪组织来源干细胞植入裸鼠的成脂效应

目的 探讨脂肪抽吸术液态部分获取的人脂肪组织来源干细胞(adipose tissue-derivedstem cells,ADSC)植入裸鼠的成脂效应.方法 自人体脂肪抽吸术中液体部分分离、培养和鉴定ADSC,行成脂、骨和软骨分化.植入物分三组:空支架(第1组),人ADSC接种胶原海绵(第2组),经成脂诱导的ADSC接种胶原海绵架(第3组),植入裸鼠皮下.在2和8周时,通过组织观察、HE染色和油红O染色来分析新生组织.结果 抽脂术液态部分能获取大量的ADSC,能分化成脂肪、成骨和软骨细胞.8周时,第1组植入物已降解,第2组和第3组均有脂肪组织形成,但第2组比第3组在形成体积上小、成脂效应差.结论 从脂肪抽吸术液态部分分离和培养的ADSC和胶原支架混合培养能在体内形成脂肪组织,此方法 获得的ADSC多能干细胞可作为脂肪组织工程的种子细胞.     

重组腺相关病毒介导转化生长因子-β1基因修饰ADSCs成软骨细胞的研究

我们通过应用重组腺相关病毒介导转化生长因子-β1(TGF-β1)基因转染脂肪间充质干细胞,观察转染基因的表达及软骨细胞基质糖胺聚糖和Ⅱ型胶原合成.     

脂肪间充质干细胞的基本生物学特性及向成骨细胞诱导分化的实验研究

目的　研究脂肪间充质干细胞的基本生物学特性以及在特定培养条件下向成骨细胞分化 ,探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性。方法　取 3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫 ,消化法获得脂肪间充质干细胞 ,分别用脂肪诱导培养基和成骨诱导培养基诱导其向脂肪细胞与成骨细胞分化 ,组织化学染色、免疫细胞化学染色和Westernblot检测细胞分化的情况。结果　从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪间充质干细胞 ,原代脂肪间充质干细胞能自发分化为脂肪细胞 ,传代细胞在胰岛素和呋塞米的作用下生成脂滴 ,过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR)γ表达增强 ,向脂肪细胞分化 ;在呋塞米、抗坏血酸、β 甘油磷酸钠的诱导下 ,脂肪间充质干细胞的碱性磷酸酶(ALP)活性检测显示诱导组与对照组差异有显著性 (P <0 .0 1) ,vonKossa染色出现钙结节 ,骨桥蛋白 (OPN)、骨形态发生蛋白 (BMP) 2免疫细胞化学染色阳性 ,Westernblot检测到诱导后细胞OPN、BMP2的表达。结论　从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的间充质干细胞 ,经诱导后可分化为脂肪细胞和成骨细胞 ,有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一     

脂肪间充质干细胞的成骨诱导分化

目的　研究脂肪间充质干细胞 (MSCs)在特定培养条件下向成骨细胞分化 ,探讨其作为骨组织工程的种子细胞的可行性。方法　取 3周龄Lewis大鼠的腹股沟脂肪垫 ,消化法获得脂肪MSCs,用成骨诱导培养基诱导其向成骨细胞分化 ,组织化学染色、免疫细胞化学染色和Westernblotting检测细胞分化的情况。结果　从成体大鼠脂肪组织中培养出脂肪MSCs,能大量稳定增殖传代。在地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠的诱导下 ,脂肪MSCs的ALP活性增高 ,VonKossa染色出现钙结节 ,OPN、BMP - 2免疫细胞化学染色阳性 ,Westernblotting检测到诱导后细胞OPN、BMP - 2的表达 ,且随诱导时间延长表达增强。结论　从脂肪组织中可获得具有多分化潜能的MSCs,并能在体外稳定增殖传代 ,经诱导后可分化为脂肪细胞和成骨细胞 ,有可能成为骨组织工程较理想的种子细胞之一     

髌下脂肪垫来源间充质干细胞软骨分化的研究进展

间充质干细胞(MSCs)为重点的组织工程学研究已成为软骨损伤修复与再生的研究热点,髌下脂肪垫(IPFP)是脂肪间充质干细胞(ASCs)的新型优良组织来源,其取材方便,供区损伤小。且IPFP-ASCs体外增殖快,成软骨分化能力较强。低氧,转化生长因子β1、β3,骨形态发生蛋白7等可以促进其分化。体内试验表明其可以有效改善软骨损伤患者症状,提高关节功能。虽然目前仍存在生物学和技术上的困难需克服,但IPFP-ASCs有望成为修复包括骨关节炎在内的关节软骨损伤的良好策略。     

组织工程骨-软骨复合组织种子细胞的获取与培养

目的:探索体外培养组织工程骨-软骨复合组织种子细胞的条件,并观察其部分生物学活性。方法:采用机械-酶消化法对3周龄新西兰大白兔耳软骨和关节软骨消化来获得软骨细胞,采用全骨髓贴壁法来获得骨髓间充质干细胞,对两种细胞进行原代和传代培养,通过倒置相差显微镜观察细胞形态、绘制生长曲线、免疫组化染色等对细胞进行生物学特性分析。结果:原代培养的软骨细胞以多角形或三角形为主,传代3次以后出现去分化。形态学和免疫组化显示细胞3代以内可以保持表型稳定,具有较强的增殖及分泌细胞外基质的能力,而且耳软骨及关节软骨细胞在实验中没有表现出明显的生物学差别。采用贴壁筛选法获得的BMSCs呈长梭形或多边形,生长曲线呈"S"形,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性,细胞生长增殖能力旺盛。结论:体外分离培养的软骨细胞和骨髓间充质干细胞符合组织工程要求,能够作为骨-软骨复合组织的种子细胞。     

CS/PVA凝胶负载Ad-hTGF-β1转染的BMSCs移植修复兔关节软骨缺损

目的 探讨温敏型CS/PVA凝胶负载Ad-hTGF-β1转染的骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植修复兔关节软骨缺损的实验效果.方法 体外分离培养兔BMSCs,在Ad-hTGF-β1转染1周后,用细胞免疫化学方法检测hTGF-β1在细胞内的表达.用24只成年新西兰大白兔制造关节软骨缺损模型,双侧后肢均用于实验,动物模型随机分为4组,各组动物6只.A组:凝胶复合转染BMSCs修复组;B组:凝胶复合未转染BMSCs修复组;C组:凝胶修复组;D组:空白对照组.在术后16周时处死动物取材,通过大体标本和组织学染色观察评价各组修复效果,按照改良Pinoda法评分,对各组修复效果进行统计学分析.结果 免疫组化证实体外培养的BMSCs在Ad-hTGF-β1转染后表达hTGF-β1蛋白,阳性率为85.4%.术后16周取材见凝胶复合转染细胞组关节软骨缺损部位为软骨样组织填充,组织学观察见再生的软骨组织细胞排列及细胞密度与正常软骨相似,Ⅱ型胶原免疫组化阳性,Pineda评分同其它各组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 CS/PVA凝胶作为一种温敏型可注射支架材料,其负载hTGF-β1转染的BMSCs移植可用于兔关节软骨缺损修复.

Abstract：

Objective To investigate the experiment effects of rabbit joint articular cartilage defects repaired by thermosensitive CS/PVA composite hydrogel engineered hTGF-β1 transfected bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Bone marrow mesenchymal stem cells were isolated and cultured in vitro. The positive rate of transfection was defected by cell immunohistochemistry methods after Ad-hTGF-β1 transfected for 1 week. Twenty-four adult New Zealand white rabbits with full articular cartilage defects were randomly divided into 4 groups, each group had 6 animals, both hind limbs were used in the experiment. Group A: hydrogel combined with transfected cells; Group B: hydrogel combined with untransfected cells; Group C: hydrogel group; Group D: blank control group. Specimens and histological observation were used to evaluate the repair effect after 16 weeks according to Pineda's score. Results The positive rate of hTGF-β1 expression in BMSCs was about 85.4% after transfection. After 16 weeks the defects of group A were repaired by cartilage-like tissue, the cell arrangement and densities of regenerated cartilage were similar to normal cartilage, type Ⅱ collagen immunohistochemistry were positive. There was a significant difference in Pineda's score compaired with other groups (P ＜ 0.05). Conclusion Rabbit articiular cartilage defects could be repaired by CS/PVA hydrogel engineered hTGF-β1-transfected bone marrow mesenchymal stem cells.     

A novel injectable scaffold for cartilage tissue engineering using adipose‐derived adult stem cells

Articular cartilage has a limited self‐regenerative capacity. Thus, treatment of cartilage lesions is a major challenge. Tissue engineering using a variety of biomaterials is a promising solution to the problem of cartilage damage. In this in vitro study, we investigated the effect of the presence of cartilage‐tissue chondroitin‐sulfate (CS) in a fibrin scaffold on the differentiation of adipose‐derived adult stem cells (ADAS cells) into chondrocytes. Isolated rabbit ADAS cells were cultured in fibrin matrices with and without CS for up to 14 days. ADAS cells differentiated into chondrocytes in both matrices, but cell proliferation, glycoaminoglycans content, and type II collagen expression were significantly higher in the fibrin–CS matrices than those in the fibrin matrices alone. Histological examination and scanning electronic microscopy revealed the fibrin–CS matrices exceeded in inducing differentiation of ADAS cells into chondrocytes in terms of tissue morphological characteristics. We concluded that the fibrin–CS matrices mimicking native cartilage extracellular matrix could act as a three‐dimensional scaffold for cartilage tissue engineering and have the potential for promoting ADAS cells differentiation into chondrocytes. © 2007 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 26:27–33, 2008     

骨髓间质干细胞体外定向诱导分化为软骨细胞的实验研究

目的：探讨分离骨髓间充质干细胞（MSCs）并诱导其向软骨细胞转化的体外培养方法,为软骨组织工程的种子细胞来源提供实验依据。方法：抽取兔髂骨骨髓液,经梯度离心法和贴壁法进行体外培养,贴壁细胞传代,取第3代细胞在培养基中添加软骨分化诱导剂[含转化生长因子（TGF-β2）10ng／ml、地塞米松10^7mol／L、维生素C50μmol／L,经7、14、21d诱导培养后,倒置显微镜观察细胞形态,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。将诱导细胞与软骨支架材料-聚磷酸钙纤维／左旋聚乳酸（CPP／PLLA）复合,1周后终止培养,扫描电镜观察细胞黏附情况。结果：诱导后细胞体外扩增能力显著降低,细胞形态由成纤维样梭形向多角形、多边形或类圆形转变,诱导21d后细胞形态变化最为显著,Ⅱ型胶原免疫组化染色深而均匀。诱导后的MSCs可在支架材料内良好黏附生长。结论：体外培养的MSCs可定向诱导分化为软骨细胞,分泌软骨细胞特异性基质,可用作软骨组织工程的种子细胞。     

Chemotaxis of human articular chondrocytes and mesenchymal stem cells

Migration of chondrocytes and mesenchymal stem cells (MSCs) may be important in cartilage development, tissue response to injury, and in tissue engineering. This study analyzed growth factors and cytokines for their ability to induce migration of human articular chondrocytes and bone marrow‐derived mesenchymal stem cells in Boyden chamber assays.In human articular chondrocytes serum induced dose‐ and time‐dependent increases in cell migration. Among a series of growth factors and cytokines tested only PDGF induced a significant increase in cell migration. The PDGF isoforms AB and BB were more potent than AA. There was an aging‐related decline in the ability of chondrocytes to migrate in response to serum and PDGF. Human bone marrow MSC showed significant chemotaxis responses to several factors, including FBS, PDGF, VEGF, IGF‐1, IL‐8, BMP‐4, and BMP‐7. In summary, these results demonstrate that directed cell migration is inducible in human articular chondrocytes and MSC. PDGF is the most potent factor analyzed, and may be useful to promote tissue integration during cartilage repair or tissue engineering. © 2008 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 26:1407–1412, 2008     

Stem cells in burn eschar

This study compares mesenchymal cells isolated from excised burn wound eschar with adipose-derived stem cells (ASCs) and dermal fibroblasts in their ability to conform to the requirements for multipotent mesenchymal stem cells (MSCs). A population of multipotent stem cells in burn eschar could be an interesting resource for tissue engineering approaches to heal burn wounds. Cells from burn eschar, dermis, and adipose tissue were assessed for relevant CD marker profiles using flow cytometry and for their trilineage differentiation ability in adipogenic, osteogenic, and chondrogenic conditions. Although the different cell types did not differ significantly in their CD marker expression, the eschar-derived cells and ASCs readily differentiated into adipocytes, osteoblasts, and chondrocytes, while dermal fibroblasts only exhibited some chondrogenic potential. We conclude that the eschar-derived mesenchymal cells represent a population of multipotent stem cells. The origin of the cells from burn eschar remains unclear, but it is likely they represent a population of adult stem cells mobilized from other parts of the body in response to the burn injury. Their resemblance to ASCs could also be cause for speculation that in deep burns the subcutaneous adipose tissue might be an important stem cell source for the healing wound.