细胞核抗原Sm B′的基因克隆和原核表达

目的为建立抗Sm自身抗体检测方法,自行克隆、表达和鉴定细胞核抗原Sm B′。方法应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,从HL-60细胞株中克隆Sm B′全长基因,将PCR产物直接进行TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEx-5T载体中,转入大肠杆菌BL-21,阳性克隆鉴定后在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达,产物行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(western blot)鉴定。结果PCR产物约为700 bp,与预期657 bp接近,测序结果与GenBank核酸数据库报道完全一致。pGEX-5T-Sm B′重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和western blot结果显示融合蛋白分子量为51 000,具有与抗Sm B′抗体的反应性。结论成功克隆表达核抗原Sm B′,为建立抗Sm自身抗体检测方法奠定了基础。     

自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶的基因克隆和原核表达研究

目的研究建立用克隆、表达和鉴定人自身抗原组氨酰转移核糖核酸合成酶（HARS，亦称Jo-1抗原）检测多发性肌炎／皮肌炎（PM／DM）自身免疫抗体的方法。方法用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）从HL-60细胞株中克隆人自身抗原Jo-1全长基因，将PCR产物直接进行TA克隆、鉴定及测序，再定向克隆至pGEX-5T载体中，并转入大肠杆菌BL-21；阳性克隆鉴定后在异丙基．β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达，然后对其产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（IBT）检测。结果PCR产物约1500bp，与预期1526bp接近，测序结果与基因库核酸完全一致。pGEX-5T-Jo-1重组阳性克隆酶切鉴定正确，SDS-PAGE和IBT结果显示，融合蛋白分子量75000，具有天然人自身抗原Jo-1的免疫原性。结论成功克隆表达人自身抗原Jo-1，为建立PM／DM自身免疫抗体检测方法奠定了基础。     

人自身抗原Sm B′的基因克隆和原核表达

目的克隆并表达人自身抗原Sm B′。方法应用RT-PCR技术,从HL-60细胞株中克隆人自身抗原Sm B′全长基因,将PCR产物直接TA克隆、鉴定及测序,再定向克隆至pGEX-ST载体中,转入大肠杆菌BL-21。阳性克隆鉴定后在IPTG诱导下表达,产物行SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。结果PCR产物约为0.7kb,与预期657 bp接近,测序结果与GenBank报道的完全一致。pGEX-5T—Sm B′重组阳性克隆酶切鉴定正确,SDS-PAGE和Western blot结果显示融合蛋白分子量为53KD,具有天然人自身抗原Sm B′的免疫原性。结论成功克隆表达人自身抗原Sm B′,为下一步工作奠定了基础     

小鼠Bax的基因克隆及其原核表达

目的 克隆小鼠Bax基因全长编码区,并原核表达小鼠Bax基因全长序列,为从转录水平探讨Bax基因与肿瘤的关系奠定基础.方法 取小鼠骨髓细胞,采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从细胞中获得Bax基因,构建重组表达质粒pet28a/Bax;酶切鉴定挑选阳性重组质粒转化大肠埃希菌ROS,测序鉴定后经IPTG 25 ℃诱导6 h,SDS-PAGE电泳判断以包涵体形式存在的带有His标签的融合蛋白,Western blot鉴定.结果 扩增获得的Bax基因CDS区全长579 bp,编码192个氨基酸残基,与GenBank中发表的序列完全一致.成功构建了原核表达载体pet28a/Bax,并在工程菌ROS中获得大量表达.结论 获得了小鼠Bax基因,并成功原核表达和制备出小鼠Bax融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础,并为寻找多种肿瘤性疾病的有效治疗途径提供新思路.     

人自身抗原Sm B'基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达

目的 通过基因克隆在巴斯德毕赤酵母中表达人自身抗原Sm B'.方法 PCR扩增Sm B'基因,与酵母表达载体pPIC9k重组,构建表达质粒pPIC9k-Sm B'.用电穿孔法转化酵母菌Sm D1168,在MD平板上筛选重组克隆,用G418快速筛选高拷贝转化子,阳性克隆经甲醇诱导表达后,培养上清液用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(WB)鉴定,并用免疫酶斑点法和免疫印迹法(immunoblot,IBT)检测与评价分析30例系统性红斑狼疮(SLE)患者、30例混合结缔组织病患者和30名健康体检者血清中抗-Sm B'水平差异.结果 PCR产物约700 bp,与预期657 bp接近,pPIC9k-Sm B'重组阳性克隆测序结果与核酸数据库报道完全一致,双酶切鉴定正确,表达产物Sm B'的相对分子质量约32 000,WB法证实表达产物具有天然Sm B'分子的免疫原性,阴性对照菌未见目的 表达条带.免疫酶斑点法检测阳性率为46.7%(42/90),IBT的检测阳性率为51.1%(46/90);2种方法检测结果一致性较佳(Kappa值=0.911 2,P<0.01).结论 Sm B'在巴斯德毕赤酵母中分泌表达成功,这为Sm B'试剂盒研究奠定了基础.     

国人胰岛细胞自身抗原ICA69原核表达型质粒的构建

目的：应用基因工程技术生产适用于I型糖尿病早期诊断的试剂盒打下基础。方法：从中国人胰岛细胞瘤组织总RNA中,经逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）克隆了胰岛细胞自身抗原69KD蛋白（ICA69）基因的cDNA,双脱氧末端终止法对其全部核苷酸序列予以确定后,将此编码483个氨基酸、全长1449bp的cDNA重组入表达型质粒中。结果：核苷酸序列分析证实重组质粒接口处读码框架正确。结论：为ICA69重组基因的表达及表达产物在临床诊断中的应用奠定了基础。     

PTEN基因和增殖细胞核抗原在原发胶质瘤中的表达及意义

目的 检测基因PTEN和增殖细胞核抗原（PCNA）表达产物可为临床上提供分子水平的间接客观指标,二者联合检测有可能成为预测胶质瘤术后复发的重要参考依据。方法应用免疫组化S—P法检测40例原发胶质瘤中抑癌基因PTEN,增殖细胞核抗原PCNA的表达。结果HEN阳性染色颗粒在40例人脑胶质瘤标本中有29例（65．00％）呈阳性表达,并且随着病理级别升高表达强度减弱;PCNA阳性染色颗粒在40例人脑胶质瘤标本中有17例（40．00％）呈阳性表达,并且随着病理级别升高表达强度增强;PTEN与PCNA在原发胶质瘤中的表达存在负相关关系（P〈0．01）。结论PTEN与PCNA均在胶质瘤发生发展中起重要作用,对判断病理分级及生物学行为有一定意义。     

组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原的原核表达及初步临床应用

目的 通过克隆人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,构建重组表达质粒,获得具有免疫活性的纯化重组蛋白,建立间接ELISA法,并探讨其在检测多发性肌炎/皮肌炎(PM/DM)中的抗Jo-1抗体的价值.方法 构建重组表达载体,在大肠杆菌DH5 α和BL21(DE3)中表达;融合蛋白经Ni-NTA树脂柱进行亲和层析纯化,并通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(WB)进行免疫活性鉴定;应用表达蛋白建立间接ELISA法.同时用该方法检测30名正常献血者,30例SLE,30例类风湿关节炎(RA),10例原发性干燥综合征(SS),75例PM/DM患者血清中抗Jo-1抗体.结果 经重组质粒测序和酶切结果证实,Jo-1目的基因已正确插入原核表达载体中,基因序列正确,符合表达框架;经SDS-PAGE检测显示,表达产物在相对分子质量55 000处有一明显的蛋白表达条带;WB分析表明,重组蛋白具有人Jo-1抗原反应性;间接ELISA法检测标本血清结果显示,PM/DM组中抗Jo-1抗体的阳性率为28%,非PM/DM组(疾病对照组及正常对照组)均为阴性,其差异均有统计学意义(x2=31.84,均P＜0.01).结论 成功克隆了人组氨酰转移核糖核酸合成酶自身抗原Jo-1基因,其可在大肠杆菌中表达,且重组自身抗原具有较好的抗原性和特异性.应用纯化融合蛋白建立的间接ELISA法检测PM/DM抗Jo-1抗体具有较好的特异性.     

增殖性细胞核抗原和小肠发育的关系

背景:胚胎小肠发育机制是胚胎发育和小肠移植等领域研究的热点。目的:综述细胞增殖在小肠发育过程中的相应作用机制及与临床肠道疾病的关系。方法:应用计算机检索1989-01/2011-08维普、万方数据库相关文章,检索词为小肠,增殖性细胞核抗原,并限定文章语言种类为中文。同时计算机检索1989-01/2011-08PubMed和Springer外文电子期刊及电子图书(全文)数据库相关文章,检索词为smallintestin,PCNA,并限定文章语言种类为English。共检索到文献300篇,最终纳入符合标准的文献21篇。结果与结论:随着生物技术的革新,对增殖性细胞核抗原在胚胎小肠组织器官发育及疾病方面的研究不断深入,逐步阐明了增殖性细胞核抗原与小肠发育及疾病的关系。胚胎发育阶段也是小肠发育的关键时期,在小肠发育过程中,细胞的增殖和凋亡处于一种动态平衡,此平衡体系受到一系列基因的精确调控,增殖性细胞核抗原的表达活性能反映细胞的增殖活性。     

重组人内皮抑素基因克隆及其质粒抑瘤活性的鉴定

目的：利用大肠杆菌表达系统表达重组人内皮抑素，并将其作用于小鼠宫颈癌动物模型，检测其效果。方法：采用RT－PCR方法从人胚肝中提取人内皮抑素cDNA，将其克隆入pGEM-T Easy克隆载体中；经全自动序列分析仪测序确证后，将人内皮抑素cDNA亚克隆入原真核表达载体PQE－30，构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒；将该重组质粒注射入小鼠宫颈癌模型。结果：成功获得551bp人内皮抑素基因，测序证实序列正确。构建含人内皮抑素cDNA的重组质粒，此质粒能有效抑制肿瘤生长。结论：人内皮抑素具有抗肿瘤生长作用，为采用抗血管生成方法治疗恶性实体肿瘤的研究奠定了基础。     

骨肉瘤细胞热休克蛋白70基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的从人的骨肉瘤细胞中钓取热休克蛋白70(HSP70)基因并在大肠杆菌中表达出热休克蛋白,为进行热休克蛋白的功能试验提供抗原。方法热休克人骨肉瘤细胞后,采用One-Step,RT-PCR方法从人骨肉瘤细胞中钓取HSP70基因,DNA测序正确的HSP70基因和表达载体pET28a连接后,构建成功了重组表达质粒pET28a-HSP70,并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导蛋白表达后,进行SDS-PAGE及Westernblot鉴定。结果人骨肉瘤细胞HSP70基因的PCR产物约为1.9 kb,DNA序列测定结果证实,所获目的序列与文献报道的基本一致,仅有两个碱基的差异。构建的重组表达质粒pET28a-HSP70,能够在大肠杆菌中表达。结论从人骨肉瘤细胞中成功地钓取了HSP70基因并在大肠杆菌中表达出HSP70蛋白,为研究人骨肉瘤细胞HSP70的结构、功能与临床应用奠定了基础。     

SSA/Ro60自身抗原的基因克隆与表达纯化

目的克隆人SSA/Ro60自身抗原并表达纯化,为辅助诊断自身免疫提供物质基础。方法采用RT-PCR技术扩增SSA/Ro60基因,定向插入pPICZ表达载体,转入毕赤酵母表达系统,将获得的重组蛋白行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。结果扩增出约1.5kb的SSA/Ro60全长序列,获得相对分子质量60×10~3的重组蛋白,经鉴定具有SSA/Ro60抗原性。结论成功克隆并表达SSA/Ro60,为诊断自身免疫疾病奠定基础。     

TRAIL分子胞外区基因工程蛋白的制备与鉴定

目的 制备人TRAIL配体胞外区基因工程蛋白。方法 应用RT-PCR技术从激活的人外周血淋巴细胞总RNA中扩增TRAIL配体胞外区cDNA，克隆入PCR^21载体，测序验证后用基因重组法构建了TRAIL配体胞外区和组氨酸盒的原核表达质粒pQE-hTRAIL。将重组质粒转人大肠杆菌M15中表达，经1mmol／L IPTG在37℃条件下诱导4h，亲和层析柱纯化。用SDS—PAGE电泳和Western blot鉴定表达产物。结果 所表达融合蛋白为人TRAIL配体胞外区分子，分子量30kD。表达量约为2mg／ml。结论 人TRAIL配体胞外区在大肠杆菌中得到良好表达，为深入研究TRAIL配体分子在肿瘤与自身免疫病中的可能应用提供了材料。     

弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 体外扩增弓形虫RH株膜表面抗原SAG1编码基因，构建原核表达质粒，并表达SAG1编码基因序列。方法 收集、纯化RH株速殖子，提取RNA，据已知的SAG1基因序列，在设计合成的1对引物中引入EcoRI和HindⅢ酶切位点。应用RT—PCR技术，扩增SAG1基因片段，插入原核表达质粒pET28a中，转化大肠杆菌BL21感受态细胞，重组子经EcoRI和HindⅢ双酶切、PCR鉴定，转化宿主菌BL21，并以IPTG诱导表达。结果 从弓形虫RH株RNA中扩增出1011bp的SAG1基因片段，构建重组质粒pET28a／SAG1，酶切和PCR鉴定产物大小均与预期值相符；IPTG诱导，SDS—PAGE显示表达产物的大小约34．8kD．结论 成功地从弓形虫RH株RNA中获取SAG1基因，构建了pET28a／SAG1重组质粒并获得了高效表达，为免疫学诊断和蛋白质疫苗的研究创造了条件。     

增殖细胞核抗原在口腔复发性阿弗他溃疡的表达及意义

目的 :观察增殖细胞核抗原 (PCNA)在口腔复发性阿弗他溃疡组织 (RAU)中表达强度及分布情况。方法 :用免疫组织化学技术检测 PCNA在 RAU中的表达变化规律。结果 :RAU的组织中有大量炎性细胞浸润。 PCNA在正常口腔黏膜的阳性表达主要出现在基底细胞层 ,在 RAU组织中表达定位没有改变 ,表达量明显减少 (P<0 .0 5 )。结论 :RAU中的上皮细胞增殖受到抑制 ,这可能与 RAU的发病机制有着密切的联系。     

α-SEA型地中海贫血标志蛋白zeta链蛋白的克隆表达与鉴定

目的克隆zeta链蛋白基因并在大肠杆菌中表达,经纯化与鉴定,为建立α-SEA型地中海贫血的免疫学筛查方法提供特异性抗原。方法从经处理的K562细胞中提取总RNA,采用RT-PCR技术反转录并将其克隆到pET-21a( )载体中,测序验证。融合蛋白在大肠杆菌中表达,采用Probond树脂柱纯化融合蛋白,用WesternBlotting和ELISA鉴定。结果成功构建了融合表达载体pET-zeta,融合蛋白得到可溶性表达及纯化,经Westernblotting和商品ELISA试剂盒鉴定显示重组蛋白为zeta链蛋白。结论克隆表达并获得了纯化zeta链蛋白,为地中海贫血的免疫筛选方法的建立提供了抗原。     

喉癌的MRI形态学表现与其增殖细胞核抗原表达的相关性

目的探讨喉癌的MRI形态学特征与其增殖细胞核抗原表达的相关性.方法对41例喉癌患者术前行磁共振SE序列平扫,其中20例加行增强扫描.术后标本用ABC免疫组化技术进行PCNA半定量测量.结果①前组声门上型喉癌更易侵犯会厌软骨和室带(P＜0.05);后组更易侵犯杓状软骨和后联合(P＜0.05).声带和杓会厌皱襞受累提示癌组织PCNA标记指数＞75%的可能性大(P＜0.05).②声门型喉癌前联合受累组的PCNA标记指数高于未受累组(P＜0.05).③甲状软骨侵犯阳性组及颈淋巴结转移阳性的PCNA标记指数均高于阴性组(P＜0.05).结论喉癌的某些MRI形态学表现可以在一定程度上推测PCNA标记指数,了解其增殖活性.